WT1特異性CD8+T細胞治療乳腺癌的實驗研究

王新超，郝素紅，高英堂，邱麗君，趙爽，韓璐

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WT1特異性CD8+T細胞治療乳腺癌的實驗研究

王新超1，郝素紅1，高英堂2，邱麗君1，趙爽1，韓璐1

摘要：目的通過檢測Wilms'腫瘤基因1（WT1）特異性CD8+T細胞對乳腺癌細胞的殺傷活性，探討正常外周血中提取的WT1特異性CD8+T細胞用于治療乳腺癌的可行性。方法運用流式細胞儀檢測20例人白細胞抗原（HLA）-A2血清陽性健康志愿者外周血中WT1特異性CD8+T細胞的濃度，通過WT1/主要組織相容性復合體（MHC）連鎖狀多聚體磁珠分選WT1特異性CD8+T細胞并進行培養，細胞毒性實驗檢測WT1特異性CD8+T細胞的功能。結果20例HLA-A2血清陽性健康志愿者外周血中均可檢測到WT1特異性CD8+T細胞，12例健康外周血中WT1特異性CD8+T細胞的濃度＞0.5%，其中4例＞1%。WT1/MHC連鎖狀多聚體磁珠分選后，其濃度明顯增加至80%左右。WT1特異性CD8+T細胞可特異性殺傷WT1多肽負載的乳腺癌細胞株。結論健康志愿者外周血中可檢測到WT1特異性CD8+T細胞，該細胞可能對乳腺癌細胞具有特異性殺傷作用，提示WT1特異性CD8+T細胞用于乳腺癌過繼性免疫治療的可能性。

關鍵詞：乳腺腫瘤；免疫療法，過繼；CD8陽性T淋巴細胞；WT1；細胞免疫治療

乳腺癌是女性最常見的惡性腫瘤之一，其發病率在我國呈逐年上升趨勢，部分大城市報告乳腺癌占女性惡性腫瘤之首。在美國，2015年乳腺癌在女性新發癌癥病例中約占29%［1］。免疫治療是腫瘤治療的重要模式之一，其中腫瘤抗原特異性細胞毒性T細胞過繼性免疫治療備受關注。純化的腫瘤抗原特異性細胞毒性T細胞不但可以特異性殺傷腫瘤細胞，而且可以避免移植物抗宿主反應，因此，成為目前研究的焦點［2-3］。如何獲得高純度的腫瘤抗原特異性細胞毒性T細胞成為治療的關鍵。

Wilms'腫瘤基因1（WT1）是一個重要的腫瘤相關基因，在成人正常組織中含量非常低，但在急、慢性白血病和一些實體瘤中高表達，包括肺癌、乳腺癌、前列腺癌等，其在90%的乳腺癌中高表達［4-5］。WT1與惡性腫瘤的表型有關，應用反義寡聚脫氧核苷酸治療乳腺癌，可直接作用于翻譯位點，故腫瘤細胞不易逃避WT1導向的免疫治療［6］。因此，WT1特異性細胞毒性T細胞的研究和應用受到廣泛的關注。本研究從健康志愿者外周血中純化WT1特異性CD8+T細胞進行培養和增殖，通過體外實驗檢測WT1特異性CD8+T細胞殺傷乳腺癌細胞的效應。

1　材料與方法

1.1主要試劑連鎖狀多聚體試劑：包括IS緩沖液、WT1連鎖狀多聚體藻紅蛋白（phycoerythrin，PE）和主要組織相容性復合體（major histocompatibility complex，MHC）等購自德國IBA公司；抗CD8*異硫氰酸熒光素（fluorescein isothiocyanate，FITC）等抗體、BD FACS沖洗液、清理液、浸潤液以及FACS Calibur流式細胞儀均購自美國BD公司，分別儲存于4℃、-20℃和-80℃冰箱；Ficoll-Biocoll和RPMI 1640分離液購自德國生物化學AG公司；人AB白蛋白購自德國DRK公司；青霉素和鏈霉素購自天津灝洋公司。

1.2血標本外周血標本由20例人白細胞抗原（human leukocyte antigen，HLA）-A2血清陽性健康志愿者提供。外周血單核細胞由Ficoll-Biocoll分離液從血標本中分離獲得，經過臺盼藍實驗證實其存活率＞95%。外周血單核細胞可以直接用于進一步實驗，或冷凍后儲存于-80℃超低溫冷凍箱中備用。

