SH-SY5Y細胞中過表達RIPK3對ZFP36基因轉錄的影響

張國祿，程世翔，徐忠偉，衣泰龍，廖吉連，涂悅，張賽

?

細胞與分子生物學

SH-SY5Y細胞中過表達RIPK3對ZFP36基因轉錄的影響

張國祿1，程世翔1，徐忠偉2，衣泰龍1，廖吉連1，涂悅1，張賽1

摘要：目的探討SH-SY5Y細胞中受體相互作用蛋白激酶-3（RIPK3）下游信號通路及其中的關鍵信號分子的作用。方法通過質粒轉染的方式在實驗組SH-SY5Y細胞內表達外源性RIPK3蛋白，將轉染空載質粒載體SHSY5Y細胞作為對照組。通過觀察質粒所攜帶的綠色熒光蛋白（GFP）在細胞中的表達情況以驗證轉染結果，Western blot對外源性RIPK3表達進行驗證。MTT法檢測細胞增殖活性，觀察過表達RIPK3對細胞活性的影響，以確認其在細胞內是否具有生物活性。運用轉錄組測序技術（RNAseq）分別檢測2組細胞內基因轉錄豐度并應用Ingenuity Pathway Analysis（IPA）數據庫進行分析，獲得RIPK3下游信號通路及關鍵分子。通過微滴式數字化PCR（ddPCR）對部分RNAseq結果進行驗證。結果外源性RIPK3在細胞內具有生物活性，能夠抑制SH-SY5Y細胞的增殖。RNAseq數據經IPA分析后得出鋅指蛋白36（ZFP36）為RIPK3下游效應分子，其相關效應分子包括血管內皮生長因子（VEGF）、人脫帽酶2（DCP2）、腦源性神經營養因子（BDNF）、腫瘤壞死因子（TNF）的轉錄豐度也發生了相應的變化。結論RIPK3能夠參與對ZFP36以及與其相關效應分子的轉錄調控，進而在神經系統的發育、炎癥和腫瘤發生等生理、病理過程中發揮重要作用。

關鍵詞：神經母細胞瘤；細胞系，腫瘤；鋅指；基因表達調控；血管內皮生長因子類；腦源性神經營養因子；腫瘤壞死因子類；受體相互作用蛋白激酶-3；鋅指蛋白36；人脫帽酶2

受體相互作用蛋白激酶-3（receptor-interacting protein kinase 3，RIPK3）是受體相互作用蛋白家族（receptor-interacting protein kinases，RIPs）的重要成員。作為同族蛋白受體相互作用蛋白激酶-1（receptor-interacting protein kinase 1，RIPK1）重要的下游效應分子，激活狀態下的RIPK3能夠調控組織細胞的凋亡、程序性壞死及炎癥的發生［1］。RIPK3在丘腦、黑質、胼胝體、殼核、脊髓和延髓中表達水平較高，提示RIPK3可能在神經系統的發育和疾病進程中發揮著特殊的作用。鋅指蛋白36（Znic finger protein 36，ZFP36）是一種RNA結合蛋白，能夠識別多種神經元轉錄產物，并調節mRNA的穩定性，在神經系統的發育、功能、炎癥等各種生理、病理過程中發揮著重要的作用［2］。本實驗中發現了RIPK3下游信號分子ZFP36以及相關信號通路，為RIPK3的研究開拓了新方向。

1　材料與方法

1.1材料 （1）細胞。人神經母細胞瘤細胞系SH-SY5Y購自ATCC。（2）主要儀器。倒置顯微鏡及激光共聚焦顯微鏡（Leica公司），Thermo Scientific CO2培養箱（Thermo公司），電子天平（METTLER TOLEDO公司），蛋白垂直電泳和轉膜系統、QX200微滴式數字化PCR（droplet digital PCR，ddPCR）系統（Bio-Rad公司），凝膠成像系統（GE公司）。（3）主要試劑。DMEM/F12培養基、胎牛血清購自Gibco公司；pCMV6-ACGFP質粒購自OriGene公司；質粒提取試劑盒、cDNA合成試劑盒購自TIANGEN公司；Lipofectamine 3000購自Life公司；Western blot一抗兔抗GAPDH、小鼠抗RIPK3購自Abcam公司；羊抗兔、羊抗小鼠二抗購自KPL公司；G418、TRIzol購自Invitrogen公司；QX200 ddPCR EvaGreen Supermix購自Bio-Rad公司。

