聚苯乙烯薄膜三維培養肝細胞的實驗研究

楊　波,　任　杰,　龔　翠

(上海理工大學 醫療器械與食品學院,上海　200093)

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聚苯乙烯薄膜三維培養肝細胞的實驗研究

楊波,任杰,龔翠

(上海理工大學 醫療器械與食品學院,上海200093)

摘要：采用三維聚苯乙烯薄膜作為細胞培養支架,在體外進行大鼠肝細胞的三維培養,并與常規二維肝細胞培養進行比較.分析了細胞的生長狀態及肝細胞功能,包括細胞存活率、白蛋白分泌功能、尿素合成功能及葡萄糖消耗功能.結果顯示:三維細胞增殖活力均始終明顯高于二維;在顯微鏡下觀察,可看到三維支架表面黏附生長的肝細胞逐漸增多,有肝細胞黏附成團,且肝細胞保持著良好的形態學結構.研究表明,三維培養的肝細胞其增殖生長和代謝功能都優于同樣條件下的二維培養,三維聚苯乙烯薄膜可以作為體外肝細胞培養支架,在生物人工肝培養體系中具有應用前景.

關鍵詞：聚苯乙烯薄膜; 三維培養; 二維培養; 肝細胞

細胞在體外的生長增殖、分化和代謝功能的表達,對細胞培養而言特別重要,高密度細胞培養是體外形成組織或器官的基礎.細胞在二維(2D)平面的培養模式下生長,目前大部分實驗研究都基于此,盡管這種培養方式操作方便,但是與細胞在體內的生長模式相差甚遠.在二維環境下培養的細胞并不總是按照實際情況生長運作,有時細胞不得不改變形態以適應二維的培養條件,最終導致細胞形成扁平的細胞形態,而這些改變影響細胞的生長分化并削弱細胞功能,因此影響最終的實驗研究效果[1-4].三維支架(Alvetex-3D)細胞培養模型作為一種新型的細胞培養模式,在體外構建與體內相近的細胞微環境,更好地模擬了細胞生長的微環境,維持細胞發育結構系統,有助于我們了解細胞體內復雜的生物現象.因此,三維細胞培養既能保留體內細胞微環境的物質基礎,又能體現細胞培養的直觀性及條件可控性,把這種技術通過體外培養與動物模型結合起來,能形成一種方便高效的研究體系,為研究組織的形成及藥物的篩選等方面提供重要的平臺,并為研究提供更準確的數據.

本研究采用聚苯乙烯薄膜作為細胞培養三維支架,通過模擬細胞在天然組織中的復雜環境和狀態,可以獲得更準確的細胞行為功能.相比于二維培養結果,在三維支架中細胞能保持天然的三維結構,自由地與相鄰細胞聯系,細胞在體外生長更接近體內環境.實驗評估并比較了在傳統二維培養與三維系統培養下肝細胞的生長增殖和功能代謝的情況.本實驗研究肝細胞的三維培養可以為生物人工肝體外構建人工肝組織,進而為肝移植提供供體.

1材料與方法

1.1材料

大鼠肝細胞購于上海細胞生物研究所.Me2SO(無菌,二甲基亞砜)、胎牛血清、1640培養液、葡萄糖、試劑盒等購于上海索萊寶生物科技有限公司.三維支架購于上海普飛生物科技有限公司.

1.2實驗儀器

實驗所采用的儀器:電子天秤(SartoriusBP211D,德國)、二氧化碳培養箱(HH.CP-01W,上海博訊實業有限公司醫療設備廠)、立式壓力蒸汽滅菌器(Tommy有限公司,日本)、顯微鏡(ECLIPSE55i,日本Nikon)、酶標儀(LRM340M,北京博邁杰科技有限公司)、場發射環境掃描電子顯微鏡(QuantaFEG,FEI公司,美國).

1.3實驗方法

1.3.1大鼠肝細胞的Alvetex-3D培養

首先,進行Alvetex-3D的前處理:

a. 取出載體,打開獨立包裝,用鑷子小心地取出細胞小室;

b. 將小室裝入6孔培養板中,每孔大約需要70%的乙醇溶液5ml,浸泡潤洗數分鐘;

c. 吸出乙醇,用1 640培養液潤洗兩遍,徹底洗去乙醇,泡在培養液內,置于培養箱中備用.

