bHGA對體外培養成骨細胞活性的影響

王朝元，劉亮亮

(中南民族大學 生命科學學院，武漢 430074)

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bHGA對體外培養成骨細胞活性的影響

王朝元，劉亮亮

(中南民族大學 生命科學學院，武漢 430074)

摘要為探討12b-羥基-去-D-杰氏山竹子素A(bHGA)的體外潛在成骨活性，用bHGA處理MC3T3-E1成骨細胞，研究了其對細胞堿性磷酸酶活性、礦化、骨相關基因表達及早期成骨分化相關基因表達水平的影響.結果表明：bHGA處理細胞后，對Runx2 mRNA表達無顯著影響，而對OsxmRNA的表達具有一定抑制作用.bHGA能同時促進骨鈣蛋白基因OCN和Ⅰ型膠原Col1 mRNA的表達，但抑制堿性磷酸酶 mRNA的表達，其對骨橋蛋白基因OPNmRNA的表達沒有顯著影響.說明bHGA不利于骨早期分化，但它通過促進骨鈣蛋白和I型膠原mRNA的表達而促進骨成熟.

關鍵詞12b-羥基-去-D-杰氏山竹子素A；成骨活性；骨相關基因；成骨分化相關基因

人面果(Garciniaxanthochymus)是我國的一種傳統傣藥，是藤黃科藤黃屬植物，一般生長于海拔100～1000 m的丘陵、溝谷和潮濕的密林中，在我國其主要分布于云南省南部及西南部.作為傳統中藥，它具有清熱退火，消腫止痛，活血化瘀的療效，可用于跌打損傷，風濕關節疼痛的治療[1].它含有二苯甲酮衍生物、黃酮、三萜和口山酮類等化合物，其中一些化合物具有廣泛的生物活性，如抗氧化、抗糖尿病、抗菌、抗細胞毒素和抗HIV病毒等[2]. 12b-羥基-去-D-杰氏山竹子素A為黃色無定形固體，是從傣藥人面果中提取的藥物小分子化合物, 具有抗菌、抗腫瘤作用[3]，其成骨生物活性尚不清楚.本文通過對其進行了體外成骨活性的相關測試，為中藥人面果臨床上的應用奠定一定的理論基礎.

1材料和方法

1.1材料和儀器

小鼠原成骨細胞MC3T3-E1購自武漢大學典型培養物保藏中心，α-MEM 培養基(Thermo 賽默飛世爾生化制品有限公司)，胎牛血清(杭州四季青公司)，0.25% 胰蛋白酶(Thermo)，Alamar Blue 試劑盒(北京泛博生物化學有限公司)，堿性磷酸酶試劑盒(南京建成生物工程研究所)，SYBR Green 熒光染料(日本 TOYOBO 公司)，反轉錄試劑盒(Thermo).

細胞培養瓶, 96 孔、24 孔、6 孔培養板，酶聯免疫分析儀(MULTISKAN ASCENT 354 型，Thermo)，CO2培養箱(HF90/240 型，利康生物醫療科技控股集團)，凝膠成像分析儀(JS-380A，上海培清科技)，熒光定量PCR儀(ABI7500Fast，美國應用生物系統公司).

1.2bHGA的結構

從云南西雙版納收集的人面果中分離提取bHGA，其分子結構見圖1，分子量為442，通過NMR，質譜，HRMS數據鑒定得到[4].

圖1　bHGA的分子結構Fig.1　Molecular structure of bHGA

1.3bHGA儲存液的配制

將bHGA溶于DMSO，60℃加熱30 min助溶，制得初始濃度為16 mM的貯存液，保存在-20℃備用.

1.4細胞培養基

基礎培養基：10%胎牛血清的α-MEM培養基加入100 U/mL青霉素和100 mg/mL鏈霉素.誘導培養基：在基礎培養基中加入終溶度為50 μg/mL抗壞血酸、10-8mol/L地塞米松、10 mmol/L的β-甘油磷酸鈉.

1.5bHGA細胞毒性的測試

用Alamar Blue實驗檢測bHGA對細胞存活率的影響[5]. MC3T3-E1細胞以1×103/孔的密度接種于96孔板中，細胞粘附后換用含不同濃度bHGA的誘導培養基(bHGA終濃度分別為0, 2, 4, 8, 16 μM)，每組設3個平行樣，將培養板放置于37℃，5% CO2培養箱中培養0，24，72 h，每孔加入18 μL的Alamar Blue試劑使其最終體積分數為10%，黑暗條件孵化4 h，用熒光酶標儀于540 nm檢測光吸收值(激發光544 nm,發射光590 nm)，以0.5% DMSO為陰性對照.

1.6bHGA對成骨細胞堿性磷酸酶活性的影響

將MC3T3-E1細胞按1×104/孔接種于24孔板中，每孔加入2 mL誘導培養基.細胞粘附后，加入bHGA(終溶度為2，4，8 μM)，每組設3個重復, 含0.5% DMSO誘導培養基作為陰性對照. 培養細胞8 d、16 d，每孔加入600 μL的0.1% Triton PBS裂解液，4℃放置12 h裂解細胞，用堿性磷酸酶試劑盒檢測細胞堿性磷酸酶活性.

