羊纖維環部分缺損動物模型的構建

袁秋明，徐寶山，楊強，劉越，姜洪豐，張楊，杜立龍，祁霽舟，趙家寧，馬信龍

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羊纖維環部分缺損動物模型的構建

袁秋明1，2，徐寶山2，楊強2，劉越2，姜洪豐2，張楊2，杜立龍2，祁霽舟1，2，趙家寧1，2，馬信龍2

目的建立可用于椎間盤缺損修復研究的纖維環部分缺損動物模型。方法使用image J 1.46r軟件測量5根羊脊柱X線片T12/L1～L6/S1椎間隙高度，軸向剖開T12/L1～L6/S1椎間盤，測量擬作缺損處纖維環厚度，使用11號尖刀在3根離體羊脊柱T12/L1～L5/6椎間盤左前方制作上底3 mm、下底5 mm、高5 mm、厚3 mm，下底朝向髓核的梯形缺損，上述羊脊柱均取自1歲齡綿羊。采用微創外側手術入路在2只1歲齡綿羊T12/L1～L5/6椎間盤左前方制作相同規格的梯形缺損。通過軸向剖開椎間盤測量梯形缺損的邊長、對切取的纖維環和少量髓核稱質量，以此評估所制作的椎間盤梯形缺損。結果綿羊腰椎間隙高度為（4.45±0.28）mm，擬作缺損處纖維環厚度為（4.08±0.50）mm，分別與擬作梯形缺損的厚度（3 mm）和高度（5 mm）差異有統計學意義（P＜0.05）；離體羊腰椎間盤梯形缺損的上底（3.03±0.09）mm、下底（5.03±0.09）mm、高度（4.97±0.10）mm和厚度（3.02±0.06）mm分別與梯形缺損預定值（上底3 mm、下底5 mm、高度5 mm和厚度3 mm）之間的差異無統計學意義（P＞0.05）；從離體和在體的羊腰椎間盤梯形缺損處取出的纖維環及髓核質量分別為（0.162±0.011）g和（0.166±0.014）g，兩者差異無統計學意義（P＞0.05）。結論通過微創外側手術入路，使用實驗中制作梯形缺損的方法可以簡單、安全、可靠地制作出符合要求、能用于椎間盤缺損修復研究的羊纖維環部分缺損的動物模型。

模型，動物；椎間盤切除術；組織工程；綿羊；纖維環缺損；椎間盤缺損

椎間盤退行性疾病發病率高，是導致運動功能障礙的主要原因［1］。尤其是腰椎間盤退變引發的椎間盤突出及其壓迫癥狀常常需要手術治療［2］。椎間盤部分切除術后留下的纖維環缺損的修復是臨床上面臨的一大難題。組織工程技術的快速發展為解決這一難題帶來了希望［3］。作為組織工程技術研究的重要載體——理想纖維環缺損動物模型的構建顯得極為重要。目前椎間盤退變動物模型的構建方法已有數十種［4-5］，但這些造模方法多是構建椎間盤退變動物模型，且大多選用小型動物（如鼠、兔），大型動物纖維環部分缺損的構建研究較少，而且所制作的纖維環部分缺損各有優缺點，形狀和尺寸均不統一，不利于組織工程技術修復纖維環部分缺損效果的比較，從而制約了纖維環缺損修復研究的發展。本實驗選用羊，以離體和在體羊脊柱椎間盤制作梯形缺損，以期構建理想纖維環部分缺損動物模型。

1材料與方法

1.1實驗材料新鮮羊脊柱（取自1歲齡，體質量約50 kg的雄性綿羊）購于天津市金發羊肉店。2只1歲齡，體質量約50 kg的雄性綿羊由天津醫院動物實驗室提供。戊巴比妥鈉、阿托品、丙泊酚、瑞芬太尼（天津醫院動物實驗室）；X線機（Kodak，美國）；“C”臂X線機（GE，美國）；刀片（上海聯輝醫療用品有限公司）；髓核鉗（天津希翼醫療器械商貿有限公司）；游標卡尺（天津市量具廠）；電子天平（北京賽多利斯科學儀器有限公司）。