1.2方法

1.2.1細胞培養SH-SY5Y培養于含有10%FBS、100 U/mL氨芐青霉素、100 mg/L鏈霉素的DMEM∶F12=1∶1培養基中，培養環境為37℃、5%CO2、飽和濕度，0.25%胰酶-EDTA消化傳代。當細胞處于對數生長期時用于實驗。

1.2.2質粒擴增與細胞轉染質粒轉化DH5-α感受態大腸桿菌進行篩選和擴增，按照試劑盒所提供的標準實驗步驟提取質粒，SH-SY5Y細胞匯合度約50%時采用Lipofectamine 3000進行轉染，步驟參照所附說明書。轉染48 h后用G418濃度為1 000 mg/L的完全培養基進行篩選，獲得穩定過表達RIPK3的細胞株，繼而使用G418濃度為800 mg/L的完全培養基維持培養，激光共聚焦顯微鏡觀察，確認綠色熒光蛋白（green fluorescent protein，GFP）表達情況。實驗組細胞轉染攜帶有RIPK3過表達基因的質粒，對照組細胞轉染空載質粒。

1.2.3Western blot取對數生長期的細胞，加入RIPA裂解后超聲裂解，離心收集上清，加入Loading buffer后變性。每泳道25 μg加入到10%的SDS-PAGE凝膠中電泳，將蛋白轉印于硝酸纖維素膜上，5%脫脂奶粉封閉1 h，一抗4℃孵育過夜，洗膜，二抗室溫孵育2 h，再次洗膜。滴加ECL發光液在凝膠成像系統中顯影。以GAPDH作為內參。

1.2.4MTT細胞增殖實驗細胞以5×104/mL的密度接種于96孔板，每個時間點設5個復孔，常規培養。在檢測時間點向培養孔中加入MTT，細胞培養箱中孵育4 h，檢測光密度（OD）值，實驗重復5次。計算過表達RIPK3的實驗組相對細胞存活率=（實驗組OD值/對照組OD值）×100%。

1.2.5轉錄組測序技術（RNAseq）及數據分析提取細胞RNA，質控檢測確認符合實驗要求。富集mRNA并合成cDNA，純化、修復與修飾后，富集所需cDNA文庫，定量并行RNAseq測序。計算出基因RPKM值（The value for reads per kilobase of coding sequence per million mapped reads）代表當前條件下基因轉錄豐度［3］。測序結果用Ingenuity Pathway Analysis（IPA）對基因表達差異進行分析，獲得RIPK3下游信號通路及處于關鍵位置的效應分子轉錄豐度。轉錄豐度=（目的基因RPKM/GAPDH基因RPKM）×100%。

1.2.6微滴式數字化PCR（ddPCR） 將RNA反轉錄為cDNA。按照實驗要求構建反應體系，微滴化后擴增，反應條件為：95℃預變性5 min；95℃變性15 s，50℃退火1 min，72℃延伸40 s，40個擴增循環；最后90℃維持5 min以穩定微滴。QX200微滴讀取儀中對陰性/陽性微滴進行計數，用QuantaSoft（1.3.2.0）軟件進行數據分析，得到目的基因的絕對濃度（copies/μL），以GAPDH為內參進行校正后計算實驗組相對轉錄豐度=（實驗組轉錄豐度/對照組轉錄豐度）×100%。引物序列參照表1。

Tab.1　The droplet digital PCR oligonucleotide sequences表1　ddPCR引物序列

1.3統計學方法采用IBM SPSS Statistics 19.0軟件對數據進行統計學分析，實驗結果用均數±標準差（x±s）表示，組間比較采用獨立樣本t檢驗，P＜0.05為差異有統計學意義。

2　結果

2.1外源性RIPK3在實驗組細胞內穩定表達轉染后細胞在激光共聚焦顯微鏡下觀察，2組細胞在激發光照射下發射綠色熒光，說明質粒序列成功插入到細胞基因組中，見圖1。Western blot結果顯示，實驗組在RIPK3抗體的標記下出現2個條帶，細胞內源性RIPK3分子質量為56 ku，實驗組外源性RIPK3與GFP融合，分子質量為85 ku。質粒攜帶的外源性RIPK3蛋白在SH-SY5Y細胞中穩定表達，見圖2。