1.7bHGA對成骨細胞體外礦化的影響

將MC3T3-E1細胞按7.5×103/孔接種于48孔板中，分別加入含有3種不同濃度bHGA(bHGA終濃度為2，4，8 μM)的誘導培養基，以含0.5% 的DMSO作為陰性對照，每組設3個平行樣，培養細胞沒2～3 d更換一次培養基, 分別培養8 d和16 d后，用PBS將樣品洗2次.室溫條件下，加入-20℃冰冷的甲醛固定細胞10 min，用dH2O洗2次，加入1% 茜素紅孵化10 min，用dH2O洗若干次后風干，置倒置顯微鏡下觀察.

為了定量測定細胞礦化，在每孔中加入10% 的乙酸800 μL，室溫放置30 min，間歇震蕩.后用細胞刮刀刮下細胞，加入10% 的醋酸，漩渦震蕩30 s，再加入200 ～300 μL礦物油覆蓋，加熱至85℃，10 min，轉移至冰上5 min, 20000 r/min離心15 min.取每管上清液300～400 μL轉移至新的1.5 mL的離心管中，加入體積分數為10% 的氫氧化銨200 μL中和酸，取上清液150 μL轉移至96孔板中于405 nm檢測吸光值.

1.8bHGA對成骨細胞骨分化相關基因表達的影響

將MC3T3-E1細胞按7.5×103/孔接種于48孔板中，加入含有bHGA的誘導培養基(bHGA的終濃度為2，4，8 μM)，每組3個重復，0.5% 的DMSO為陰性對照.培養8 d和16 d，收集細胞，用Trizol法裂解細胞提取總RNA[6].按試劑盒說明書反轉錄成cDNA第一條鏈.熒光定量PCR的引物[7]見表1，GAPDH為內參基因.PCR循環參數如下：初始變性：95℃，10 min；變性：95℃，15 s；退火和延伸：60℃，60 s；循環數：45.用軟件SDS2.2.2處理數據，通過2-△△CT計算相關基因表達影響[8].

表1　PCR引物序列

1.9統計分析

采用t-檢驗法(student′s t-test)對實驗數據進行顯著性差異分析，置信度p取值0.05.

2結果與分析

2.1bHGA對細胞存活率的影響

bHGA對體外培養成骨細胞增殖的影響結果如圖2.如圖2所示，到第3 d，不同濃度bHGA(0～16 μM)與對照組相比，16 μM組對成骨細胞具有較強細胞毒性.故選定3種濃度(2，4， 8 μM)用于后續細胞成骨活性實驗.

圖2　bHGA對體外培養成骨細胞增殖的影響(n=3)Fig.2　Effect of bHGA on osteoblast viability in vitro

2.2bHGA對成骨細胞堿性磷酸酶活性的影響

bHGA對成骨細胞堿性磷酸酶活性的影響結果見圖3，如圖3所示，與對照組相比，4 μM和8 μM bHGA處理8 d顯著抑制了細胞內堿性磷酸酶的活性.但處理16 d后，3種濃度的bHGA對細胞堿性磷酸酶活性無明顯抑制.說明這些濃度的bHGA對成骨細胞的堿性磷酸酶活性存在短期抑制作用.

與對照比較,*p<0.05, n=3圖3　bHGA對體外培養成骨細胞堿性磷酸酶活性的影響Fig.3　Effect of bHGA of different concentrations on osteoblastalkaline phosphatase activity in osteoblasts in vitro

2.3bHGA對體外培養成骨細胞基質礦化的影響

2、4、8 μM三種濃度bHGA處理細胞8 d后, 所測A405平均值分別為0.11、0.12、0.13, 處理16 d后A405平均值分別為1.13、0.98、1.0.其中對照組8 d 和16 d A405平均值分別為0.11和1.10.三種濃度bHGA處理結果與對照組相比，不存在顯著性差異，未影響細胞外基質的礦化.

2.4bHGA對體外培養成骨細胞骨相關基因mRNA表達的影響

骨生長期間，一系列骨相關基因的表達水平能反映出成骨細胞的成骨活性狀況.本研究結果中，bHGA對成骨細胞的堿性磷酸酶mRNA表達具有一定的抑制作用(見圖4).培養8d和16 d后，各實驗組的堿性磷酸酶mRNA均顯著低于對照組(p<0.05，p<0.01，見圖4a).bHGA對成骨細胞的I型膠原及骨鈣蛋白mRNA表達均具有顯著的促進作用(p<0.05，p<0.01)，見圖4b，4d).bHGA對骨橋蛋白mRNA的表達無顯著影響(p>0.05，見圖4c).bHGA對成骨細胞骨涎蛋白mRNA表達則具有一定時間依賴性，長時間處理(16 d)可以促進其表達(p<0.05)，短期處理(8 d)則無顯著影響(p>0.05，見圖4e).