1.2羊椎間隙高度和纖維環厚度的測量使用Kodak X光機對5根新鮮羊脊柱攝片（Kodak Directview System：73 kV 5.00 mAs）。通過imageJ 1.46r軟件對脊柱X線片中T12/ L1～L6/S1椎間隙前、中、后部進行測量［6］，見圖1，每部測量3次取平均數，計算前、中、后部的平均數作為相應椎間隙的高度。軸向剖開椎間盤，使用游標卡尺測量椎間盤矢狀徑和擬作缺損處纖維環的厚度，測量3次取平均數。

P：椎間隙后部；M：椎間隙中部；A：椎間隙前部Fig. 1 X-ray showingovine lumbar spine圖1　羊腰椎X線片

1.3離體組羊纖維環梯形缺損的制作用離體羊脊柱腰椎間盤制作上底3 mm、下底5 mm、高5 mm、厚3 mm，下底朝向髓核的梯形缺損，見圖2。取3根新鮮羊脊柱，可以看到羊腰椎體較長，從椎體兩端向中央逐漸凹陷，兩端椎板膨大，膨大的椎板中間凹陷處即為椎間盤，用手指很容易觸及，見圖3。離體羊脊柱以羊右側臥位的位置擺放，術者位于其后方，用11號尖刀在椎間盤左前方貼近尾側椎板處，刀面與椎板平面平行，垂直刺入5 mm，形成的切口恰好為3 mm，然后沿該切口前端，刀面與椎板平面垂直并向前方偏斜約11°刺入5 mm，形成一3 mm切口，再沿第一個切口的后端，刀面與椎板平面垂直并向后方偏斜約11°刺入5 mm，最后刀面與頭側椎板平行，垂直刺入5 mm，作一3 mm切口將兩個切口端連起來，形成一邊長為3 mm的正方形外口。髓核鉗摘除正方形外口內的纖維環直至髓核，形成一梯形缺損，測量梯形缺損的厚度，見圖3。軸向剖開梯形缺損的椎間盤，可以看到明顯的梯形結構，并對梯形的上底、下底和高進行測量，見圖4。在3根羊脊柱T12/L1～L5/6椎間盤左前方共制作18個梯形缺損，并對每個梯形缺損處取出的纖維環及髓核稱質量。

AF：纖維環；NP：髓核；defect：梯形缺損；TD：梯形缺損立體示意圖；a：上底；b：下底；c：厚；h：高Fig. 2 Schematic diagram of AFtrapezoid defect圖2　纖維環梯形缺損示意圖

：凸起的椎板； ：凹陷的椎間盤； ：中間凹陷的椎體；箭頭所示纖維環梯形缺損Fig.3 The trapezoid defect of the ovine AF圖3　離體羊纖維環梯形缺損

Fig. 4　 The trapezoid defect of the axial view of ovine AF圖4　軸位羊纖維環梯形缺損

1.4在體組羊椎間盤的暴露及梯形缺損的制作實驗方案獲天津醫院實驗動物倫理委員會批準。綿羊術前禁食24 h。腹腔注射3%戊巴比妥鈉1 mL/kg，臀部肌內注射阿托品0.05 mg/kg，動物進入較好的麻醉狀態。建立下肢淺靜脈輸液通道，推注丙泊酚3 mg/kg，氣管插管，丙泊酚20 mL/h、瑞芬太尼15 mL/h靜脈泵入。綿羊右側臥位于手術臺，以左側髂嵴上緣、最后一節肋骨下緣、右側腰椎橫突下緣為邊界剃毛備皮，消毒，鋪無菌手術單。采用微創外側手術入路［7］，根據目標節段位置，沿左側橫突邊緣前方1 cm處作一縱行切口，依次分離腹外斜肌、腹內斜肌、腹橫肌至腹膜，沿腹膜后間隙至椎體側前方，分離椎間盤附著的肌肉，可以看到椎間盤兩邊膨大，中間凹陷，手指易觸及。術中保護腹膜、腎臟、輸尿管、腹主動脈。“C”臂X線機透視定位，用11號尖刀按前述方法在羊T12/L1～L5/6椎間盤左前外側平行于椎間隙作梯形缺損（上底3 mm×下底5 mm×高5 mm×厚3 mm），見圖5。分別留存從梯形缺損處取出的纖維環和髓核，稱質量。制作完6個梯形缺損后，逐層縫合，結束手術。共完成2只綿羊纖維環梯形缺損的制作手術。術中羊出血約13 mL。待羊清醒后，拔出氣管插管。移到室內觀察1 h，生命體征穩定，四肢活動正常，無不良反應。肌內注射青霉素80 萬U，連續注射3 d。術后密切觀察切口滲血滲液、飲食、四肢活動及大小便情況，紅霉素軟膏涂抹切口預防感染。

