JNK在氫氣改善重度膿毒癥小鼠腸屏障功能障礙中的作用

張紅濤，于洋，劉玲玲，于泳浩，王國林

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實驗研究

JNK在氫氣改善重度膿毒癥小鼠腸屏障功能障礙中的作用

張紅濤1，2，于洋1，劉玲玲2，于泳浩1，王國林1

目的探討c-Jun氨基末端蛋白激酶（JNK）在氫氣改善重度膿毒癥小鼠腸屏障功能障礙中的作用。方法將80只雄性ICR小鼠按照隨機數字表法分為假手術組、氫氣對照組、膿毒癥組和氫氣治療組，每組20只。采用盲腸結扎穿孔術（CLP）制備重度膿毒癥小鼠模型，假手術組和氫氣對照組只進行開腹手術而不行盲腸結扎和穿孔。氫氣對照組和氫氣治療組于制模后1 h和6 h分別吸入2%的氫氣1 h。于制模后20 h時各組取10只，向胃內灌注異硫氰酸熒光素標記的右旋糖酐（FITC-右旋糖酐），4 h后經心臟穿刺取血并測定血清FITC-右旋糖酐水平。于制模后24 h各組取10只，取腹腔液進行細菌培養并計數菌落形成單位（CFU）；取中段小腸組織，采用酶聯免疫吸附試驗測定腸組織腫瘤壞死因子（TNF）-α、白細胞介素（IL）-1β和高遷移率族蛋白1（HMGB1）水平，采用蛋白免疫印跡法測定腸組織JNK的磷酸化水平（p-JNK）以及緊密連接蛋白ZO-1和Occludin的表達，利用光學顯微鏡和透射電鏡分別觀察腸組織病理學改變和腸上皮細胞超微結構的變化。結果假手術組和氫氣對照組各指標差異均無統計學意義。與假手術組比較，膿毒癥組血清FITC-右旋糖酐、腹腔液細菌培養菌CFU和小腸組織TNF-α、IL-1β和HMGB1明顯增加，小腸組織p-JNK表達明顯增加并伴隨ZO-1和Occludin表達下調（均P＜0.05），小腸組織明顯損傷伴腸上皮細胞超微結構嚴重受損。與膿毒癥組比較，氫氣治療組制模后24 h時血清FITC-右旋糖酐、腹腔液細菌培養CFU和小腸組織TNF-α、IL-1β和HMGB1明顯降低，小腸組織p-JNK表達下調并伴隨ZO-1和Occludin表達增加（均P＜0.05），小腸組織損傷和腸上皮細胞超微結構受損明顯減輕。結論氫氣可以通過抑制JNK通路降低小腸組織炎癥因子的水平并增加緊密連接蛋白的表達，從而改善重度膿毒癥引起的腸屏障功能障礙。

膿毒癥；氫；JNK絲裂原活化蛋白激酶類；腸黏膜；腫瘤壞死因子α；白細胞介素1β；高遷移率族蛋白質類；緊密連接蛋白

1材料與方法

1.1實驗動物與分組本研究已獲天津醫科大學實驗動物管理委員會批準。成年雄性ICR小鼠80只，體質量20～25 g，6周齡，購于軍事醫學科學院實驗動物中心，動物合格證號：SCXK（軍）-2012-0004。將小鼠置于標準條件下（室溫18～22℃，相對濕度60%～80%，自然晝夜光線照明，標準飼料喂養，自由進食水），飼養1周以適應環境后用于實驗研究。采用隨機數表法分為假手術組、氫氣對照組、膿毒癥組和氫氣治療組，每組20只。

1.2模型制備及氫氣治療參考文獻［6］的方法制備膿毒癥動物模型并行氫氣治療：采用盲腸結扎穿孔術（CLP）制備重度膿毒癥動物模型，假手術組和氫氣對照組動物只進行相同開腹手術操作，不進行盲腸結扎和穿孔；氫氣對照組和氫氣治療組于制模后1 h和6 h分別吸入2%的氫氣1 h，其他組動物置于相同條件下，不吸入氫氣。

