二氫楊梅素對巨噬細胞源性泡沫細胞膽固醇流出的影響

陳璐，周潔，廖宏慶，李國術，鐘惠娟，張濤

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二氫楊梅素對巨噬細胞源性泡沫細胞膽固醇流出的影響

陳璐1，周潔2，廖宏慶3，李國術4，鐘惠娟1，張濤3

摘要：目的觀察二氫楊梅素（DMY）對鼠源巨噬細胞性泡沫細胞膽固醇流出的影響并探討其可能機制。方法用50 mg/L的氧化低密度脂蛋白（ox-LDL）孵育鼠源性巨噬細胞RAW264.7經48 h誘導細胞泡沫化。將泡沫細胞分為對照組（只加RPMI 1640的培養基培養）和DMY1～4組（分別用10、20、40和80 μmol/L DMY處理），培養24 h。采用［3H］標記的膽固醇檢測細胞膽固醇的流出率，高效液相色譜測定細胞內游離膽固醇（FC）、膽固醇酯（CE）和總膽固醇（TC）的水平，Western blot檢測細胞中三磷酸腺苷結合盒轉運體A1（ABCA1）的表達。結果與對照組比較，20、40和80 μmol/L DMY組細胞的膽固醇流出率均顯著增加，細胞內FC、TC和CE水平及CE/TC的比值均顯著減少，ABCA1的表達顯著上調，均呈劑量依賴性（均P＜0.05）。與對照組比較，DMY（10 μmol/L）組細胞膽固醇流出率，細胞內FC、TC和CE水平，ABCA1的表達差異均無統計學意義（均P＞0.05）。結論DMY促進了鼠源巨噬細胞性泡沫細胞膽固醇流出，其機制可能與上調泡沫細胞中ABCA1的表達有關。

關鍵詞：動脈粥樣硬化；泡沫細胞；巨噬細胞；膽固醇；疾病模型，動物；二氫楊梅素；膽固醇流出；三磷酸腺苷結合盒轉運體A1

二氫楊梅素（dihydromyricetin，DMY）是一種二氫黃酮醇類化合物，是民間古茶藤茶中總黃酮的主要成分之一［1］。研究表明，DMY藥理作用廣泛，具有抗菌消炎、抗氧化、抗腫瘤、降血糖和保護肝腎功能等作用［2-3］。最近的研究表明，DMY可降低動脈粥樣硬化（artherosclerosis，AS）大鼠的血脂水平，改善其血流動力學，抑制大鼠主動脈弓炎癥因子的表達，對AS具有防治作用［4-5］。泡沫細胞膽固醇逆向轉運（reverse cholesterol transport，RCT）障礙是AS形成的重要病理生理學基礎［6］。DMY是否通過影響泡沫細胞的RCT而發揮抗AS的作用，目前尚未明確。因此，本研究擬采用氧化低密度脂蛋白（oxidized low density lipoprotein，ox-LDL）孵育鼠源性巨噬細胞建立泡沫細胞模型，觀察DMY對泡沫細胞膽固醇流出的影響，并探討其可能的作用機制，以期為AS的防治提供參考。

1　材料與方法

1.1細胞和試劑RAW264.7鼠源性單核巨噬細胞系購自中國科學院細胞庫。DMY購自成都曼斯特生物科技公司。RPMI 1640培養基、小牛血清、胰酶、四乙酸乙二胺購自Invitrogen公司。［3H］標記的膽固醇購自中國原子能研究院同位素研究所。BCA蛋白定量試劑盒購自Invitrogen公司。兔抗小鼠三磷酸腺苷結合盒A1（ATP binding cassette A1，ABCA1）一抗和辣根過氧化物酶標記的二抗均購自美國SantaCruz公司。LS 6500型液體閃爍計數儀為美國貝克曼庫爾特公司產品。健康人血漿購自廣東省廣州市中心血站。

1.2巨噬細胞的培養和分組用含10%胎牛血清的RPMI 1640的培養液培養RAW264.7細胞。當細胞的生長融合度達到60%～70%時，加入50 mg/L ox-LDL繼續培養48 h，使細胞轉化為泡沫細胞。將泡沫細胞分為5組：對照組，用RPMI 1640的培養基培養24 h；DMY1～4組，分別用10、20、40 和80 μmol/L DMY處理泡沫細胞24 h，用于后續的實驗。

