去氧鬼臼毒素抑制肺癌NCI-H358細胞增殖和體外遷移的研究

陳振華，丘新才 ，林淑芳，甘振勇

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去氧鬼臼毒素抑制肺癌NCI-H358細胞增殖和體外遷移的研究

陳振華，丘新才 ，林淑芳，甘振勇

目的探討去氧鬼臼毒素對人肺癌NCI-H358細胞增殖和體外遷移的影響，并初步探討其作用機制。方法應用CCK-8法、流式細胞術、細胞劃痕實驗和DCFH-D法分別檢測去氧鬼臼毒素對NCI-H358細胞增殖、周期分布、凋亡、體外遷移能力和細胞內活性氧（ROS）的影響，并通過Western blot檢測去氧鬼臼毒素對細胞周期蛋白（Cyclin）B1、細胞分裂周期蛋白25同源蛋白（Cdc25c）、細胞周期蛋白依賴性激酶（CDK）1、半胱氨酸天冬氨酸蛋白酶（Caspase）-3、p53腫瘤蛋白、B淋巴細胞瘤（Bcl）-2和基質金屬蛋白酶（MMP）9的表達水平，以及細胞外信號調節激酶（ERK）1/2、p38分裂原激活蛋白激酶（MAPK）和c-Jun氨基末端激酶（JNK）的磷酸化水平的影響。結果去氧鬼臼毒素能明顯抑制肺癌NCI-H358細胞的生長，流式細胞結果顯示其能誘導細胞停滯在G2/M和S期，誘導細胞凋亡和細胞ROS產生，同時細胞體外遷移能力也明顯下調。Western blot結果顯示，去氧鬼臼毒素能使Cyclin B1、Cdc25c、CDK1、Bcl-2和MMP9的蛋白表達明顯下調，而Caspase-3和p53的表達明顯上調，且ERK1/2、p38MAPK和JNK的磷酸化水平明顯受到抑制。結論去氧鬼臼毒素可抑制肺癌NCI-H358細胞的增殖和體外遷移，是一種潛在的抗腫瘤藥物。

鬼臼毒素；肺腫瘤；細胞增殖；細胞運動；去氧鬼臼毒素

肺癌是最常見的惡性腫瘤之一，其發病率有逐年增加的趨勢。目前，肺癌總的5年生存率僅為10%～13%［1］。如何改善肺癌的治療效果、提高肺癌患者的總生存率是亟待解決的向題。由于化療藥的不良反應，許多患者往往無法耐受而放棄化療，這嚴重影響其生活質量。因此尋求低毒、高效的天然植物成分成為近幾年來抗腫瘤研究的重要熱點。

去氧鬼臼毒素（deoxypodophyllotoxin，DPPT）是從中藥桃兒七Sinopodophyllum emodi（wall）、八角蓮和歐洲刺柏Juniperus communis等植物中分離得到的活性成分［2］。研究表明，DPPT具有較強的抗白血病［3］、抗腫瘤［4］、抗病毒［5］活性，是一種潛在的抗癌新藥，但其作用機制尚不清楚。本研究通過觀察DPPT對人肺癌NCI-H358細胞增殖、周期分布、凋亡以及遷移的影響，探討其對肺癌的作用機制，為臨床研究提供實驗基礎。

1材料與方法

1.1藥品與試劑DPPT購自上海源葉生物科技有限公司；NCI-H358細胞購自中國科學院上海生命科學研究院生物化學與細胞生物學研究所；RPMI 1640培養基、胎牛血清、Trizol 和0.25%胰酶均購自美國Life Technologies公司；cDNA反轉錄試劑盒購自Fermentas公司；熒光定量SYBR Premix Ex Taq試劑盒購自大連寶生物有限公司；活性氧（ROS）檢測試劑盒、青霉素和鏈霉素均購自江蘇海門碧云天生物技術研究所。CCK-8檢測試劑盒、Western blot的細胞周期蛋白（Cyclin）B1、細胞分裂周期蛋白25同源蛋白（Cdc25c）、細胞周期蛋白依賴性激酶（CDK）1、半胱氨酸天冬氨酸蛋白酶（Caspase）-3、p53腫瘤蛋白、B淋巴細胞瘤（Bcl）-2和基質金屬蛋白酶（MMP）9、細胞外信號調節激酶（ERK）1/2、p38分裂原激活蛋白激酶（MAPK）和c-Jun氨基末端激酶（JNK）等一抗和辣根過氧化酶標記的山羊抗兔二抗均購自美國Santa Cruz公司。

