T2DM小型豬模型骨骼肌、肝臟及胰腺組織蛋白激酶B表達及磷酸化的變化

于健，鄒迪莎，葉瑤，周素嫻，鄭天鵬，楊帆

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T2DM小型豬模型骨骼肌、肝臟及胰腺組織蛋白激酶B表達及磷酸化的變化

于健1，鄒迪莎2，葉瑤2，周素嫻1，鄭天鵬1，楊帆1

目的研究高脂高糖飲食聯合鏈脲佐菌素（STZ）構建巴馬小型豬2型糖尿病（T2DM）模型的可行性，并觀察小型豬模型骨骼肌、肝臟及胰腺組織蛋白激酶B（PKB）表達及磷酸化變化。方法將健康雄性巴馬小型豬10只隨機分為2組：對照組5只，喂養普通飼料；糖尿病模型組5只，高脂高糖飲食聯合STZ構建巴馬小型豬T2DM模型。檢測2組小型豬空腹血糖、空腹胰島素水平，并計算胰島素抵抗指數（HOMA-IR）。采用Western blot法檢測骨骼肌、肝臟及胰腺組織中PKB蛋白表達及磷酸化水平。結果（1）高脂高糖飼料喂養10個月后，與對照組比較，模型組體質量、空腹血糖、空腹胰島素水平及HOMA-IR明顯升高（P＜0.01）。（2）與對照組相比，模型組STZ給藥后空腹血糖水平進一步升高，空腹胰島素水平明顯下降（P＜0.01）。（3）與對照組比較，模型組骨骼肌、肝臟及胰腺組織中PKB蛋白表達及磷酸化水平明顯降低（P＜0.05）。結論高脂高糖飲食聯合STZ多次腹腔注射可以成功構建T2DM小型豬模型，模型組小型豬骨骼肌、肝臟及胰腺組織PKB蛋白表達及磷酸化水平明顯降低。

糖尿病，2型；蛋白激酶類；豬，雛型；肌，骨骼；肝；胰腺；巴馬小型豬

隨著社會經濟的發展以及人們膳食結構和生活方式的改變，糖尿病（diabetes，DM）發病率明顯上升，糖尿病已成為全球范圍內致死、致殘和醫療費用增加的重要因素。目前2型糖尿病（T2DM）的發病機制仍未完全清楚，其中胰島素抵抗（insulin resistance，IR）在T2DM的發生發展中起重要作用。鏈脲佐菌素（streptozotocin，STZ）能夠選擇性地破壞某些種屬動物胰島的β細胞，導致糖尿病的發生。在考慮膳食在糖尿病發病進程的因素中，膳食誘導聯合小劑量STZ的糖尿病造模技術已被廣泛應用［1］，但這種方法主要應用于嚙齒類動物模型的復制，而大型動物模型如豬動物模型復制的報道較少。小型豬不僅許多器官系統與人類相似，而且價格也相對適中，是誘發糖尿病模型的理想動物［2］。蛋白激酶B（protein kinase B，PKB）是胰島素作用主要的信號轉導途徑之一——磷脂酰肌醇3-激酶（PI3K）途徑下游重要的絲氨酸/蘇氨酸激酶，PKB能通過影響胰島素的信號轉導調節葡萄糖的攝取、糖原合成、糖酵解等胰島素代謝反應。因此，本研究應用高脂高糖飲食聯合STZ構建巴馬小型豬T2DM模型，探討該模型特征及骨骼肌、肝臟、胰腺組織PKB和磷酸化（P）-PKB蛋白的表達情況，以期為糖尿病研究提供穩定的動物模型。

1材料與方法

1.1主要試劑PKB及P-PKB一抗（CST公司），胰島素放射免疫分析試劑盒（北京北方生物技術研究所），STZ（美國Sigma公司）。

1.2 T2DM小型豬模型的構建參照筆者以往的T2DM小型豬模型造模方法［3］：選擇巴馬小型豬10頭（均為雄性），體質量10～20 kg，2～3月齡，適應性喂養1周后將小型豬按簡單隨機化方法分為2組（每組5頭），模型組給予高脂高糖飼料喂養（高脂高糖飼料配方為蔗糖37%、豬油10%、膽固醇2%、普通飼料51%）；對照組喂養普通飼料。2組動物喂養10個月，11個月初禁食空腹給予模型組動物腹腔注射STZ 100 mg/kg，1周后，重復上述劑量1次。對照組動物腹腔注射等劑量檸檬酸-檸檬酸鈉緩沖液。各組繼續維持原有飼料喂養，實驗周期共12個月。成模標準：參照1999年世界衛生組織（WHO）糖尿病診斷標準。

Fig.1 Comparisons of PKB and P-PKB protein expression in skeletal muscle，liver and pancreatic tissues between two groups圖1　2組骨骼肌、肝臟及胰腺PKB及P-PKB蛋白表達比較