1.3主要儀器與試劑GCH-300高純氫氣發生器（天津同普分析儀器科技有限公司）；PG610氫氣檢測儀（河南英特電氣設備公司）；F7000熒光分光光度計（日本Hitachi公司）；Multiskan酶標儀（美國Thermo公司）；異硫氰酸熒光素標記的右旋糖酐（FITC-右旋糖酐）購自Sigma公司；含5%山羊血清的大豆酪蛋白瓊脂培養基購自Becton&Dickinson公司；腫瘤壞死因子（TNF）-α和白細胞介素（IL）-1β酶聯免疫吸附試驗（ELISA）試劑盒購自北京四正柏生物科技有限公司，高遷移率族蛋白1（HMGB1）ELISA試劑盒購自北京方程生物科技有限公司；p-JNK、ZO-1和Occludin抗體購自Abcam公司；β-actin抗體購自杭州安華公司；辣根過氧化物酶標記的羊抗小鼠抗體和羊抗兔抗體購自北京中杉金橋生物有限公司。

1.4腸屏障功能檢測（1）血清FITC-右旋糖酐濃度測定。于制模后20 h時每組取10只小鼠，向胃內灌注4 ku FITC-右旋糖酐0.6 mg/g（避光操作），4 h后麻醉動物，心臟穿刺取血樣1 mL，4℃下10 000×g離心10 min，取上清。設定F7000熒光分光光度計激發光波長為480 nm，發射光波長為520 nm，繪制標準曲線并測定血清FITC-右旋糖酐的濃度。（2）腹腔液細菌培養。于制模后24 h時每組取10只小鼠并處死，無菌條件下開腹并取腹腔液0.5 mL，用無菌生理鹽水稀釋后涂于含5%山羊血清的大豆酪蛋白瓊脂培養基，37℃有氧條件下培養24 h后觀察細菌生長情況，以菌落形成單位（CFU）表示腸道菌群移位情況。

1.5小腸組織炎癥因子檢測取部分中段小腸組織稱質量、勻漿，4℃下10 000×g離心10 min，取上清液。參照試劑盒操作說明通過酶聯免疫吸附試驗（ELISA）法應用Multiskan酶標儀檢測腸組織TNF-α、IL-1β和HMGB1的濃度。

1.6蛋白質免疫印跡試驗（Western blot）測定腸組織JNK的活性以及緊密連接蛋白ZO-1和Occludin的表達取部分中段小腸組織稱質量后加入預冷的組織蛋白裂解液和蛋白酶抑制劑勻漿，4℃下14 000×g離心10 min，取上清液并進行蛋白定量（BCA法）。應用濕式電轉移法經十二烷基硫酸鈉-聚丙烯酰胺凝膠電泳（SDS-PAGE）后將蛋白轉至聚偏二氟乙烯（PVDF）膜，經5%脫脂奶粉室溫封閉后分別加入目的蛋白一抗兔多抗p-JNK（稀釋度1：1 000）、鼠單抗ZO-1（稀釋度1：1 000）、兔單抗Occludin（1：50 000）和鼠單抗β-actin（稀釋度1：1 000），4℃孵育過夜，含吐溫-20的磷酸鹽緩沖液（TBST）清洗5次，每次5 min，分別加入稀釋度1：2 000的羊抗兔二抗（p-JNK和Occludin）和羊抗鼠二抗（ZO-1和β-actin）室溫孵育1 h，TBST清洗5次，每次5 min，暗室內加顯色底物顯色曝光并掃描成像。采用Gene Tools圖像分析軟件測定目的蛋白條帶灰度值，內參照為β-actin，以目的條帶與βactin灰度值的比值反映目的蛋白的表達水平。

1.7腸組織病理觀察取部分中段小腸組織放入10%福爾馬林固定24 h，依次經過脫水、石蠟包埋及切片5 μm后，行蘇木素-伊紅（HE）染色，在光學顯微鏡下觀察腸組織病理學改變。1.8腸上皮細胞超微結構觀察取部分中段小腸組織經2.5%戊二醛固定液、1%四氧化鋨固定液固定；梯度乙醇脫水；環氧丙烷過渡，Epon812包埋；半薄切片定位后以LEICA ULTRACUT-R超薄切片機做超薄切片，厚度50 nm；醋酸鈾-檸檬酸鋁雙染色。HITACHI-7500透射電子顯微鏡觀察腸上皮細胞超微結構改變，并經Megaview數字化電鏡攝影系統攝片。1.9統計學方法采用SPSS 18.0統計軟件進行分析。計量資料以均數±標準差（x ±s）表示，組間比較采用單因素方差分析，多重比較采用LSD-t檢驗，P＜0.05為差異有統計學意義。