1.2主要儀器培養箱購自美國Thermro公司；96孔板購自美國Corning公司；ELX800UV酶標儀購自美國Bio-Tek公司；FACScanTM流式細胞儀購自美國BD Biosciences公司；7500 PCR儀購自美國ABI公司；凝膠成像系統購自美國Bio-Rad公司；酶標儀購自美國Molecular Devices公司。

1.3細胞培養及實驗分組NCI-H358細胞用含10%胎牛血清、100 U/mL青霉素和100 mg/L鏈霉素的RPMI 1640培養液，于37℃、5%CO2飽和濕度下常規傳代培養。實驗分為對照組（0 μmol/L DPPT）、3 μmol/L DPPT組和6 μmol/L DPPT組。

1.4 CCK-8檢測細胞增殖取對數生長期NCI-H358細胞，以2×103個/mL接種到96孔微孔板中，每孔100 μL，培養過夜使細胞貼壁。使用不同濃度的DPPT（0、0.5、1、2、4、6、8、10、15 μmol/L）分別處理細胞24 h和48 h，每組設置4個復孔。按照試劑盒說明書每孔加入10 μL CCK-8試劑，繼續培養2 h。最后用酶標儀測定450 nm波長下的光密度（OD）值。以處理組OD值/對照組OD值×100%作為生存率。

1.5流式細胞術檢測細胞周期和凋亡率取對數生長期NCI-H358細胞，以2×105個/mL接種于6孔板中，0、3、6 μmol/L DPPT處理48 h后，用0.25%胰酶消化，2 000 r/min離心5 min，收集細胞，PBS洗2次，1 000 r/min離心10 min后棄上清液，500 μL 70%乙醇4℃固定過夜。加入RNA酶消化，使用碘化丙啶（PI）避光染色30 min，FACScanTM流式細胞儀進行細胞周期分析，重復實驗3次。細胞凋亡采用PI/ Annexin V-FITC雙染法，將細胞重懸于200 μL Binding Buffer中，加入10 μL Annexin V-FITC，室溫避光孵育15 min，使用FACScanTM流式細胞儀檢測細胞凋亡率。

1.6 DCFH-DA法檢測細胞ROS含量NCI-H358細胞培養在6孔板中，經3 μmol/L和6 μmol/L DPPT作用48 h后，PBS洗滌2次，每孔加入經無血清RPMI 1640培養基稀釋的終濃度為10 μmol/L的DCFH-DA，37℃避光孵育20 min，用無血清RPMI 1640培養液洗滌細胞3次，流式細胞儀在激發波長488 nm、發射波長525 nm下檢測細胞平均熒光強度，分析細胞內ROS含量。

1.7細胞劃痕實驗檢測細胞遷移情況NCI-H358細胞接種于6孔板中直至形成單層融合，待細胞融合達95%以上，用200 μL吸頭在細胞層中劃痕，PBS洗2次，加入0、3和6 μmol/L DPPT放置于培養箱中繼續培養24 h，取0 h和24 h兩時間點在倒置顯微鏡下觀察并拍照，統計劃痕的間隙距離。遷移率（%）=1-［間隙距離（24 h）/間隙距離（0 h）］×100%。1.8 Western blot檢測腫瘤相關蛋白的表達NCI-H358細胞以5×103個/mL密度接種于6孔板，0、3和6 μmol/L DPPT作用48 h后收集各組細胞，用RIPA裂解液進行裂解，加入40 μg蛋白樣品，經10%SDS-PAGE電泳后轉移至PVDF膜（150 mA，1 h），5%脫脂牛奶封閉1 h后，各目標分子特異性一抗4℃過夜。洗去一抗，以HRP連接的二抗溫育1 h，洗滌，以ECL試劑盒顯示免疫反應條帶。β-actin作內參，檢測各組細胞中Cyclin B1、Cdc25c、CDK1、Caspase-3、p53、Bcl-2、MMP9的表達水平，以及ERK1/2、p38 MAPK和JNK的磷酸化水平。

