9311與日本晴間一個雜種不育基因的鑒定與定位

張宏根張麗佳孫一標 司 華 劉巧泉 湯述翥顧銘洪揚州大學江蘇省作物遺傳生理國家重點實驗室培育點 / 糧食作物現代產業技術協同創新中心 / 教育部植物功能基因組學重點實驗室，江蘇揚州225009

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9311與日本晴間一個雜種不育基因的鑒定與定位

張宏根**張麗佳**孫一標 司 華 劉巧泉 湯述翥*顧銘洪
揚州大學江蘇省作物遺傳生理國家重點實驗室培育點 / 糧食作物現代產業技術協同創新中心 / 教育部植物功能基因組學重點實驗室，江蘇揚州225009

摘 要：以克服亞種間雜種不育來充分發掘亞種間雜種優勢是提高水稻單產的一條有效途徑。本研究從一套以日本晴為背景、9311為供體的染色體片段代換系中鑒定出一個系T9424，其與日本晴配置的F1植株小穗與花粉育性較雙親顯著降低，雙親間存在不親和。重測序結果表明T9424在第1、第4和第5染色體上導入9311片段。日本晴/T9424 F2群體內單株基因型及育性鑒定結果表明，T9424與日本晴間雜種不育基因位于第5染色體上。利用F2群體內790株單株將該雜種不育基因定位于第5染色體分子標記PSM8與A14之間110 kb的物理區段內。對日本晴/T9424 F1植株花粉與胚囊育性鑒定結果表明該雜種不育基因同時控制雌、雄配子敗育，將該基因暫命名為S39（t）。相關結果有助于加深對水稻亞種間雜種不育現象的認識，為該基因克隆及其育種利用奠定基礎。

關鍵詞：水稻；雜種不育基因；基因定位

本研究由國家重點基礎研究發展計劃項目（2011CB100101）和江蘇高校優勢學科建設工程項目資助。

This study was supported by the Key Project of Chinese National Programs for Fundamental Research and Development （2011CB100101）and the Project Funded by the Priority Academic Program Development of Jiangsu Higher Education Institutions.

第一作者聯系方式∶ 張宏根，E-mail∶ zhg@yzu.edu.cn ；張麗佳，E-mail∶ 1255012022@qq.com

URL∶ http∶//www.cnki.net/kcms/detail/11.1809.S.20160322.1600.002.html

水稻秈粳亞種間雜交較品種間雜交具有更強的雜種優勢，利用秈粳亞種間雜種優勢打破限制水稻產量大幅提升的瓶頸，成為育種研究者的共識。但是秈粳亞種間遺傳距離遠，遺傳背景差異大，亞種間存在生殖隔離。根據發生時間可將其分為合子形成前的生殖隔離和合子形成后的生殖隔離，前者包括物理隔離（來自地理、生態、形態等因素）、物種間的生殖隔離、不同物種間的配子不兼容、精子沒有適合的酶穿透卵膜等導致不能形成合子的生殖隔離；后者又稱為雜交障礙，包括配子型、合子型、胚或胚囊、雜種無活、雜種不育和雜種衰敗［1-2］。造成水稻雜種不育的原因很多，包括雄配子敗育，雌配子敗育，雌、雄配子同時敗育以及其他細胞學原因，例如花藥開裂障礙、雌雄異熟、環境條件等因素對F1小穗育性的影響［3-7］。

目前，對秈粳雜種不育遺傳機理有細胞質效應［8］、染色體結構差異［9］和基因控制理論［10］3種解釋，其中基因控制理論受到國內外學者普遍支持，并定位與克隆了許多雜種不育基因，包括 S5［11］、S7［12］、S8［13］、S15［14］、S16［15］、S17［16］、S29［17］、S30［18］、S31［19］、S32［20］及S35［21］等雌配子敗育基因，Sb、Sc、Sd、Se、Sf［22-24］、S20［25］、S24［26］、S36［27］等已鑒定或定位的和Sa［28］、S27［29］、S28［29］、DPL1［30］、DPL2［30］等5個已成功克隆的雄配子敗育基因，以及S1［31-32］、S10［33］和S6［34］等控制雌、雄配子同時敗育的基因。

日本晴作為一個典型的日本粳稻品種，被廣泛用于水稻分子科學研究。9311 （揚稻6號）是由江蘇省里下河地區農業科學研究所培育的中秈品種，具強大的生物學優勢、理想的株型、優異的抗逆性、與不育系配組的高配合力，常被用于水稻育種和分子科學研究。為挖掘9311中控制產量、品質等性狀的優良等位基因，本實驗室構建了一套以日本晴為背景，9311為供體的染色體片段代換系，目前利用該套染色體片段代換系已就控制產量、品質等性狀的基因開展了廣泛研究［35］。在該套染色體片段代換系中，有一系（編號為T9424）與日本晴及部分代換系配置的 F1小穗育性在多年鑒定中均表現為部分可育，這說明 T9424與日本晴間存在不親和，初步推測是由9311與日本晴間雜種不育基因控制。