2　結果

2.1腸屏障功能及腸組織炎癥因子檢測結果制模后24 h血清FITC-右旋糖酐和腹腔液細菌培養CFU比較，以及腸組織TNF-α、IL-1β和HMGB1比較結果顯示，假手術組和氫氣對照組差異無統計學意義，與假手術組比較，膿毒癥組和氫氣治療組均升高，氫氣治療組明顯低于膿毒癥組（均P＜0.05），見表1。

Tab. 1 The comparison of intestinal barrier functional indexes and intestinal inflammatory factors at 24 h after sham operation or CLP between four groups表1　4組小鼠制模后24 h小腸屏障功能檢測指標和腸組織炎癥因子比較　（n=10，x ±s）

2.2 Western blot檢測結果制模后24 h，假手術組和氫氣對照組腸組織p-JNK、ZO-1和Occludin的表達比較差異無統計學意義，與假手術組比較，膿毒癥組和氫氣治療組腸組織p-JNK表達升高，ZO-1 和Occludin表達降低，氫氣治療組腸組織p-JNK表達明顯低于膿毒癥組，ZO-1和Occludin表達高于膿毒癥組（均P＜0.05），見圖1、表2。

A為假手術組，B為氫氣對照組，C為膿毒癥組，D為氫氣治療組Fig.1 The expression of intestinal p-JNK，ZO-1 and Occludin detected by Western blot assay in four groups圖1　Western blot法檢測4組小鼠腸組織p-JNK、ZO-1和Occludin的表達情況

Tab. 2 Comparison of intestinal p-JNK，ZO-1 and Occludin expression at 24 h after sham operation or CLP between four groups表2　4組小鼠制模后24 h腸組織p-JNK、ZO-1和Occludin表達的比較（n=10，%，x ±s）

2.3腸組織病理改變光鏡下觀察，假手術組和氫氣對照組腸絨毛結構正常，排列規則，無充血及斷裂現象；膿毒癥組腸絨毛排列紊亂，黏膜下及基層血管充血明顯，腸絨毛連續性斷裂；氫氣治療組腸絨毛排列尚規則，連續性完整，輕度充血伴上皮輕度抬高，出現輕度的上皮下間隙，見圖2。

Fig.2 The intestinal pathological changes observed by light microscope in four groups（HE，×400）圖2　光鏡下觀察各組小鼠腸組織病理改變（HE，×400）

2.4腸上皮細胞超微結構改變透射電鏡下觀察，假手術組和氫氣對照組小腸上皮細胞呈單層柱狀，排列整齊規則，粗面內質網發達；指狀微絨毛密集排列，相鄰細胞的側面近頂部游離緣有發育良好且完整的連接復合體。膿毒癥組小腸上皮細胞內出現膜結構損傷形成的髓磷體結構，細胞器結構模糊，粗面內質網池擴張，脫顆粒；微絨毛稀疏，變短、變粗，排列不整齊，相鄰細胞間隙增寬，深部間隙增大并充滿液體和炎癥細胞。氫氣治療組腸上皮細胞內溶酶體增多，粗面內質網變短，池輕度擴張；微絨毛輕度增粗變短，排列尚整齊，連接復合體形態接近正常，見圖3。

Fig. 3 The intestinal epithelial ultrastructure changes observed by transmission electron microscope in four groups （Uranium acetate-aluminium citrate staining，×30 000）圖3　透射電鏡下觀察各組小鼠腸上皮細胞超微結構改變（醋酸鈾-檸檬酸鋁染色，×30 000）

3　討論

常溫常壓下，氫氣的溶解度比較低且不能被機體大量吸收，因此氫氣一直被認為是一種惰性氣體，未引起醫學界的重視。2007年，Ohsawa等［7］研究發現，吸入2%的氫氣能夠選擇性清除羥自由基和過氧亞硝基陰離子，從而改善實驗動物腦缺血再灌注損傷。該研究得到廣泛關注并引發了醫學界研究氫氣的熱潮。近年研究表明，氫氣吸入治療能夠通過抗炎癥反應、抗氧化應激和抗細胞凋亡作用減輕膿毒癥動物的器官損傷并改善其預后［5，8-9］。