Fig.1　The morphology of two groups of cells under confocal laser scanningmicroscope（×200）圖1　激光共聚焦顯微鏡下觀察2組細胞（×200）

Fig.2　The expression of RIPK3 in cells圖2　RIPK3在細胞中表達情況

2.2外源性 RIPK3對SH-SY5Y細胞活性的影響MTT結果顯示：12、20、28、36、44 h時點實驗組細胞活性明顯低于對照組（n=5，t分別為6.717、5.094、14.900、11.914、23.903，均P＜0.01），見圖3。

Fig.3　The effect of RIPK3 on cell viability圖3　RIPK3對細胞活性的影響

2.3ZFP36是RIPK3的下游效應分子IPA對RNAseq測序數據分析得到RIPK3下游信號通路，以及其中的關鍵效應分子ZFP36。相對于對照組，實驗組 ZFP36轉錄豐度發生上調（4.36%vs. 7.89%）。ddPCR檢測cDNA樣本中GAPDH與ZFP36基因絕對濃度，見圖4，以GAPDH作為內參進行校正后計算得到實驗組相對于對照組ZFP36轉錄豐度為（177.29±9.81）%（n=3，t=13.644，P＜0.01）。ZFP36相對轉錄豐度差異與RNAseq結果基本一致。

Fig.4　Concentrations of GAPDH and ZFP36 in cDNA samples圖4　cDNA樣本中GAPDH與ZFP36濃度

2.4RIPK3對ZFP36下游效應分子的影響從IPA對RNAseq數據分析結果中遴選出ZFP36下游的效應分子，以GAPDH為內參進行校正，結果提示RIPK3對這些ZFP36下游效應分子血管內皮生長因子（vascular endothelial growth factor，VEGF）、人脫帽酶2（mRNA-decapping enzyme 2，DCP2）、腦源性神經營養因子（brain derived neurotrophic factor，BDNF）、腫瘤壞死因子（tumor necrosis factor，TNF）的轉錄豐度產生了明顯的影響，見圖5。

Fig.5　ZFP36 downstream signalingmolecule transcription levels圖5　ZFP36下游效應分子的轉錄豐度

3　討論

近年來，RIPK3越來越受到科研人員的重視，但研究方向主要局限于凋亡、壞死性凋亡及炎癥發生等相關信號通路，RIPK3在神經系統中所發揮的作用及信號通路尚待探索。本實驗以SH-SY5Y為基礎建立RIPK3過表達神經元模型［4-5］，MTT結果證明外源性的RIPK3在細胞內具有生物學活性，表現為抑制細胞活性，后續實驗充分利用了RNAseq實驗與IPA高通量、高敏感度的特點，對細胞基因的整個轉錄組mRNA進行檢測及分析，實驗過程中經過多重質控檢測以確保數據準確可靠。本研究采用Bio-Rad公司最新的第3代PCR技術進行精確的絕對定量［6］，實驗結果與RNAseq結果保持高度一致，保證了實驗具有較強的可重復性［7］。本研究經分析得出SH-SY5Y細胞內RIPK3下游存在以ZFP36為核心的信號通路。

ZFP36是一種RNA結合蛋白，能夠促進3′端非編碼區富含AU堿基（AU-rich elements，AREs）的mRNAs快速降解［8］。其自身未被發現具有mRNA酶活性，但是其與幾種細胞mRNA降解機制中部分酶的活性相關，包括脫腺苷酶、脫帽因子及核酸外切酶，從而激活目標mRNA的降解［9］。mRNA的降解能夠抑制蛋白質的過量表達、促進核苷酸的降解，在細胞代謝中發揮著核心作用。對含有ARE的mRNA的轉錄后調控是一個非常復雜的過程。預計哺乳動物體內超過8%的mRNA含有ARE，其中很大一部分編碼的是具有高度調控作用的細胞因子，包括細胞因子、生長因子、轉錄因子以及早期反應基因［10］。