1.9統計學方法所得數據用SPSS 13.0統計軟件分析，計量資料以均數±標準差（x ±s）表示，多組間比較采用ANOVA分析，組間多重比較用LSD-t法。以P＜0.05表示差異有統計學意義。

2　結果

2.1 DPPT抑制NCI- H358細胞的增殖NCIH358細胞經DPPT處理，細胞活性呈濃度依賴性抑制，同一濃度下DPPT處理48 h的細胞生存率低于24 h，見圖1。DPPT處理24 h和48 h的半數抑制濃度（IC50）分別為（7.62±0.57）μmol/L和（3.77±0.23）μmol/L（t=14.011，P＜0.01）。后續實驗均以DPPT處理48 h為準。2.2 DPPT對NCI-H358細胞周期分布的影響與對照組相比，DPPT處理后G2/M和S期NCI-H358細胞的比例顯著升高，而G0/G1期的細胞比例明顯減少，見表1、圖2。

Fig. 1 The effects of different concentrations of DPPT on the cell proliferation of NCI-H358 cells圖1　DPPT不同濃度和處理時間對NCI-H358細胞增殖的影響

Tab. 1 The effects of DPPT on the cell cycle of NCI-H358 cells表1　DPPT對NCI-H358細胞周期分布的影響

Fig. 2 The effects of DPPT on the cell cycle of NCI-H358 cells 圖2　DPPT對NCI-H358細胞周期的影響

2.3 DPPT誘導NCI-H358細胞凋亡3、6 μmol/L DPPT作用48 h后，NCI-H358細胞凋亡率［（43.32± 2.77）%、（56.26±3.18）%］均高于對照組［（10.15± 0.96）%，n=3，F=192.513，P＜0.01］，見圖3，提示DPPT可誘導NCI-H358細胞凋亡。

Fig. 3 The effects of DPPT on the apoptosis of NCI-H358 cells圖3　DPPT對NCI-H358細胞凋亡的影響

2.4 DPPT促進NCI-H358細胞內ROS形成經3、6 μmol/L DPPT處理NCI-H358細胞48 h后，胞內的ROS濃度明顯增加［（39.22±1.81）%、（62.53± 2.07）%］，均高于對照組［（9.31±0.72）%，n=3，F= 242.347，P＜0.01］。

2.5 DPPT抑制NCI-H358細胞的體外遷移3、6 μmol/L DPPT處理48 h后，NCI-H358細胞的體外遷移明顯受到抑制，其細胞遷移率均低于對照組［（37.55±0.31）%、（23.49±0.21）%vs.（56.32±0.52）%，n=3，F=169.126，P＜0.01］，見圖4。

Fig. 4 The effects of DPPT on the migration of NCI-H358 cells圖4　DPPT對NCI-H358細胞體外遷移能力的影響

2.6 DPPT抑制Cyclin B1、Cdc25c和CDK1蛋白的表達3、6 μmol/L DPPT處理后，NCI-H358細胞中Cyclin B1、Cdc25c和CDK1的蛋白表達水平均較對照組明顯下調，見圖5。

Fig. 5 The effects of DPPT on the expressions of Cyclin B1，Cdc25c and CDK1 of NCI-H358 cells圖5　DPPT對Cyclin B1、Cdc25c和CDK1蛋白表達的影響