然后,進行細胞的接種培養:

a. 吸去6孔板內的培養液,小心地將原代大鼠肝細胞以每孔約3×105個細胞的密度接種于細胞小室的圓片中央;

b. 蓋上蓋子,將培養板置于培養箱內孵育60～90min,讓細胞與支架充分結合;

c. 沿著細胞小室邊緣緩慢加入6ml培養液(胎牛血清和1 640培養液的配比為1∶9),蓋上蓋子,將培養板置于二氧化碳培養箱(37 ℃,5%CO2,100%濕度)中;

d. 密切關注培養液的狀況,液體顏色變為淡紅色甚至黃色則需換液,一般培養的前4d可隔天進行一次換液,繼續培養則需每天觀察并換液.

1.3.2大鼠肝細胞的二維培養

由于二維培養是平面培養,細胞直接接種于6孔板中.在超凈臺上,將分離的肝細胞按每孔約3×105個細胞的密度接種于培養板孔中,加入6ml培養液,置培養板于二氧化碳培養箱(37 ℃,5%CO2,100%濕度)中.培養并隔天進行換液與觀察.

1.3.3電鏡的形態學觀察

為了清晰反映聚苯乙烯的三維結構,需要利用電鏡進行觀察,具體步驟如下.

a. 取材:小心用鑷子取0.5cm3左右的三維支架樣本,放入樣品管內.

b. 固定:樣本加入濃度為2.5%的戊二醛,在4 ℃冰箱內放置2h以上;用pH7.4的磷酸緩沖液洗3次,每次30min左右;再用4 ℃ 預冷的濃度為1%的鋨酸固定1.5h,然后用緩沖溶液(PBS)浸洗2次,每次10min.

c. 脫水:用配比為1∶1的丙酮、醋酸異戊酯混合液脫水處理10min;再分別用30%,50%,70%,80%,90%,95%,100% 的酒精溶液脫水,每種濃度脫水2 次,每次15min.

d. 干燥:將待測樣品置于臨界點干燥器內,浸泡在液態二氧化碳中,加熱至臨界點溫度(31.40 ℃,72.8個大氣壓)以上,使之干燥.

f. 噴金:噴鍍均勻后掃描電鏡下觀察.

1.3.4細胞增殖活力(MTT)值的測定

分別在培養0,2,4,6,8,10d時對細胞的MTT值進行測定,使用MTT試劑盒在酶標儀中進行測定.

1.3.5肝細胞的代謝功能

白蛋白、葡萄糖和尿素的代謝指標是肝細胞代謝活動的常規指標.以溴甲酚綠法、二乙酰一肟顯色法、葡萄糖氧化酶法用試劑盒在酶標儀中測定白蛋白、尿素和葡萄糖的含量.

1.3.6數據處理

2結果與分析

2.1三維支架

聚苯乙烯三維支架載體被截成200μm厚的薄片,做成了適合常規細胞培養板的形式[5-6],如圖1(a)所示.本實驗使用的是適配6孔板的三維支架,電鏡觀察下呈疏松多孔狀,成孔率在 90%以上[7-8],細胞可以黏附在空隙中進行生長分化,見圖1(b).這種特殊的結構設計為體外培養細胞創造了更類似體內的微環境,并且支架的化學成分和標準細胞培養板相同,可以建立二維與三維培養模式的直接比較.

2.2肝細胞的生長情況

掃描電鏡顯示肝細胞在二維和三維培養條件下有顯著不同的外觀.在二維培養條件下,細胞很快在表面拉伸生長,形成表面扁平的結構,如圖2(a)所示.在三維聚苯乙烯支架中,細胞快速增長,并在支架孔隙中擴展,7d后,由于三維環境可以使細胞與相鄰細胞交互孵化生長,因此細胞很快相互聚集成球體,如圖2(b)所示.結果表明,三維培養可以充分利用材料,使材料表面積最大化.相比二維表面細胞,在三維聚苯乙烯支架中培養的肝細胞,可以保持高水平的細胞生存能力,擁有立體的細胞形態.