Fig5 The trapezoid defect of the ovine AF圖5　在體羊纖維環梯形缺損

1.5統計學方法用SPSS 20.0軟件包進行統計學處理。數據以均數±標準差（）表示，樣本均數與預定值間的比較采用單樣本t檢驗，組間比較采用獨立樣本t檢驗，P＜0.05表示差異有統計學意義。

2　結果

2.1羊腰椎間盤測量結果綿羊脊柱T12/L1～L6/ S1各腰椎間隙高度和擬作缺損處纖維環厚度的測量結果，見表1。腰椎間隙高度和擬作缺損處纖維環厚度分別為（4.45±0.28）mm和（4.08±0.50）mm，與擬作梯形缺損的厚度3 mm和高度5 mm相比差異有統計學意義（t分別為30.532、10.859，均P＜0.05）。

Tab. 1 Measurement results of each lumbar intervertebral space height and the thickness of AFfor defect in sheep表1　羊各腰椎間隙高度和擬作缺損處纖維環厚度的測量結果　（n=5，mm，x ±s）

2.2離體組羊纖維環梯形缺損的測量結果測量的綿羊纖維環梯形缺損上底、下底、高和厚分別為（3.04± 0.09）mm、（5.03±0.09）mm、（4.97±0.10）mm、（3.02±0.06）mm，分別與預定值（3、5、5、3mm）之間的差異無統計學意義（t分別為1.769、1.309、1.519、1.493，均P＞0.05）。

2.3離體組與在體組椎間盤梯形缺損處纖維環及髓核質量比較離體組和在體組綿羊椎間盤梯形缺損處纖維環及少量髓核的質量分別為（0.162±0.011）g、（0.166± 0.014）g，兩組差異無統計學意義（t=0.888，P＞0.05）。

2.4在體組羊纖維環梯形缺損制作術后術后12 d，2只綿羊切口均愈合良好，拆除縫線。羊活動良好，無不良事件發生。

3　討論

3.1建立纖維環部分缺損動物模型的意義椎間盤切除術是治療椎間盤退行性疾病的常用治療方法。椎間盤為無血管組織并處在特殊的力學環境中，損傷后自身修復能力非常有限［8］。以現有的治療技術，尚缺乏修復椎間盤纖維環缺損和恢復其功能的較好方法。纖維環缺損會加速椎間盤的退變，可能導致再次復發，而且纖維環缺損還與患者術后下腰痛具有相關性［9-10］。為了從根本上治療椎間盤退行性疾病，降低術后復發率和術后下腰痛，在手術治療椎間盤退變性疾病時需要干預退變的椎間盤，修復破壞的纖維環。因此，本實驗構建了羊纖維環部分缺損的動物模型，為研究組織工程技術修復纖維環部分缺損提供了重要載體，為從根本上治療椎間盤退行性疾病提供了可能。