1.3膽固醇流出率的測定將細胞以3.0×106個/mL接種于6孔板，培養48 h，培養液中含0.2 μCi/L［3H］標記的膽固醇、胎牛血清（體積分數5%）和ox-LDL（50 mg/L）。加入DMY處理24 h后，PBS洗3次，更換培養液為無血清含載脂蛋白A I（50 mg/L）培養液，再培養12 h。培養液和細胞中的［3H］的射線強度用液體閃爍計數儀檢測。細胞膽固醇流出率=培養液中［3H］的射線強度/（培養液+細胞）［3H］總的射線強度×100%［7］。

1.4泡沫細胞內膽固醇含量測定采用高效液相色譜分析。處理結束后收集各組細胞，用超聲破碎細胞，BCA法測定細胞溶解液的蛋白含量。加入6%三氯醋酸，再加入等體積的正己烷和異丙醇混合液（體積比為4∶1）。攪拌，15℃，2 000×g離心10 min，收集上層的有機相，65℃真空干燥。加入100 μL異丙醇、正庚烷和乙腈的混合液（體積比為35∶13∶52）。室溫下，2 000×g離心10 min，收集上清，取10 μL樣本用于高效液相色譜分析。高效液相色譜檢測中采用C18柱，流動相為異丙醇、正庚烷和乙腈混合液，柱溫為4℃，流速為1 mL/min，波長為216 nm，檢測時間為10 min。定量膽固醇時以峰面積表示，先測定出游離膽固醇（free cholesterol，FC）和總膽固醇（total cholesterol，TC）的量，膽固醇酯（cholesterol ester，CE）的量=TC的量-FC的量，以mg/g細胞蛋白為測量單位。

1.5Western blot檢測ABCA1蛋白的表達水平收集各組細胞，提取細胞的總蛋白，BCA法測量樣本的蛋白濃度。取樣本50 μg，加入到2×SDS凝膠加樣緩沖液中，煮沸。進行SDS-聚丙烯酰胺凝膠電泳，將蛋白分離。采用轉膜儀將蛋白樣本轉移到聚偏氟乙烯（PVDF）膜上，麗春紅染色觀察蛋白轉移效果。用10%脫脂奶粉孵育PVDF膜2 h。加入一抗工作液，其中含兔抗鼠ABCA1（1∶200）和β-actin（1∶200）抗體，4℃過夜。TBST液洗3次，加入辣根過氧化物酶標記的二抗，4℃孵育4 h。TBST液洗3次，采用蛋白質印跡熒光檢測試劑盒曝光于X線片上，膠片經顯影和定影處理后，采用凝膠圖像分析系統對膠片進行掃描，以β-actin為內參，通過測量條帶灰度值對結果進行半定量分析。實驗操作參照文獻［8］，實驗重復3次。

1.6統計學方法采用SPSS 18.0統計軟件進行統計分析。符合正態分布的計量資料用x±s表示，多組間均數比較采用單因素方差分析，組間多重比較采用LSD-t檢驗。P＜0.05為差異有統計學意義。

2　結果

2.1DMY對泡沫細胞膽固醇流出率的影響對照組、DMY1～4組泡沫細胞膽固醇的流出率（%）分別為14.75±1.37、16.24±1.78、28.39±2.41、36.52±2.15 和44.03±3.61（F=5.79，P＜0.05）。與對照組相比，DMY 2、3和4組以劑量依賴的方式顯著增加了泡沫細胞的膽固醇流出率（均P＜0.05）。DMY1組泡沫細胞的膽固醇流出率與對照組差異無統計學意義（P＞0.05）。

2.2DMY對泡沫細胞內膽固醇含量的影響與對照組相比，DMY 2、3和4組細胞內TC、FC和CE含量以及CE/TC的比值均降低，呈現劑量依賴性（均P＜0.05）。DMY1組細胞內FC、TC和CE含量以及CE/TC的比值與對照組差異無統計學意義（P＞0.05），見表1。

Tab.1　Effects of DMY on the level of cholesterol in foam cells表1　DMY對泡沫細胞膽固醇含量的影響?。╪=30，±s）