1.3WT1特異性CD8+T細胞的檢測外周血單核細胞標本中的WT1特異性CD8+T細胞的百分比由流式細胞儀檢測，采用抗CD3*甲藻葉綠素蛋白（Peridinin-Chlorophyll-Protein，PerCP）抗體檢測T細胞，抗CD8*FITC抗體檢測CD8+T細胞，WT1連鎖狀多聚體PE檢測WT1特異性T細胞。首先，將0.75 μg連鎖狀多聚體PE和1 μg WT1/MHC加入42 μL IS緩沖液中孵育45 min，取外周血單核細胞標本，獲取細胞1×107/管，將上述將WT1/MHC準備液10 μL加入細胞中，在4℃、避光的條件下孵育45 min。其次，將抗CD3*PerCP抗體、抗CD8*FITC抗體和上述標本在4℃、避光的條件下孵育20 min。用PBS洗滌后上流式細胞儀檢測，所有標本至少收集1×106個細胞進行流式細胞分析，每一個標本都行對照實驗來定義所染細胞的屬性。為了避免死亡細胞和細胞碎片影響實驗結果，僅對淋巴細胞進行分析。

1.4WT1特異性CD8+T細胞的分選共分為3部分：準備WT1連鎖狀多聚體磁珠復合物；標記WT1特異性CD8+T細胞并運用MS磁柱將已標記的細胞和未標記的非特異性細胞分離；最后用D-Biotin試劑將連鎖狀多聚體試劑和WT1特異性CD8+T細胞分離，獲得WT1特異性CD8+T細胞。

第1部分，將50 μL連鎖狀多聚體磁珠、2 μg WT1/MHC 和90 μL IS緩沖液，在4℃和避光條件下孵育45 min后加入1 mL IS緩沖液。將MS磁柱置于磁場中，用2 mL IS緩沖液沖洗，將上述孵育后的液體注入磁柱分選，未與WT1磁珠結合的連鎖狀多聚體MHC被洗脫，WT1連鎖狀多聚體MHC-磁珠復合物滯留于MS磁柱。接著，將MS磁柱移離磁場，加入250 μL IS緩沖液洗脫并收集WT1連鎖狀多聚體磁珠復合物。將上述WT1連鎖狀多聚體磁珠復合物與2×107的單核細胞在4℃和避光條件下外周血孵育45 min，洗滌細胞，加入1 mL IS緩沖液，準備分選。

第2部分，將MS磁柱放入磁場，用3 mL IS緩沖液沖洗，將上述細胞懸液注入磁柱。然后，用1 mL IS緩沖液沖洗3次，未與WT1連鎖狀多聚體磁珠結合的細胞可通過磁柱。將磁柱移離磁場，用1 mL IS緩沖液沖洗3次，洗出已經標記的特異性細胞，收集備用。

第3部分，將上述與磁珠結合的細胞離心、混懸于2 mL IS緩沖液中，加入2 mmol/L D-Biotin在4℃和避光條件下孵育20 min后洗滌。重復上述步驟1次，之后用5 mL IS緩沖液洗滌4次，收集所得細胞。

1.5混合淋巴細胞培養將純化WT1特異性CD8+T細胞時收集的陰性細胞部分照射后，將20 μg WT1肽和2.5 mg/L β2-微球蛋白加入經過照射的1 mL含10%AB培養液的陰性細胞懸液中，在37℃孵育箱中孵化2 h，將WT1特異性CD8+T細胞與之共培養。于第1天加入2.5 mg/L白細胞介素（IL）-2和20 μg/L IL-7。第8天，將細胞取出，取2 mL IS緩沖液洗滌，然后加入200 μL IS緩沖液。如培養時間延長，可每周重復第1天的操作。