3.2理想纖維環部分缺損動物模型的選擇在選擇動物模型模擬人體的腰椎間盤切除術后椎間盤退變和部分缺損時，要同時考慮到動物的種類、年齡、自然壽命和行走方式等，以及人體脊柱的生理結構和椎間盤所處的特殊力學環境。因此，類人猿應該是最理想的動物模型，但由于該實驗動物獲取困難、成本高等因素，決定了該動物模型不能作為主要的實驗研究對象。

小型動物，如大鼠、兔容易獲取，經濟實用，是目前常用的動物模型。但是，與大型動物相比小型動物椎間盤具有物質轉運距離短、新陳代謝活躍、基質含水量高、終生含有脊索細胞等特點［11］。此類動物椎間盤較小，并不適合制作纖維環缺損修復模型，只能用作前期基礎實驗研究。大型動物的椎間盤結構和人的較為相似，這類動物有牛、羊、犬、豬等。O’Connell等［12］進一步研究發現大型動物羊的椎間盤與人體椎間盤較為接近。因此，羊有望成為構建理想纖維環部分缺損動物模型的選擇。

獲得理想的纖維環部分缺損動物模型要綜合考慮以下因素：（1）實驗動物獲取方便、經濟實用、利于廣泛開展研究。（2）纖維環缺損動物模型安全可靠、可重復性好。（3）造模動物的腰椎間盤與人體椎間盤結構相似，利于進一步開展修復與再生研究。（4）造模動物的椎間盤退變與人體椎間盤退變過程相似。（5）造模動物的損傷小，減少不必要的干擾因素。（6）制作纖維環缺損具有統一的量化標準，且易于操作，減少不必要的人為因素對修復結果的影響。

3.3羊纖維環梯形缺損動物模型的優勢選用綿羊作為制作纖維環部分缺損的大型動物模型，經濟實用、易獲取。采用左前外側入路經腹膜后到達羊左前椎間盤，操作簡單安全，不破壞椎體后方結構，對椎間盤周圍軟組織影響小，減少了不必要的干擾因素。使用同一個標準（3 mm×5 mm×5 mm×3 mm）制作梯形缺損，便于以后對組織工程技術修復椎間盤的效果進行比較。擬作梯形缺損的厚度3 mm和高度5 mm與實際測量的羊腰椎間隙高度（4.45±0.28）mm和纖維環厚度（4.08±0.50）mm相比有差異，說明制作的纖維環缺損充分，切去的髓核量很少，對髓核破壞小，降低了不必要的干擾因素。同時，本實驗對11號尖刀測量發現從刀尖向刀尾5 mm處的刀寬剛好是3 mm，可以在此作一標記，術中通過該標記很容易把握椎間盤切口的寬度和深度，操作簡單可靠。軸位剖開椎間盤，測量梯形缺損結果表明使用本纖維環梯形缺損制作方法能夠方便地制作出較為標準的梯形缺損。離體組與在體組羊腰椎間盤缺損處纖維環髓核質量無差異，間接反映了所制作的在體羊纖維環梯形缺損符合預期，并且所稱取的質量與Oehme等［13］制作的羊椎間盤長方體（3 mm×5 mm×5 mm）缺損取出的纖維環髓核相符（0.2 g），說明制作的梯形缺損較為充分、統一。

將纖維環缺損制成梯形更符合臨床髓核摘除后外口小、內口大的缺損類型，并且梯形結構能夠輔助支架更牢固地植入椎間盤缺損中，彌補了長方體（3 mm×5 mm×5 mm）缺損［13］和扇形（10 mm×5 mm×2 mm）缺損［14］易于脫出的不足。同時梯形缺損所形成的斜面與長方體（3 mm×5 mm×5 mm）缺損相比增加了支架與纖維環的接觸面積，減少了剪切應力，有利于兩者牢固地結合，符合Bron等［15］認為的椎間盤修復材料和方法須滿足可牢固固定于周圍組織上、填充或修補纖維環缺損抑制髓核突出的要求。雖然Pirvu等［16］使用牛離體椎間盤制作了梯形（2 mm×3 mm×4 mm）缺損并進行了體外修復培養，但制作的梯形缺損尺寸較小，存在纖維環切取不充分的可能，論證纖維環缺損修復效果說服力有限，而且沒有構建研究牛在體纖維環缺損。另外，構建牛纖維環部分缺損動物模型，成本較高，不利于廣泛應用。