2.7 DPPT對Caspase-3、p53、Bcl-2和MMP9蛋白表達的影響經3、6 μmol/L DPPT作用48 h后，NCI-H358細胞中Caspase-3和p53蛋白表達較對照組顯著上升，而Bcl-2和MMP9蛋白的表達顯著下調，見圖6。

Fig. 6 The effects of DPPT on the expressions of Caspase-3，p53，Bcl-2 and MMP9 of NCI-H358 cells圖6　DPPT對Caspase-3、p53、Bcl-2和MMP9蛋白表達的影響

2.8 DPPT抑制ERK1/2/MAPK信號通路3、6 μmol/L DPPT能明顯降低ERK1/2、p38MAPK和JNK的磷酸化水平，而對ERK1/2、p38MAPK和JNK的作用不明顯，見圖7，提示DPPT可抑制ERK1/2/ MAPK信號通路的活化。

3　討論

3.1 DPPT可以抑制肺癌NCI-H358細胞體外增殖DPPT是從天然植物中提取的活性小分子化合物，由于其具有消炎、抗病毒、抗血小板聚集和抗過敏等功效而受到人們的關注。近年文獻報道，DPPT具有誘導腫瘤細胞凋亡、抗氧化作用等活性［6］。本研究顯示，DPPT能明顯抑制肺癌NCI-H358細胞增殖，且其抑制作用呈濃度依賴性增加。研究還發現，DPPT具有阻滯細胞周期和誘導細胞凋亡的作用，并抑制NCI-H358細胞的體外遷移。

Fig. 7 The effect of DPPT on the ERK1/2/MAPK signal pathway of NCI-H358 cells圖7　DPPT對ERK1/2/MAPK信號通路的影響

3.2 DPPT可阻滯肺癌NCI-H358細胞周期Cyclin B1是第一個被發現的細胞周期蛋白，其異常表達與腫瘤發生、發展以及預后相關。Cyclin B1的轉錄調控在細胞周期，特別是有絲分裂中起重要作用，其參與細胞周期檢測點調控，維持基因組的穩定［7］。CDK1是蛋白激酶家族的重要一員，通過與Cyclin形成復合物磷酸化一系列的目標底物，從而導致細胞周期循環的產生［8］。Cdc25c是重要的細胞周期調控蛋白，作為M期的誘導物，在控制細胞周期進入M期和G2期檢驗點具有重要作用［9］。本研究顯示，NCI-H358細胞經DPPT處理后，細胞內Cyclin B1、Cdc25c和CDK1的表達明顯受抑制，因此DPPT抑制肺癌細胞的增殖可能與抑制Cyclin B1、Cdc25c和CDK1的表達相關。

3.3 DPPT可誘導肺癌NCI-H358細胞凋亡Bcl-2蛋白質家族是控制線粒體致凋亡因子釋放的主要調節因子，Bcl-2基因是Bcl-2家族的重要成員，也是迄今研究得最深入、最廣泛的凋亡調控基因之一［10］。研究表明，p53是重要的抑癌基因［11］，在細胞周期捕獲、DNA修復、細胞衰老、分化、凋亡等過程中均起著重要的作用，其能修復損傷細胞或除去嚴重損傷的細胞，從而避免這些細胞對機體的危害。Caspase是近年來發現的一組存在于胞質溶膠中的結構上相關的半胱氨酸蛋白酶，其中Caspase-3是細胞凋亡過程中最主要的終末剪切酶，也是細胞毒性T淋巴細胞殺傷機制的重要組成部分，主要通過干擾DNA修復過程參與細胞凋亡［12］。本研究中Western blot結果顯示，DPPT作用NCI-H358細胞后，Caspase-3 和p53的表達明顯上調，而Bcl-2表達明顯下調。研究表明，ROS參與腫瘤的發生、發展過程，少量的ROS可以誘發腫瘤的產生，而過量的ROS反而會對細胞內的脂類、蛋白質和DNA造成氧化損傷［13］。ROS可作為第二信使通過上調促凋亡蛋白Caspase等的表達而參與凋亡調控。本研究顯示，DPPT可上調細胞內ROS水平。MMP9是MMPs中的重要成員之一，在高浸潤性肺癌細胞中大量表達，與肺癌的生長、浸潤及轉移關系最密切［14］。本研究還發現，MMP9的表達水平在DPPT處理后明顯下調。因此，DPPT誘導細胞凋亡和抑制NCI-H358細胞體外遷移與Caspase-3、p53、Bcl-2和MMP9的表達調控有關。