1.3空腹血糖、胰島素水平檢測小型豬禁食采血檢測空腹血糖及空腹胰島素水平，并計算胰島素抵抗指數（HOMA-IR）。

1.4骨骼肌、肝臟及胰腺組織PKB及P-PKB蛋白表達檢測小型豬禁食麻醉，股動脈放血處死，取胰腺、肝臟和骨骼肌組織，置于-70℃冰箱保存，參照文獻［4］采用Western blot檢測骨骼肌、肝臟及胰腺組織PKB蛋白表達及磷酸化水平。

1.5統計學方法數據采用SPSS 19.0軟件統計分析，計量資料采用均數±標準差（）表示，兩樣本均數比較采用t檢驗，以P＜0.05為差異有統計學意義。

2　結果

2.1 2組動物一般情況模型組均成模，成模小型豬毛發粗糙、無光澤，精神萎靡，并出現多尿、多飲、多食及體質量下降等糖尿病癥狀。高脂高糖飼料喂養10個月后，模型組的體質量（86.32±5.86）kg較對照組（41.54±4.54）kg明顯升高（t=15.672，P＜0.01）。對照組小型豬精神狀況良好，毛發光澤，生長良好。

2.2高脂高糖喂養10個月后2組空腹血糖、空腹胰島素及HOMA-IR比較模型組空腹血糖（6.46± 0.31）mmol/L、空腹胰島素（15.67±1.46）mIU/L及HOMA-IR 4.51±0.53較對照組（4.66±0.45）mmol/L、（8.12±0.32）mIU/L及1.69±0.22均明顯升高（t分別為7.461、11.328和10.928，均P＜0.01）。

2.3實驗結束時2組空腹血糖、空腹胰島素水平比較模型組動物空腹血糖水平（11.46±1.64）mmol/L較對照組（4.64±0.47）mmol/L明顯升高（t=8.938，P＜0.01），模型組動物空腹胰島素水平（6.57±0.33）mIU/L較對照組（8.11±0.28）mIU/L明顯降低（t=8.142，P＜0.01）。

2.4 2組骨骼肌、肝臟及胰腺組織PKB蛋白表達及磷酸化水平比較與對照組比較，模型組骨骼肌、肝臟及胰腺組織PKB蛋白表達及磷酸化水平明顯降低（P＜0.05），見圖1。

3　討論

豬在解剖結構、血生化指標、肥胖傾向性等方面與人類高度相似，其中小型豬動物模型已廣泛運用于糖尿病、呼吸系統、心血管系統、消化系統及外科等領域的研究［5-7］。適于醫學動物實驗的有巴馬小型豬、西雙版納小型豬、五指山微型豬等。巴馬小型豬源產于廣西巴馬瑤族自治縣，是具有悠久的飼養歷史和穩定的遺傳基因的地方小型豬品種。小型豬除了血生化指標與人類高度相似外，其糖脂質代謝也近似于人類；此外小型豬容易飼養、抗病能力強、易于實驗操作等。因此，小型豬在糖尿病研究中具有獨特優勢。

IR是T2DM的主要發病機制，IR是指胰島素執行其正常生物作用的效應不足，表現為外周組織尤其是肌肉、脂肪組織對葡萄糖的利用障礙。胰島素通過與其受體結合可在不同組織細胞內激活不同的信號途徑而產生不同的作用，胰島素信號轉導在胰島素生理作用的發揮中起著至關重要的作用，因而信號轉導的不同環節出現異常均可導致IR。胰島素受體信號主要包括PI3K/PKB/哺乳動物雷帕霉素靶蛋白（mTOR）和有絲分裂原信號（MAPK）兩條途徑。其中PKB在胰島素信號轉導和葡萄糖轉運中起重要作用，PKB表達水平和活性的改變與IR及糖尿病的發生發展密切相關，在IR狀態下，胰島素刺激的肝細胞及脂肪細胞的PKB絲氨酸磷酸化及PKB活性受到抑制，進一步削弱了胰島素的作用。另外，PKB的磷酸化還可以減少胰島β細胞凋亡，促進β細胞修復，改善β細胞分泌功能［8］。

本研究先采用高脂高糖飲食喂養巴馬小型豬，模型組動物出現明顯肥胖、高胰島素血癥及IR，并采用多次小劑量注射STZ部分破壞胰島β細胞，接近人類T2DM發病特點，而且大大降低了STZ的不良反應，與文獻報道相似［9］。另外，本研究結果發現T2DM模型組骨骼肌、肝臟及胰腺組織PKB蛋白表達及磷酸化水平明顯低于對照組，提示模型組出現IR的傾向，與其他研究相一致［4］。

本研究顯示采用高脂高糖飲食聯合STZ多次腹腔注射的方法構建T2DM小型豬模型，操作簡便、易于掌握，且具有較好的安全性，為糖尿病研究提供了良好的研究工具。

［1］Liu YN，Jung JH，Park H，et al. Olive leaf extract suppresses messenger RNA expression of proinflammatory cytokines and enhances insulin receptor substrate 1 expression in the rats with streptozotocin and high-fat diet-induced diabetes［J］. Nutr Res，2014，34（5）：450-457. doi：10.1016/j.nutres.2014.04.007.

［2］Strauss A，Moskalenko V，Tiurbe C，et al. Goettingen Minipigs （GMP）：comparison of two different models for inducing diabetes ［J］. Diabetol Metab Syndr，2012，5（4）：7. doi：10.1186/1758-5996-4-7.