本研究以代換系T9424重測序來明確其背景中導入的9311片段，在此基礎上利用T9424與日本晴配置 F2群體對雜種不育基因精細定位，同時通過對T9424與日本晴F1花粉和胚囊的細胞學觀察確定該雜種不育基因的作用方式，相關結果為該基因克隆及育種利用研究打下基礎。

1 材料與方法

1.1 供試材料

2012年冬季在海南種植T9424與日本晴，配置日本晴/T9424 F1組合；2013年正季在揚州種植T9424、日本晴及配置的F1（分成兩份，一份種植，一份保留到次年種植），成熟時收獲日本晴/T9424組合的F2種子；2014年正季在揚州種植日本晴/T9424 F1及F2群體、BT型日本晴A及C418，以BT型日本晴A為母本，配置BT型日本晴A//日本晴/T9424三交群體，同時分別以BT型日本晴A、日本晴/T9424 F1為母本，人工剪穎后以C418為父本飽和授粉；2014年冬季在揚州溫室種植日本晴A//日本晴/T9424三交群體。

1.2 育性鑒定

每日早晨 7∶00—9∶00，從田間每個始花植株上選取一個已抽出約 1/3的主穗或較大分蘗穗。選取每個穗子中上部枝梗3朵當天要開放的穎花，用1% I2-KI液染色、壓片，在低倍顯微鏡下觀察花粉育性。根據花粉粒的形狀和對I2-KI液的染色反應，將花粉劃分為典敗、圓敗、染敗和正常 4種類型。選擇分布均勻、花粉數目超過 100粒的視野，分別記錄 4類花粉的數目，并計算4類花粉的百分率。

抽穗期間，每日上午 7∶00—9∶00，選取尚未開花的小穗套袋，每袋2穗，20 d后，剔除折斷或自交袋破損的穗子，同時選擇單株中較大的兩穗考查自然小穗育性，調查單株的套袋小穗育性與自然小穗育性。對親本及F1群體各考查5株。采用子房整體透明法觀察水稻胚囊［36］以鑒定F1雌配子育性。

1.3 DNA提取與分子標記分析

采用 CTAB法［37］提取水稻基因組 DNA。普通PCR體系含模板DNA 1.0 μL、10×PCR的緩沖液2.0 μL、25 mmol L-1的MgCl22.0 μL、2 mmol L-1的dNTP 2.0 μL、0.3 μmol L-1的引物2.0 μL、Taq酶0.5 U，加ddH2O補足20 μL。PCR擴增條件為95℃預變性5 min，94℃變性40 s，55℃退火40 s （溫度因引物不同而異），72℃延伸40 s （不同長度的預期產物按1 kb min-1調整延伸時間），擴增32個循環；72℃延伸10 min，18℃保溫。PCR產物經3%瓊脂糖凝膠電泳，溴化乙錠染色后在UVP Bioimaging-Systems凝膠成像儀上成像。根據分子標記檢測的結果，具有日本晴帶型的個體賦值1，具有9311帶型的個體賦值3，具有雙親帶型（雜合帶）的個體賦值2。

SSR引物的信息來自Gramene網站（http∶//www. gramene.org/）。DNA聚合酶、普通PCR試劑購自上海生工生物工程技術服務有限公司，引物由上海生工生物工程技術服務有限公司和上海捷瑞生物工程有限公司合成。

1.4 染色體片段代換系重測序

由深圳華大基因科技服務有限公司完成。

1.5 統計方法與數據分析

利用 SPSS 19.0完成數據多重比較。利用Mapmaker 3.0作圖軟件進行基因位點與標記間連鎖分析，并用 Kosambi函數將重組率轉化為遺傳距離（cM）。在Microsoft Excel 2013中處理其他數據。

2 結果與分析

2.1 親本及日本晴/T9424 F1的農藝性狀及育性鑒定

2014年正季，分別調查代換系 T9424、日本晴及日本晴/T9424 F1植株抽穗期、株高、花粉育性和自然小穗育性。

表1 雙親及F1抽穗期、株高、花粉育性與小穗育性Table 1 Heading stage，plant height，pollen and spikelet fertility of the parents and F1

由表1可知，日本晴、T9424和日本晴/T9424 F1抽穗期相同，但雙親與 F1株高、花粉育性和自然小穗育性均有顯著差異，日本晴/T9424 F1的花粉育性和自然小穗育性較雙親顯著降低，敗育花粉以圓敗為主（圖1）。