圖1　掃描電鏡下的Alvetex-3D結構

圖2　肝細胞在二維平面和三維支架上的生長情況

圖3是肝細胞在二維表面和三維聚苯乙烯支架上的生長狀態,采用三維圖像重建.由文獻[9]可知,細胞在二維表面生長時,為適應平面的形態,細胞需保持扁平狀態,單個細胞的平均寬度是46.7μm(±9.2μm),高度是7.3μm(± 4.2μm);而當細胞在聚苯乙烯支架中生長,由于支架更接近體內生長環境,細胞的平均寬度是14.7μm(±4.1μm),高度是23.3μm(±8.1μm).細胞在二維表面生長時,受到空間的限制,只能在水平區域X,Y軸方向盡量伸展,因此二維生長寬度是三維的近3倍;同時,細胞盡可能壓縮豎直方向Z軸的生長,因此二維生長高度僅為三維的近1/3.在三維支架上,細胞生長更加立體,可以沿豎直方向Z軸生長.

2.3三維培養的大鼠肝細胞

使用倒置相差顯微鏡,觀察肝細胞接種入支架后的效果.顯微鏡可觀察到支架孔隙內充滿密集的細胞,因支架透光性差,在相差顯微鏡下不易觀察到細胞.如圖4所示,在細胞培養2d和8d后,對細胞進行拍照,圖中用箭頭指出了幾處黏附生長的細胞.可觀察到三維支架中的細胞多聚集生長,由于支架特殊的疏松結構,細胞生長空間大,幾乎無懸浮的死細胞.

圖3　肝細胞在二維平面和三維支架上生長狀態的三維構相

圖4　三維培養的大鼠肝細胞形態

2.4細胞增殖活力MTT值對比

分別在培養0,2,4,6,8,10d后,對三維與二維培養的原代大鼠肝細胞進行MTT值測定.

由圖5可知,二維培養條件下,細胞在前4d的MTT值每天不斷增加,4d后上升趨勢達到最高值,而后出現下降趨勢.三維培養條件下,細胞在前6d的MTT值每天均呈上升趨勢,且在培養4d后增加尤為顯著,從培養6d后MTT值開始平穩.肝細胞在二維表面和三維支架中生長,從MTT數據顯示的結果可知,三維支架中的細胞生存能力明顯強于二維平面.在二維平面上,由于細胞生長空間受到限制,一旦平面長滿,細胞就無法繼續生長;而在三維支架中,細胞生長不受限制,有較大的表面積供細胞增殖分化,并且可以和相鄰細胞共同黏附聚集生長,因此細胞增殖生長比較快.

2.5肝細胞的白蛋白分泌功能檢測

分泌白蛋白含量是肝細胞在肝臟中的重要功能代謝指標,由于蛋白質中的氨基酸在藥物聯合和輸送、維護膠體滲透壓和自由基的清除中都起到重要作用,因此,在體外培養中白蛋白分泌是常用的肝細胞功能指標[10-12].

圖5　三維與二維培養的大鼠肝細胞的MTT值比較

圖6給出了在二維平面和三維支架上白蛋白分泌隨時間變化的情況.由圖6可知,在前6d,二維培養的細胞分泌白蛋白含量不斷增加,在培養6d后達到最高值,而后出現明顯下降,說明肝細胞單層培養產生的細胞白蛋白分泌量較低.在三維支架培養的10d時間內,細胞分泌白蛋白含量均呈上升趨勢,與二維表面相比,細胞分泌白蛋白含量顯著提升,表明3D環境更有利于增強細胞的白蛋白功能.

圖6　三維與二維培養的大鼠肝細胞分泌白蛋白

2.6細胞尿素合成功能的檢測

圖7給出了在二維平面和三維支架上大鼠肝細胞的合成尿素含量.在前6d,Alvetex-3D與二維培養的細胞的合成尿素量每天均顯著增加,在培養6d后達到最高值,但每個階段三維培養均大大高于二維培養條件下的細胞合成尿素的含量.隨后,二維條件下的細胞合成尿素量呈下降趨勢,而Alvetex-3D培養的細胞的合成尿素量在培養8d后開始保持穩定.