與對照組比較，*p<0.05；**p<0.01, n=3a) 堿性磷酸酶；b) 骨鈣蛋白；c) 骨橋蛋白；d) I型膠原；e) 骨涎蛋白圖4　bHGA對體外培養成骨細胞骨相關基因mRNA表達的影響Fig.4　Effect of bHGA on bone-related mRNA expression in osteoblasts in vitro

同時，研究了bHGA對早期成骨分化相關基因Runx2、Osx及BMP2 mRNA的表達的影響(如圖5).bHGA對Runx2 mRNA表達似乎沒有影響(僅在高濃度bHGA長期處理是顯示出一定的抑制作用，如圖5a所示.與Runx2不同，bHGA對OsxmRNA表達具有顯著的抑制作用，如圖5b所示.bHGA對BMP2 mRNA的影響具有一定的時間依賴性，2 μM及4 μM bHGA長期處理可以一定程度上提高BMP2的表達，如圖5c所示.

a)Runx2；b)Osx；c)BMP2與對照組比較，*p<0.05,**p<0.01, n=3圖5　bHGA對體外培養成骨細胞成骨分化相關基因表達的影響Fig.5　Effect of bHGA on expression of osteogenic differentiaton-related genes in osteoblasts in vitro

3討論

生物體內成骨細胞的發育分為3個階段：前成骨細胞的分化階段(Runx2和Osterix參與)，骨基質形成階段(APL，Col1，OPN，OCN和BSP等參與)和骨基質礦化階段.在骨細胞成熟階段中，骨相關基因的表達對骨基質和骨基質鈣化的形成起著關鍵性的作用[9,10].

Runx2和Osx是早期骨原細胞分化為成骨細胞過程中的兩個關鍵基因[11,12].Runx2通過結合到Osx基因的啟動子上，促進MSC(間充質干細胞)表達Osterix，最終使MSC分化為前成骨細胞或骨細胞[13].Osterix是一種成骨細胞特異性轉錄因子，它只在骨組織發育階段和成骨細胞中表達[14].本研究中, bHGA對Runx2基因mRNA表達影響不大，但是對Osx的表達具有一定的抑制作用，這表明bHGA是不利于充質干細胞分化形成早期成骨細胞，具體作用機制尚不明確.

骨相關基因在骨基質形成過程中起著關鍵作用[15].本研究發現，bHGA顯著的促進I型膠原和骨鈣蛋白的表達.I型膠原是骨的主要有機成分，骨鈣蛋白也是成骨晚期表達的主要成分之一[16].因此，bHGA對于成骨晚期具有顯著的促進作用.

堿性磷酸酶活性是早期成骨細胞的標志之一[17]，在成骨早期高度表達，隨后會逐漸降低表達水平.在研究bHGA對堿性磷酸酶mRNA表達的影響時發現，bHGA對堿性磷酸酶mRNA具有顯著的抑制作用，但bHGA對成骨細胞堿性磷酸酶活性無明顯影響.說明bHGA可能通過調控堿性磷酸酶mRNA表達之外的其他途徑調控堿性磷酸酶活性.

綜上研究結果表明：bHGA對成骨的晚期，即骨基質的形成和鈣化具有顯著的促進作用，但是在其應用的早期會對基質干細胞向成骨細胞分化，以及成骨細胞早期的活性有一定的不利影響.

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Effects of bHGA on Activity of Cultured Osteoblastsinvitro

WangChaoyuan,LiuLiangliang

(College of Life Sciences, South-Central University for Nationalities, Wuhan 430074, China)

AbstractTo study the potential osteogenetic activity of 12b-hydroxy-des-D-garcigerr in A (bHGA)invitro, MC3T3-E1 was treated with bHGA and the alkaline phosphatase activity, mineralization, the expression of bone-related genes and the early osteogenic differentiation-related genes of MC3T3-E1 cells were measured. The results showed that the mRNA expression ofRunx2 was generally not affected by bHGA, however, it inhibited the mRNA expression ofOsx. bHGA promoted the expression ofOCNandCol1 but inhibited the mRNA expression ofAPL.OPNexpression was not affected by bHGA. Our study demonstrated that bHGA was not conductive to the early differentitation of bone, while it might stimulate bone maturation by enhancingOCNandCol1 mRNA expression.

Keywords12b-hydroxy-des-D-garcigerrin A; osteogenic activity; bone-related genes; osteogenic differentiation-related genes

收稿日期2015-12-09

作者簡介王朝元(1964-),男，教授,博士,研究方向:生物醫學工程,E-mail: wangchaoyuan@mail.scuec.edu.cn

基金項目湖北省自然科學基金資助項目(2013CFB450)

中圖分類號Q28

文獻標識碼A

文章編號1672-4321(2016)02-0031-05