本研究不僅證實處于RIPK3下游潛在的重要信號分子ZFP36，更通過分析得出了部分轉錄豐度發生明顯改變的信號分子。ZFP36在體內特別是神經系統中具有十分廣泛的作用。在對惡性膠質瘤細胞的研究中，ZFP36誘導的mRNA降解能夠導致明顯的具有劑量依賴性的VEGF mRNA的改變，同時證實ZFP36的異位表達能夠通過干擾VEGF從而發揮生長抑制作用［11］。ZFP36能夠直接在mRNA水平調節BDNF，進而起到調節中樞神經系統的發育和功能、神經炎癥、肌源性分化以及修復［12］；同時，ZFP36能夠直接動員并激活DCP2，并在其協助下完成對含有ARE結構的mRNA發揮脫帽作用，以促進其降解［13］。ZFP36的靶基因包括編碼RNA結合蛋白（RNA-binding proteins，RBPs）的mRNA，包括Hu/Elavl和Nova家族，而這些蛋白在神經系統的發育和功能中具有重要的作用，同時也是重要的神經標志物［14］。在神經分化過程中減少ZFP36的表達有助于神經系統中3′端延長的mRNA多聚腺苷化亞型的產生［15］。綜上，可以認為RIPK3能夠通過對ZFP36的調節在神經系統腫瘤、炎癥、修復以及發育過程中發揮重要的作用。

由于受到各種條件的約束，本研究僅驗證了RIPK3過表達對ZFP36及其下游效應分子基因轉錄豐度的影響，并根據相關研究結果對其可能造成的下游效應進行合理的推測，并未對具體的相互作用關系進行進一步探究及闡述，需要在后續的實驗中對其進行進一步完善。

參考文獻

［1］Moriwaki K，Chan FK.RIP3：a molecular switch for necrosis and inflammation［J］.Genes Dev，2013，27（15）：1640-1649.doi：10.1101/gad.223321.113.

［2］Dai W，Li W，Hoque M，et al.A post-transcriptional mechanism pacing expression of neural genes with precursor cell differentiation status［J］.Nat Commun，2015，6：7576.doi：10.1038/ncomms8576.

［3］Mortazavi A，Williams BA，McCue K，et al.Mapping and quantifying mammalian transcriptomes by RNA-Seq［J］.Nat Methods，2008，5（7）：621-628.doi：10.1038/nmeth.1226.

［4］Liu Y，Zhang RY，Zhao J，et al.Ginsenoside Rd protects SH-SY5Y cells against 1-Methyl-4-phenylpyridinium induced injury［J］.Int J Mol Sci，2015，16（7）：14395-14408.doi：10.3390/ijms160714395.

［5］Kwon B，Gamache T，Lee HK，et al.Synergistic effects of β-amyloid and ceramide-induced insulin resistance on mitochondrial metabolism in neuronal cells［J］.Biochim Biophys Acta，2015，1852 （9）：1810-1823.doi：10.1016/j.bbadis.2015.05.012.

［6］Pinheiro LB，Coleman VA，Hindson CM，et al.Evaluation of a droplet digital polymerase chain reaction format for DNA copy number quantification［J］.Anal Chem，2012，84（2）：1003-1011.doi：10.1021/ac202578x.

［7］Hindson CM，Chevillet JR，Briggs HA，et al.Absolute quantification by droplet digital PCR versus analog real-time PCR［J］.Nat Methods，2013，10（10）：1003-1005.doi：10.1038/nmeth.2633.

［8］Brooks SA，Blackshear PJ.Tristetraprolin（TTP）：interactions withmRNA and proteins，and current thoughts on mechanisms of action ［J］.Biochim Biophys Acta，2013，1829（6/7）：666-679.doi：10.1016/j.bbagrm.2013.02.003.

［9］Komnenov D，Scipione CA，Bazzi ZA，et al.Pro-inflammatory cytokines reduce human TAFI expression via tristetraprolin-mediated mRNA destabilisation and decreased binding of HuR［J］.Thromb Haemost，2015，114（2）：337-349.doi：10.1160/TH14-08-0653.

［10］Shu M，Taddeo B，Roizman B.Tristetraprolin recruits the herpes simplex virion host shutoff RNase to AU-rich elements in stress response mRNAs to enable their cleavage［J］.J Virol，2015，89（10）：5643-5650.doi：10.1128/JVI.00091-15.

［11］Xiao J，Gao H，Jin Y，et al.The abnormal expressions of tristetraprolin and the VEGF family in uraemic rats with peritoneal dialysis［J］. Mol Cell Biochem，2014，392（1/2）：229-238.doi：10.1007/ s11010-014-2033-3.