［3］Yu J，Ye Y，Huang LL，et al. The research on stability of type 2 diabetes model in Chinese Bama miniature pigs induced by high fat/ high sucrose diet and STZ［J］. Shanxi Med J，2014，43（21）：2499-2501.［于健，葉瑤，黃漓莉，等.高脂高糖飲食聯合鏈脲佐菌素構建巴馬小型豬2型糖尿病模型穩定性研究［J］.山西醫藥雜志，2014，43（21）：2499-2501］.

［4］Cao SC，Zhao G，Chang B，et al. Effects of exercise on expression and phosphorylation of PI3K and PKB in insulin signaling in the skeletal muscles of type 2 diabetic rats［J］. J South Med Univ，2010，30（6）：1217-1221.［曹師承，趙剛，常波，等.運動對2型糖尿病大鼠骨骼肌胰島素信號通路PI3K/PKB磷酸化與表達的影響［J］.南方醫科大學學報，2010，30（6）：1217-1221］.

［5］He B，Musk GC，Mou L，et al. Laparoscopic surgery for kidney orthotopic transplant in the pig model［J］. JSLS，2013，17（1）：126-131. doi：10.4293/108680812X13517013318021.

［6］Wolf E，Braun- Reichhart C，Streckel E，et al. Genetically engineered pig models for diabetes research［J］. Transgenic Res，2014，23（1）：27-38. doi：10.1007/s11248-013-9755-y.

［7］Sheu SY，Wang WL，Fu YT，et al. The pig as an experimental model for mid-dermal burns research［J］. Burns，2014，40（8）：1679-1688. doi：10.1016/j.burns.2014.04.023.

［8］Higa M，Shimabukuro M，Shimajiri Y，et al. Protein kinase B/Akt signalling is required for palmitate-induced beta-cell lipotoxicity ［J］. Diabetes Obes Metab，2006，8（2）：228-233.

［9］Xiao GH，Zhang SJ，Yu J，et al. Establishment of model of type 2 diabetes in Chinese banna miniature pigs induced by high sucrose/ high fat diet and STZ［J］. Journal of Medical Science in Central South China，2012，40（4）：351-356.［肖國華，張素君，余堅，等.高糖高脂聯合低劑量STZ誘導版納微型豬2型糖尿病模型的建立［J］.中南醫學科學雜志，2012，40（4）：351-356］. doi：10.15972/j.cnki.43-1509/r.2012.04.018.

（2015-10-12收稿2015-12-30修回）

（本文編輯魏杰）

Changes of protein kinase B and phosphorylation expression in the skeletal muscle，liver and pancreas of miniature pig model with type 2 diabetes mellitus model

YU Jian1，ZOU Disha2，YE Yao2，ZHOU Suxian1，ZHENG Tianpeng1，YANG Fan1
1 Department of Endocrinology，the Affiliated Hospital of Guilin Medical College，Guangxi 541001，China；2 Graduate School of Guilin Medical College

Objective To study the feasibility of Bama miniature pig model establishment of type 2 diabetes mellitus （T2DM）by high-fat and high-sugar diet combined with streptozotocin（STZ），and observe the changes in protein kinase B （PKB）and phosphorylation expressions in skeletal muscle，liver，and pancreatic tissues of the miniature pig model. Methods A total of 10 healthy male Bama miniature pigs were randomly divided into two groups：control group（n=5，fed normal diet）and diabetic model group（n=5，fed high-fat and high-sugar diet combined with STZ to establish T2DM Bama miniature pig model）. The fasting plasma glucose（FPG）and fasting insulin（FINS）levels were measured，and insulin resistance（HOMA-IR）was calculated in two groups. The PKB and phosphorylation expressions in skeletal muscle，liver and pancreatic tissues were measured using Western blot assay. Results（1）After 10 months of high-fat and high-sugar diet，the body weight，FPG，FINS and HOMA-IR were significantly higher in model group than those of control group（P＜0.01）. （2）After STZtreatment，compared with control group，there was afurther increased level of FPG and asignificantly decreased level of FINS in model group（P＜0.01）.（3）Compared with control group，the PKB and phosphorylation expression levels in skeletal muscle，liver and pancreas were significantly lower in model group（P＜0.05）. Conclusion The high-fat and highsugar diet combined with STZ can successfully establish the T2DM miniature pig model. The PKB and phosphorylation expression levels in skeletal muscle，liver，and pancreatic tissues are decreased in model pigs.

diabetes mellitus，type 2；protein kinases；swine，miniature；muscle，skeletal；liver；pancreas；Bama miniature pig

廣西科學研究與技術開發計劃項目課題（桂科攻1347003-5）；桂林市科學研究與技術開發計劃項目課題（20150126-1-1）；廣西壯族自治區衛生廳科研課題（Z2014301）

1桂林醫學院附屬醫院內分泌科（郵編541001）；2桂林醫學院研究生院

于健（1965），女，教授，碩士，主要從事糖尿病慢性并發癥基礎與臨床研究

R587.1

A

10.11958/20150202