1.6細胞毒性試驗WT1特異性CD8+T細胞特異性殺傷負載WT1多肽的乳腺癌細胞毒性試驗采用羧基熒光素二醋酸鹽琥珀酰亞胺酯（carboxyfluorescein succinimidyl amino ester，CFSE）/碘化丙啶（Propidium Iodide，PI）試驗測定。具體方法是：計量4T1細胞，分對照組（A組）、未加載WT1多肽的試驗組（B組）和加載WT1多肽的試驗組（C組）3組，C組加入WT1多肽共培養2 h，之后分別加入CFSE，使CFSE終濃度達到2 μmol/L，37℃染色30 min，PBS洗3次。再與WT1特異性CD8+T細胞混合培養，37℃作用4～6 h，E∶T分別為1∶1、5∶1、10∶1、20∶1。然后，洗滌2次，PI工作液5 μL，避光30 min后上流式細胞儀檢測。CFSE、PI雙陽性的細胞為被殺傷的靶細胞，除以靶細胞總數，即為殺傷率。

2　結果

2.1正常外周血中WT1特異性CD8+T細胞的含量20例HLA-A2血清陽性健康志愿者外周血中均可檢測到WT1特異性CD8+T細胞，＞0.5%的有12例，＞1.0%的有4例，見圖1、2。

2.2混合淋巴細胞培養和WT1特異性CD8+T細胞的純化WT1多肽可以有效地促進WT1特異性CD8+T細胞增殖。流式細胞分析了混合淋巴細胞培養后第1、8、14天WT1特異性CD8+T細胞的增殖情況，結果顯示，健康志愿者的外周血中經過WT1多肽刺激后，WT1特異性CD8+T細胞的增殖最高可達10倍左右。同時，經過提純，WT1特異性CD8+T細胞的純度可從1.61%增至80.18%，最大純度增加近50倍，見圖3。

Fig.1　Frequency of WT1-specific CD8+T cells in the peripheral blood of healthy donors圖1　健康志愿者外周血中WT1特異性CD8+T細胞的含量

Fig.2　Frequency of WT1-specific CD8+T cells in the peripheral blood of 20 samples from HLA-A2 seropositive healthy donors圖2　20例HLA-A2血清陽性健康志愿者外周血中WT1特異性CD8+T細胞的含量

Fig.3　Purification of WT1-specific CD8+T cells from HLA-A2 seropositive healthy donors圖3　WT1特異性CD8+T細胞的純化

2.3WT1特異性CD8+T細胞殺傷乳腺癌細胞株的細胞毒性試驗純化的WT1特異性CD8+T細胞分別作用于加載WT1多肽的乳腺癌細胞株4T1和未加載WT1多肽的乳腺癌細胞株4T1。結果顯示，WT1特異性CD8+T細胞對WT1多肽加載的乳腺癌細胞株4T1產生明顯的殺傷效應，而對WT1多肽未加載的乳腺癌細胞株4T1的細胞毒效應不明顯，見圖4。

Fig.4　The cytotoxicity analysis of WT1-specific CD8+T cells on breast cancer cells with WT1 peptide圖4　WT1特異性CD8+T細胞對WT1多肽負載的乳腺癌細胞株4T1的細胞毒試驗

3　討論

過繼性免疫治療已經成為乳腺癌治療的重要方法之一［7-8］，其機制是移植物抗腫瘤細胞反應。獲得純化的腫瘤抗原特異性細胞毒性T細胞是提高治療效果的關鍵，同時可以減少或避免過繼性免疫治療的嚴重并發癥即移植物抗宿主反應。WT1既是目前非常被重視的靶抗原，又在乳腺癌中高表達，因此在乳腺癌的免疫治療中有重要價值［4-5，9］。因此，WT1特異性CD8+T細胞備受關注。

直接從外周血中提純抗原特異性CD8+T細胞的方法簡單、方便。Gillmore等［10］報道，通過將遞呈有WT1肽的抗原提呈細胞在體外刺激由乳腺癌轉移性淋巴結分離出的CD8細胞，能夠檢測到WT1特異性CD8+T細胞。Weber等［11］卻從患者和健康志愿者外周血中，經過體外WT1肽的刺激、混合淋巴細胞培養和細胞克隆得到了WT1特異性CD8+T細胞。但WT1抗原特異性CD8+T細胞在外周血中含量很低，其檢測和純化方法的選擇尤為重要。