CLP是誘發膿毒癥動物模型的金標準和經典方法，穿孔處溢出的糞便可造成腹腔感染，同時缺血壞死的結扎段盲腸還可以釋放炎癥因子［6］。膿毒癥時，TNF-α是較早釋放的炎癥因子，可促進IL-1β和IL-6等其他炎癥因子釋放。HMGB1為近年發現的一種重要晚期炎癥介質，其不僅可以介導炎癥反應，還可以被分泌到細胞外與各種炎癥因子相互作用，在膿毒癥的發病機制中起著十分重要的作用，與膿毒癥嚴重程度和預后關系密切。炎癥因子的大量釋放，以及內毒素激活的中性粒細胞和單核/巨噬細胞浸潤并釋放大量活性氧簇，其結果將導致腸黏膜受損，腸道屏障功能障礙和通透性增加，腸道菌群移位，最終引起多器官損傷并導致膿毒癥病情進展和惡化［10］。因此，腸道既是膿毒癥發展過程中的受損器官，也是促進膿毒癥病程進展的動力器官，腸屏障功能的保護是治療膿毒癥的關鍵。

正常腸道屏障主要由腸上皮細胞間連接形成的機械屏障和腸道內菌群平衡組成的生物免疫屏障等共同構成，能夠有效阻止腸道內菌群及內毒素等有害物透過腸黏膜進入血液。腸道上皮細胞間緊密連接主要是由跨膜蛋白Occludin、Claudin和緊密連接蛋白ZO-1組成的復合體，位于細胞間連接的最頂端，組成了腸上皮下基質與腸腔間的第一道機械屏障。JNK信號轉導通路是MAPK通路的重要分支之一，參與細胞周期、凋亡和細胞應激等多種生理和病理功能。JNK主要由3個基因編碼，JNK1和JNK2基因在哺乳動物全身廣泛表達，JNK3主要在腦、心臟和睪丸組織表達。膿毒癥時炎癥因子的刺激引起JNK的磷酸化并激活JNK信號通路，其一方面可以進一步介導炎癥因子的瀑布式釋放，另一方面作為Rho激酶（ROCK）的下游靶蛋白，其可以通過對腸上皮細胞間連接蛋白的調控，引起緊密連接復合體分解，從而破壞腸屏障功能，增加腸黏膜通透性，引起炎性細胞浸潤和菌群移位，均可加重膿毒癥的病情［4］。本實驗中，氫氣治療能夠明顯抑制膿毒癥小鼠腸道上皮細胞JNK的活性，減輕腸組織的炎癥反應，上調緊密連接蛋白ZO-1和Occludin的表達，改善腸屏障功能障礙和腸組織損傷。此外，氫氣治療對氫氣對照組小鼠無明顯影響，因此推測氫氣治療不會影響機體正常的JNK信號傳導通路。

（圖2、3見插頁）

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［2］Li YM，Wang HB，Zheng JG，et al. Dimethyl sulfoxide inhibits zymosan-induced intestinal inflammation and barrier dysfunction［J］. World J Gastroenterol，2015，21（38）：10853-10865. doi：10.3748/ wjg.v21.i38.10853.

［3］Li Y，Xie KL，Chen HG，et al. The role of Nrf2 in the hydrogen treatment for intestinal injury caused by severe sepsis［J］. Chin Crit Care Med，2014，26（6）：415-419.［李媛，謝克亮，陳紅光，等. Nrf2在氫氣治療嚴重膿毒癥腸損傷中的作用［J］.中華危重病急救醫學，2014，26 （6）：415-419］. doi：10.3760/cma.j.issn.2095-4352.2014.06.010.

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［7］Ohsawa I，Ishikawa M，Takahashi K，et al. Hydrogen acts as a therapeutic antioxidant by selectively reducing cytotoxic oxygen radicals ［J］. Nat Med，2007，13（6）：688-694.

［8］Liu L，Xie K，Chen H，et al. Inhalation of hydrogen gas attenuates brain injury in mice with cecal ligation and puncture via inhibiting neuroinflammation，oxidative stress and neuronal apoptosis［J］. Brain Res，2014，1589：78-92. doi：10.1016/j.brainres.2014.09.030.

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［10］Sonnier DI，Bailey SR，Schuster RM，et al. Proinflammatory chemokines in the intestinal lumen contribute to intestinal dysfunction during endotoxemia［J］. Shock，2012，37（1）：63-69. doi：10.1097/SHK. 0b013e31823cbff1.