圖7　三維與二維培養的大鼠肝細胞合成尿素含量比較

2.7細胞消耗葡萄糖的檢測

圖8給出了在二維平面和三維支架上大鼠肝細胞的消耗葡萄糖量的對比.在前6d,二維培養的細胞消耗葡萄糖量每天緩慢增加,6d后達到最高值,而后開始下降;而三維支架培養的細胞在10d內消耗葡萄糖量每天均呈上升趨勢,尤其是培養8d后,葡萄糖量顯著高于二維培養組.

圖8　三維與二維培養的大鼠肝細胞消耗葡萄糖量比較

3討論

本文采用三維聚苯乙烯支架進行體外肝細胞的培養,并與二維平面培養相比較.環境對細胞的影響可能來自細胞的變形,也可能來自細胞所處的生化環境的改變.細胞在二維培養時,受生長條件限制,細胞的形態發生變化,而細胞的變形引起細胞膜內外離子濃度的改變,最終影響細胞營養成分和代謝產物的交換.因此,當采用三維系統培養細胞時,由于三維培養環境接近體內環境,對細胞的形態、結構、生長和代謝有什么影響,以及與二維培養有什么不同,本研究就此展開討論.

當細胞黏附于環境表面開始生長時,具有改變其形態以獲得環境最小應變的能力.細胞黏附于二維平面基底上時,細胞自動形成扁平狀以達到最小能量狀態.因此細胞骨架結構在某種程度上決定細胞的形態,而其形態是控制細胞生長的重要因素,力學刺激以特定的方式分布于胞外基質中,只有通過結構成分骨架才能與細胞相互連接[13].二維結構培養細胞盡管具有梭形形態進行擴展,但這種培養方法由于受到細胞接觸抑制的影響,對細胞的增殖和分化有很大的影響[14-15].三維結構在決定細胞內外環境變化的反應中起著重要的作用,當細胞生長在三維基質支架中時,細胞的生長環境接近于人體內環境,因此細胞形態更接近于體內細胞形態,而細胞形態和骨架結構與細胞代謝密切相關,越接近體內環境,細胞的生長形態越好,細胞的各項代謝功能也越好.本實驗已經證明,三維培養的細胞代謝功能好于二維培養的細胞.

總之,本實驗證明聚苯乙烯支架可以用于肝細胞的體外三維培養,且該環境下細胞的代謝功能指標顯著高于二維培養,這是由于細胞的三維系統培養方式更近似于體內的培養條件.因此,細胞的三維培養可以為研究者提供更準確的數據,這將有助于提高科研效率,使細胞及組織工程的研究更具發展前景.

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(編輯:董偉)

Experimental Study on Three-dimensional Cell Culture in a Polystyrene Film

YANG Bo,REN Jie,GONG Cui

(SchoolofMedicalInstrumentandFoodEngineering,UniversityofShanghaiforScienceandTechnology,Shanghai200093,China)

Abstract：A three-dimensional polystyrene film was used to culture cell in vitro scaffolds,and the results were compared with those of the conventional two-dimensional liver cell culture.The proliferation and metabolism functions were analyzed,including the cell survival rate,albumin secretion,urea synthesis function and glucose consumption function.The results show that the three-dimensional cell proliferation activity is significantly higher than that of the two-dimensional and the gradually increased growth of the three-dimensional scaffold surface adhesion of liver cells and the formation of liver cell adhesion can be observed by biological microscope.The studies also show that the three-dimensional liver cells proliferation and metabolism functions are superior to the two-dimensional functions in the same conditions.The three-dimensional polystyrene film can be used as scaffolds of liver cell culture in vitro,and has good application prospect in the vitro cultivation system of biological artificial liver.

Keywords：polystyrene film; three-dimensional culture; two-dimensional culture; hepatocytes

文章編號：1007-6735(2016)03-0301-06

DOI：10.13255/j.cnki.jusst.2016.03.015

收稿日期：2015-06-01

中圖分類號：Q 813

文獻標志碼：A

第一作者： 楊波(1968-),女,副教授.研究方向:低溫生物醫學.E-mail:yangbo6899@126.com