本研究結果顯示，所有健康者外周血中均可檢測到WT1特異性CD8+T細胞，12例健康外周血中WT1特異性CD8+T細胞的含量＞0.5%，其中4例含量＞1%。本研究運用了連鎖狀多聚體技術，其檢測抗原特異性CD8+T細胞已經達到藥品生產質量管理規范（GMP）水平［12］，其優勢是不但可以檢測抗原特異性的T細胞，而且可將試劑從抗原特異性T細胞分離，保持了特異性T細胞原有的功能特性［13］。連鎖狀多聚體技術純化的WT1特異性CD8+T細胞的功能狀態也得到了檢驗，其純化的WT1特異性CD8+T細胞的免疫表型為CD45RA+CCR7-，證實了其為效應T細胞的功能狀態［14］，對腫瘤細胞具有潛在的殺傷效應。

為了獲得高純度的WT1特異性CD8+T細胞，本研究進行了細胞增殖培養和純化，結果顯示，健康志愿者的外周血中經過WT1多肽刺激后，WT1特異性CD8+T細胞的增殖最高可達10倍左右。同時，提純后WT1特異性CD8+T細胞的純度可從1.61%增至80.18%，最大純度增加近50倍，這為腫瘤抗原特異性T細胞的免疫治療提供了保障。

WT1特異性CD8+T細胞的免疫表型證實了其對腫瘤細胞具有潛在的殺傷效應［14］。為了進一步檢測其細胞毒性，本研究進行了CFSE/PI試驗，結果顯示，WT1特異性CD8+T細胞對WT1多肽加載的乳腺癌細胞株4T1產生明顯的殺傷效應，而對WT1多肽未加載的乳腺癌細胞株4T1的細胞毒效應不明顯，提示這些殺傷乳腺癌細胞的毒性效應是通過HLA-A2提呈腫瘤細胞內源性WT1多肽，被T細胞表面的WT1特異性T細胞受體特異性識別來完成的。

綜上所述，本研究從健康志愿者外周血中檢測、培養并純化了WT1特異性CD8+T細胞，通過細胞毒性試驗探討了其對乳腺癌細胞的殺傷效應，這將為乳腺癌過繼性免疫治療提供依據。當然這還需要臨床試驗來驗證，其安全性也有待于進一步研究驗證。

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（2015-11-26收稿2016-01-14修回）

（本文編輯陳麗潔）

Experimental study of WT1 specific CD8+T cells in the treatment of breast cancer

WANG Xinchao1，HAO Suhong1，GAO Yingtang2，QIU Lijun1，ZHAO Shuang1，HAN Lu1
1 Department of Breast and Thyroid，the Fourth Central Hospital of Tianjin，Tianjin 300140，China；2 The Third Central Hospital of Tianjin Corresponding AuthorE-mail:xin-c@hotmail.com

Abstract：ObjectiveTo investigate the feasibility of Wilms'tumor gene 1（WT1）-specific CD8+T cells from peripheral blood for the treatment of breast cancer by detecting the killing activity of WT1 specific CD8+T cells on breast cancer cells.MethodsFlow cytometry was used to detect WT1-specific CD8+T cells in the peripheral blood of 20 samples from HLA-A2 seropositive healthy donors，which were isolated by WT1/MHC streptamer magnetic beads and cultured.The function of WT1-specific CD8+T cells were analysis by cytotoxicity assay.ResultsTwelve of 20 healthy donors had naive WT1-specific CD8+T-cell frequencies of＞0.5%，and 4 of 20 even＞1.0%of all CD8+T cells.After positive selection by magnetic cell separation，a purity of up to 80%can be achieved.WT1 specific CD8+T cells can specifically kill breast cancer cell line with WT1 polypeptide.ConclusionWT1 specific CD8+T cells can be detected in peripheral blood of healthy volunteers.WT1 specific CD8+T cells have killing effect on breast cancer cells，suggesting the feasibility of adoptive immunotherapy for breast cancer.

Key words：breast neoplasms；immunotherapy，adoptive；CD8-positive T-lymphocytes；Wilms'tumor gene 1；cell immunotherapy

中圖分類號：R737.9

文獻標志碼：A

DOI：10.11958/20150353

基金項目：天津市衛生行業重點攻關項目（12KG109）

作者單位：1天津市第四中心醫院（郵編300140）；2天津市第三中心醫院

作者簡介：王新超（1969），男，主任醫師，醫學博士，主要從事甲狀腺、乳腺疾病和腫瘤免疫治療方面的研究

通訊作者E-mail:xin-c@hotmail.com