［12］Kumar A，Varendi K，Peranen J，et al.Tristetraprolin is a novel regulator of BDNF［J］.Springerplus，2014，3：502.doi：10.1186/2193-1801-3-502.

［13］Kim CW，Kim HK，Vo MT，et al.Tristetraprolin controls the stability of cIAP2 mRNA through binding to the 3′UTR of cIAP2 mRNA ［J］.Biochem Biophys Res Commun，2010，400（1）：46-52.doi：10.1016/j.bbrc.2010.07.136.

［14］Ince-Dunn G，Okano HJ，Jensen KB，et al.Neuronal Elav-like （Hu）proteins regulate RNA splicing and abundance to control glutamate levels and neuronal excitability［J］.Neuron，2012，75（6）：1067-1080.doi：10.1016/j.neuron.2012.07.009.

［15］Miura P，Sanfilippo P，Shenker S，et al.Alternative polyadenylation in the nervous system：to what lengths will 3′UTR extensions take us？［J］.Bioessays，2014，36（8）：766-777.doi：10.1002/bies.201300174.

（2015-09-10收稿2015-10-28修回）

（本文編輯李國琪）

The effects of RIPK3 overexpression on the transcription of ZFP36 gene in SH-SY5Y cells

ZHANG Guolu1，CHENG Shixiang1，XU Zhongwei2，YI Tailong1，LIAO Jilian1，TU Yue1，ZHANG Sai1
1 Tianjin Key Laboratory of Neurotrauma Repair，Institute of Traumatic Brain Injury and Neuroscience of Chinese Armed Police Forces（CAPF），Neurology&Neurosurgery Hospital of CAFP，Tianjin 300162，China；2 Center Laboratory of Logistics University of CAPF Corresponding AuthorE-mail：ytumail@vip.126.com；zhangsai718@vip.126.com

Abstract：ObjectiveTo investigate the signalingpathway and the key signal molecules of protein kinase（RIPK）3 in SHSY5Y cells.MethodsSH-SY5Y cells were transfected with RIPK3 expression plasmid vector to upregulate intracellular RIPK3，while the SH-SY5Y cells were transfected with empty vector plasmid，which was considered as control group.Western blot assay was used to check the expression of exogenous RIPK3 in cells.The proliferation rate of SH-SY5Y cells was determined by MTT assay at designated time to detect exogenous RIPK3 activity.Whole transcriptome sequencing（RNAseq）was used to detect the transcription of genes.Whole-transcriptomic gene transcription was measured by following Ingenuity Pathway Analysis（IPA）to obtain downstream signaling pathways and the key molecule，which were partly confirmed by following droplet digital PCR （ddPCR）.ResultsExogenous RIPK3 showed biological activity in SH-SY5Y，which inhibited the proliferation of cells.IPA showed that znic finger protein 36（ZFP36）was significantly up-regulated as compared with that of the control group.The transcription levels of ZFP36 downstream genes such as tumor necrosis factor（TNF），brain derived neurotrophic factor（BDNF），vascular endothelial growth factor（VEGF）and mRNA-decappingenzyme 2（DCP2）were affected at the same time.ConclusionWithin the limitations of this study，it seems that RIPK3 is notable for the development，inflammation and tumorigenesis of the nervous system as an independent regulator of ZFP36 gene and downstream effectors.

Key words：neuroblastoma；cell line，tumor；zinc fingers；gene expression regulation；vascular endothelial growth factors；brain-derived neurotrophic factor；tumor necrosis factors；receptor-interacting protein kinase 3；znic finger protein 36；mRNA-decappingenzyme 2

中圖分類號：R34

文獻標志碼：A

DOI：10.11958/20150166

基金項目：國家自然科學基金資助項目（31200809）；武警部隊后勤科研項目（WJHQ2012-20）；武警后勤學院科研創新團隊（WHTD201306）

作者單位：1天津市神經創傷與修復重點實驗室，武警部隊腦創傷與神經疾病研究所，武警后勤學院附屬醫院腦科醫院（郵編300162）；2武警后勤學院中心實驗室

作者簡介：張國祿（1990），男，碩士在讀，主要從事神經外科學研究

通訊作者E-mail:ytumail@vip.126.com；zhangsai718@vip.126.com