Tab.1　Effects of DMY on the level of cholesterol in foam cells表1　DMY對泡沫細胞膽固醇含量的影響　（n=30，±s）

＊P＜0.05；a與對照組比較，b與DMY1組比較，c與DMY2組比較，d與DMY3組比較，P＜0.05

組別對照組DMY1組DMY2組DMY3組DMY4組F 525.15±4.73 511.32±45.78 413.73±31.26ab321.69±35.44abc268.76±24.05abcd5.78＊196.75±17.48 195.83±16.44 183.25±14.65ab165.76±18.12abc116.12±8.57abcd4.81＊328.46±35.12 315.49±30.07 228.95±23.08ab156.57±17.34abc121.41±13.08abcd5.29＊62.54±3.81 61.71±4.63 55.34±4.27ab49.57±3.69abc45.17±4.07abcd4.14＊TC（mg/g）FC（mg/g）CE（mg/g）CE/TC（%）

2.3DMY對泡沫細胞ABCA1表達的影響對照組、DMY1～4組ABCA1蛋白的相對表達水平分別為0.11±0.02、0.13±0.03、0.28±0.03、0.37±0.05和0.46± 0.05（n=3，F=6.79，P＜0.05）。與對照組相比，DMY2、3 和4組ABCA1蛋白的表達增加，呈現劑量依賴性（均P＜0.05）。DMY1組ABCA1蛋白的表達與對照組差異無統計學意義（P＞0.05），見圖1。

Fig.1　Effects of DMY on expression of ABCA1 in foam cells圖1　DMY對泡沫細胞ABCA1表達的影響

3　討論

AS是嚴重危害人類健康的疾病之一，主要表現為動脈內膜出現脂質沉積，平滑肌細胞向內膜遷移，結締組織增生，在動脈壁上形成斑塊，進而導致血管壁增厚、管腔狹窄和血管彈性降低，如果斑塊不穩定且發生破裂即可引發急性臨床事件。AS的發病機制非常復雜，涉及飲食、年齡、環境和感染等，至今尚未闡明［9-11］。DMY在我國民間古茶藤茶中含量較高，在葡萄等水果和蔬菜中也自然存在［12］。有研究顯示，DMY能抑制大鼠主動脈弓的炎癥因子的表達［5-6］。這些研究提示DMY可能具有抗AS的作用，能在AS動物模型中抑制AS的形成。

泡沫細胞形成是AS發生的重要病理生理學基礎，在致病因素的刺激下，血液中的單核/巨噬細胞和血管壁中的平滑肌細胞遷移到血管內膜下，吞噬大量被修飾的脂蛋白，導致細胞內脂質代謝紊亂，膽固醇酯大量合成，分解減少，并以脂滴的形式存在［7，13］。DMY是否能夠影響AS的主要功能細胞——泡沫細胞中脂質水平和荷脂情況來發揮抗AS的作用，目前尚未明確。細胞內FC、TC和CE含量以及CE/TC的比值是常用來反映細胞荷脂程度或泡沫化程度的指標。本研究結果顯示，20、40和80 μmol/L的DMY處理RAW264.7巨噬細胞源性泡沫細胞24 h后，能以劑量依賴的方式降低泡沫細胞中FC、TC和CE含量以及CE/TC的比值，表明DMY能降低泡沫細胞的泡沫化程度，證實了DMY的抗AS作用。