3.4 DPPT可抑制肺癌NCI-H358細胞ERK1/2/ MAPK信號通路ERK1/2信號通路是最早發現的Ras/Raf/MAPK經典的MAPK信號轉導途徑，參與細胞增殖、分化、凋亡以及細胞遷移調控過程。p38MAPK可通過增強c-myc表達、激活c-Jun和c-fos、誘導bax轉位等途徑，參與細胞凋亡的調控。而活化的JNK能通過激活內源性通路，使Bcl-2參與促凋亡分子的釋放（如細胞色素C），從而導致Caspase的激活和細胞凋亡［15］。本研究發現，DPPT可下調NCI-H358細胞中ERK1/2、p38MAPK和JNK的磷酸化水平。因此，DPPT抑制細胞增殖和體外遷移與抑制其上游ERK1/2/MAPK信號通路有關。

在今后的研究中，本課題組將進一步驗證DPPT對其他肺癌細胞系的抑制作用，并考察其對正常上皮細胞的毒性，探討其對腫瘤細胞和正常細胞毒性的差別，為臨床應用提供理論依據和實驗基礎。

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（2016-02-15收稿2016-03-23修回）

（本文編輯李鵬）

Research on mechanisms of deoxypodophyllotoxin-induced inhibition of cell proliferation and migration in human lung cancer NCI-H358 cells

CHEN Zhenhua，QIU Xincai ，LIN Shufang，GAN Zhenyong
Department of Respirology，The Nanhai Hospital Affiliated to Southern Medical University，Foshan 528200，China Corresponding Author E-mail：xincq6512@126.com

Objective To investigate the effects and mechanism of deoxypodophyllotoxin on cell proliferation and migration of human lung cancer NCI-H358 cells in vitro. Methods CCK-8 assay，flow cytometry assay，wound healing assay and DCFH-DA assay were used to detect the effects of deoxypodophyllotoxin on the proliferation，cells cycle，apoptosis，migration and reactive oxygen species（ROS）. The protein expressions of Cyclin B1，Cdc25c，CDK1，Caspase-3，p53，Bcl-2，MMP9，ERK1/2，p38MAPK and JNK were measured by Western blot assay，respectively. Results Deoxypodophyllotoxin inhibited cell proliferation and reduced migration in human lung cancer NCI-H358 cells. Flow cytometry analysis showed that treatment with deoxypodophyllotoxin resulted in cell cycle G2/M and S phase arrest，cell apoptosis and ROS production. The result of Western blot assay showed that protein expressions of Cyclin B1，Cdc25c，CDK1，Bcl-2 and MMP9 were downregulated while Caspase-3 and p53 were up-regulated. Moreover，Deoxypodophyllotoxin treatment decreased the phosphorylated levels of ERK1/2，p38MAPK and JNK obviously. Conclusion Deoxypodophyllotoxin could suppress the proliferation and migration of human lungcancer NCI-H358 cells in vitro，which is apotential anti-tumor drug.

podophyllotoxin；lungneoplasms；cell proliferation；cell movement；deoxypodophyllotoxin

R734.2，R349.5

A

10.11958/20160058

廣東省佛山市南海區人民醫院呼吸科（郵編528200）

陳振華（1971），男，本科學歷，副主任醫師，主要從事慢性阻塞性肺疾病研究

E-mail：xincq6512@126.com