（2015-12-10收稿2015-12-19修回）

（本文編輯李國琪）

The role of JNK in the hydrogen treatment for intestinal barrier dysfunction in severe septic mice

ZHANG Hongtao1，2，YU Yang1，LIU Lingling2，YU Yonghao1，WANG Guolin1
1 Department of Anesthesiology，Tianjin Medical University General Hospital，Tianjin 300052，China；2 Department of Anesthesiology，Tianjin Huanhu Hospital Corresponding Author E-mail：yuyonghao@126.com

Objective To investigate the role of JNK in intestinal barrier dysfunction in severe septic mice treated by hydrogen. Methods Eighty male ICR mice were randomly divided into four groups（n=20 each）：sham operation group，hydrogen control group，sepsis group and hydrogen treatment group. Severe sepsis rat model was reproduced by cecal ligation and puncture（CLP）. Laparotomy without CLP was performed in sham operation group and hydrogen control group. The mice in hydrogen control group and hydrogen treatment group received 1-hour inhalation of 2%hydrogen at 1 hour and 6 hours after sham operation or CLP，respectively. Ten mice of each group were selected at 20 h after CLP operation and were gavaged with fluorescein- isothiocyanate- conjugated dextran（FITC- dextran）. Blood samples were obtained by cardiac puncture to measure the serum concentration of FITC-dextran 4 h after treatment with FITC-dextran . Ten mice in each group were sacrificed at 24 h after CLP operation. The colony-forming unit（CFU）numbers in the peritoneal lavage fluid were counted. The middle intestinal tissues were obtained for the measurement of tumor necrosis factor alpha（TNF-α），interleukin（IL）-1β and high mobility group box 1（HMGB1）by ELISA. The level of phosphorylated JNK（p-JNK）and the expression of tight junction protein ZO-1 and Occludin were detected by Western blot assay. The intestinal pathological changes and epithelial ultrastructure changes were observed by light microscope and transmission electron microscope（TEM）. Results There was no statistical significance in clinical variables between sham operation group and hydrogen control group. Compared with sham operation group，the serum FITC- dextran concentration，the CFU numbers in the peritoneal lavage fluid，the levels of TNF-α，IL-1β and HMGB1 in intestine，and the expression of p-JNK were significantly increased，the expression of ZO-1 and Occludin were down-regulated in sepsis group（P＜0.05）. There was a significant intestinal pathological injury along with epithelial ultrastrcture injury in sepsis group. Compared with sepsis group，the serum FITC-dextran concentration，the CFU numbers in the peritoneal lavage fluid，the levels of intestinal TNF-α，IL-1β and HMGB1，and the expression of p-JNK were significantly decreased，the expression of ZO-1 and Occludin were up-regulated in hydrogen treatment group（P＜0.05），and the pathological and ultrastructure damage was significantly reduced. Conclusion Hydrogen can decrease levels of proinflammatory factors and up-regulate the expression of tight junction to improve intestinal barrier dysfunction caused by severe sepsis，which is related with the inhibition of JNK signalingpathway.

sepsis；hydrogen；JNK mitogen-activated protein kinases；intestinal mucosa；tumor necrosis factor-alpha；interleukin-1beta；high mobility group proteins；tight junction protein膿毒癥（sepsis）是一種主要由感染因素誘發、以炎癥系統的過度激活為主要病理特征的全身炎癥反應綜合征（SIRS），是臨床常見的危重癥，其引起的多器官功能障礙綜合征（MODS）是造成危重病患者死亡的根本原因［1］。胃腸道是MODS的始動器官，腸屏障功能障礙在SIRS-sepsis-MODS連續發展中具有重要作用［2］。研究表明，膿毒癥可以造成小腸黏膜上皮細胞損傷、細胞間連接斷裂，從而引起腸屏障功能受損，腸道通透性增加，造成膿毒癥病情進展和惡化［3］。c-Jun氨基末端蛋白激酶（JNK）信號通路是絲裂原活化蛋白激酶（MAPK）通路的重要分支之一，在細胞生長、分化和凋亡等多種生理和病理過程中起重要作用。JNK信號通路參與膿毒癥中炎癥介質和上皮細胞間連接的調控，是膿毒癥發生發展中重要的信號轉導通路之一［4］。本課題組前期研究發現氫氣治療能夠減輕膿毒癥小鼠腸道損傷［5-6］，鑒于膿毒癥復雜的發病機制，氫氣對腸組織JNK信號通路的影響尚不明確。本研究擬探討JNK在氫氣改善重度膿毒癥腸屏障功能障礙中的作用。

R364.5

A

10.11958/20150388

國家自然科學基金資助項目（81372033）

1天津醫科大學總醫院麻醉科（郵編300052）；2天津市環湖醫院麻醉科

張紅濤（1983），男，博士在讀，主要從事膿毒癥器官保護方面研究

E-mail：yuyonghao@126.com