采用微創外側手術入路經腹膜后到達羊目標椎間盤，使用前述的纖維環缺損制作方法成功構建羊纖維環梯形缺損動物模型，操作簡單、安全、可靠，有望成為研究組織工程技術修復纖維環部分缺損的理想動物模型。下一步可開發相應的器械，使纖維環缺損的制作更加簡化、統一。目前，制作纖維環缺損的形狀和尺寸尚缺乏統一的標準，需進一步研究制定統一的量化標準，便于進行不同纖維環部分缺損修復效果的比較，從而推動整個纖維環缺損修復研究的發展。

（圖3～5見插頁）

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（2016-01-22收稿2016-01-25修回）

（本文編輯李鵬）

Establishment of annulus fibrosus partial defect model in sheep

YUAN Qiuming1，2，XU Baoshan2，YANG Qiang2，LIU Yue2，JIANG Hongfeng2，ZHANG Yang2，DU Lilong2，QI Jizhou1，2，ZHAO Jianing1，2，MA Xinlong2
1 Graduate School of Tianjin Medical University，Tianjin 300070，China；2 Tianjin Hospital Corresponding Author E-mail：xubaoshan99@126.com

Objective To establish an animal model of annulus fibrosus（AF）partial defect for the repairing of intervertebral disc（IVD）defect. Methods Image J 1.46r software was used to measure the T12/L1-L6/S1 intervertebral height in ovine lumbar spine X-ray films. AF thickness was measured by axial split disc. A 11 blade was used to make a trapezoid defect of upper bottom 3 mm，lower bottom 5 mm，height 5 mm and thickness 3 mm，whose lower bottom toward the nucleus pulposus（NP）in the left front of ovine lumbar IVD in vitro. The minimally invasive lateral approach was used to make the same type of trapezoid defect in the left front of the ovine lumbar IVD in vivo. The trapezoidal defect length of the axial dividing disc was measured，AF and a small amount of NP from trapezoidal defect in IVD were weighed，and the production of trapezoidal defect in IVD was evaluated. Results The lumbar intervertebral space height of ovine was（4.45±0.28）mm. There were significant differences in the thickness of AF（4.08±0.50）mm，thickness（3 mm）and height（5 mm）of trapezoidal defect（P＜0.05），respectively. There were no significant differences in trapezoidal defects in ovine lumbar IVD in vitro on the upper bottom（3.03±0.09）mm，the lower bottom（5.03±0.09）mm，the height（4.97±0.10）mm，the thickness（3.02±0.06）mm and the trapezoidal defect predetermined value on the upper bottom 3 mm，the lower bottom 5 mm，the height 5 mm and the thickness 3 mm（P＞0. 05）. The weights of the AF and NP taken out from ovine lumbar IVD in vitro and in vivo were （0.162±0.011）g and（0.166±0.014）g，and there was no significant difference between them（P＞0.05）. Conclusion Through the operation of minimally invasive lateral approach，the method of making a trapezoidal defect in the experiments can establish animal model of AF partial defect，which meets the requirements for the repairing of IVD defect，and is simple，safe and reliable.

models，animal；diskectomy；tissue engineering；sheep；annulus fibrosus defect；intervertebral disc defect

R681.57，R681.533.1

A

10.11958/20160030

國家自然科學基金資助項目（81272046，31300798，31470937，31500781）；天津市衛生局攻關課題（14KG121，15KG125）；天津市科學技術委員會課題（15JCYBJC25300，11JCYBJC10200）；中國博士后科學基金項目（2012T50235）

1天津醫科大學研究生院（郵編300070）；2天津市天津醫院

袁秋明（1989），男，碩士在讀，主要從事脊柱外科、組織工程椎間盤研究

E-mail：xubaoshan99@126.com