一般情況下，平滑肌細胞和巨噬細胞能通過吞噬血管內膜下修飾的脂質，從而清除這些脂質，其本身具有積極意義，但是如何將這些攝取的脂質轉運出去很關鍵，而RCT的障礙是AS發病的關鍵環節。三磷酸腺苷結合盒（ATP-bindingcassette，ABC）轉運子超家族是目前已知的最大轉運子家族。ABC轉運子能夠把ATP作為能源，跨膜轉運糖類、氨基酸、蛋白質、膽固醇、磷脂、藥物和離子等物質［8，14］。經ABCA1轉運出的游離膽固醇和磷脂與結合到細胞表面的載脂蛋白A-1結合，形成新生的高密度脂蛋白（high density lipoprotein，HDL），完成了RCT的第一步，促進細胞內游離膽固醇和磷脂的流出。由于ABCA1在RCT和HDL生成中起到了關鍵作用，因此被稱作RCT的“守門人”［15］。研究表明，ABCA1基因突變或基因敲除均可引起AS的發生，而ABCA1的表達水平上調可減少載脂蛋白E（apolipoprotein E，apoE）敲除小鼠AS的發生，這表明ABCA1在AS的發生發展中發揮了關鍵的作用［16］。但是DMY降低泡沫細胞中脂質水平和泡沫化程度，發揮抗AS的作用是否涉及ABCA1尚未明確。本研究顯示，20、40和80 μmol/L的DMY顯著增加泡沫細胞中膽固醇的流出，顯著上調鼠源巨噬細胞性泡沫細胞中ABCA1的表達，提示DMY降低泡沫細胞中脂質水平和泡沫化程度的機制可能與DMY上調泡沫細胞中ABCA1的表達，進而增加泡沫細胞膽固醇的流出有關。然而調控ABCA1表達的機制非常復雜，肝X受體/視黃醇X受體、過氧化物酶體增殖子活化受體和cAMP等信號通路均可參與ABCA1表達的調節。因此，DMY上調ABCA1表達的具體機制還有待進一步研究。

綜上所述，DMY促進了鼠源巨噬細胞性泡沫細胞膽固醇的流出，其機制可能與上調泡沫細胞中ABCA1的表達有關。

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（2015-06-25收稿2015-11-12修回）

（本文編輯陸榮展）

Effects of dihydromyricetin on the cholesterol efflux in macrophage derived foam cells

CHEN Lu1，ZHOU Jie2，LIAO Hongqing3，LI Guoshu4，ZHONG Huijuan1，ZHANG Tao3
1 Department of Internal Cardiology，Liwan Hospital，Guangzhou Medical College，Guangzhou 510000，China；2 Department of General Surgery，the 169th Hospital of the Chinese People′s Liberation Army；3 Department of Urinary Surgery，the Second Affiliated Hospital，University of South China；4 Department of Emergency，the Central Hospital of Hengyang City Corresponding AuthorE-mail:zhonghuijuanhy@126.com

Abstract：ObjectiveTo explore the effect of dihydromyricetin（DMY）on the cholesterol efflux in macrophage derived foam cells and analyze the possible mechanisms.MethodsRAW 264.7 macrophages were incubated by oxidized low densi-ty lipoprotein（ox-LDL，50 mg/L）for 48 h to induce foam cells.Subsequently，the foam cells were subdivided into control group（RPMI1640 media）and DMY 1-4 groups（10，20，40 and 80 μmol/L）and cultured for 24 h.Cholesterol efflux from foam cells was examined by［3H］labed cholesterol.The high performance liquid chromatography assay was used to test the cellular contents of free cholesterol（FC），cholesteryl ester（CE）and total cholesterol（TC）.The expression of ATP-binding cassette transporter A1（ABCA1）was measured by Western blot assay.ResultsCompared with control group，cholesterol efflux was significantly increased，the content of FC，TC CE and CE/TC ratio were significantly decreased and expression of ABCA1 was significantly up-regulated in dose dependent manner in DMY（20，40 and 80 μmol/L）groups（P＜0.05）.There were no significant differences in cholesterol efflux，the content of FC，TC and CE，and expression of ABCA1 between control group and DMY（10 μmol/L）group of foam cells（P＞0.05）.ConclusionDMY promotes the cholesterol efflux in the macrophage derived foam cells，which may be related with the increase of ABCA1 induced by DMY.

Key words：atherosclerosis；foam cells；macrophages；cholesterol；disease models，animal；dihydromyricetin；cholesterol efflux；ABCA1

中圖分類號：R972.6，R93

文獻標志碼：A

DOI：10.11958/59120

基金項目：衡陽市科技局課題（2011KJ49）

作者單位：1廣州醫學院荔灣醫院心內科（郵編510000）；2解放軍第169醫院普外科；3南華大學附屬第二醫院泌尿外科；4衡陽市中心醫院急診科

作者簡介：陳璐（1979），女，本科，主治醫師，主要從事動脈粥樣硬化性心血管疾病的防治

通訊作者E-mail:zhonghuijuanhy@126.com