2.2 代換系T9424的重測序

T9424為日本晴背景代換系，為明確該代換系中導入的 9311片段，2013年冬季，溫室發苗提取DNA后交由深圳華大基因科技服務有限公司重測序，結果如圖2所示。

重測序結果表明，代換系 T9424在日本晴核背景中共導入 3個 9311片段，分別位于第 1染色體35 532 181 ～ 40 686 256 bp、第4染色體557 914 ～ 3 601 565 bp和第5染色體1 ～ 5 791 607 bp之間。根據Gramene （http∶//www.gramene.org/）網站提供的SSR序列信息及本實驗室已有的分子標記信息，在第1、第4和第5染色體相應區段內分別合成35、3 和15對標記，獲得15、2和3對9311與日本晴間具有多態的標記。選用第 1染色體上的標記RM1361、第4染色體上的標記STS4-7.1和第5染色體上的標記RM1200對9311、日本晴和T9424進行檢測，結果顯示這3個標記在T9424的擴增條帶與9311一致，標記檢測結果與重測序結果相吻合。由于代換系T9424在第1染色體上導入片段中包含sd1基因，代換系 T9424株高顯著降低，日本晴/ T9424 F1株高則表現為雙親中間型（圖1-A）。

圖1 雙親及F1的植株和花粉Fig. 1 Plant and pollen grains phenotype of the parents and F1

圖2 T9424的全基因組重測序Fig. 2 Whole genome re-sequencing of T9424

2.3 9311與日本晴間雜種不育基因的初步定位

2014年正季，在揚州種植日本晴/T9424 F2群體790株。利用RM1361、STS4-7.1和RM1200三對標記對該群體內單株進行檢測，結果如表2所示。

表2 目標標記在日本晴/T9424 F2群體中分離情況Table 2 Segregation of the target markers in Nipponbare/T9424 F2Population

由表 2可知，群體內單株在標記 RM1361及RM1200處基因型均偏離 1∶2∶1的分離比（χ2= 31.92，111.11 ＞ χ20.05，2= 5.99），在STS4-7.1處的基因型符合1∶2∶1的分離比（χ2= 4.02 ＜ χ20.05，2= 5.99）。根據檢測結果，初步推測該雜種不育基因可能位于第1和第5染色體上。

從理論上講，日本晴/T9424 F2群體內單株在標記RM1361、STS4-7.1及RM1200處應包含27種基因型。本研究中，在日本晴/T9424 F2群體內790株植株中共檢測出 26種，相同基因型單株最少 6株，最多98株。計算相同基因型單株的平均自然小穗育性，以RM1361、STS4-7.1及RM1200標記處基因型分別統計，26種基因型植株自然小穗育性與RM1361、STS4-7.1及RM1200位點上基因型的關系如圖3所示。

由圖3可見，在標記 RM1361和 STS4-7.1處，植株基因型與小穗育性間沒有規律（圖3-A，B）；在標記RM1200處，當植株為純合基因型時，自然小穗育性表現正常，與親本日本晴、T9424相當，當植株為雜合基因型時，其自然小穗育性與日本晴/T9424 F1植株育性相仿（60%左右），較基因型純合單株育性明顯偏低（圖3-C），據此初步將該雜種不育基因定位于第5染色體，與標記RM1200連鎖。已有研究表明，在此定位區段內，報道過多個雜種不育基因，包括李文濤等［38］定位的S-b，Takahiko等［39］定位的S24，Wang等［40］定位的f5-Du，Zhao等［19］定位的雌配子敗育基因S31。與這些基因不同的是，本研究雜種不育基因能夠同時影響花粉育性與小穗育性，因此將該雜種不育基因暫命名為S39（t）。

2.4 S39（t）的精細定位

在標記 RM1200所在的染色體區段上，結合Gramene網站上（http∶//www.gramene.org/）提供的SSR序列信息合成17對SSR標記、5對S-b基因的定位標記［38］及根據9311、日本晴之間序列差異設計的9對STS標記，在T9424與日本晴間進行多態性分析，其中 3對 S-b基因定位標記 PSM8、A14、PSM202和2對STS標記STS5-3、X7等5對標記有多態。STS5-3引物序列為F∶ 5′-TTGGACAGAGGG AGTAGA-3′，R∶ 5′-TCAGAAATGCAGAACAATA-3′；X7引物序列為F∶ 5′-CAAGTCTCGTATCAAACAG C-3′，R∶ 5′-ATTACTTGGTTGGTTGAAAA-3′。

選取標記X7對日本晴/T9424 F2群體790株單株進行檢測，結果表明在標記X7與RM1200之間發生交換的單株有91株，根據交換株的自然小穗育性與基因型，將S39（t）初步定位在X7與RM1200之間，其中標記RM1200、X7處的交換株數分別為29株和62株。進一步利用PSM8、STS5-3、A14、PSM202等多態性標記對上述91株交換株進行檢測，PSM8、STS5-3、A14、PSM202檢測到交換株株數分別為3、0、2、11，由此將 S39（t）定位在標記 PSM8與 A14之間，STS5-3與該基因共分離，標記PSM8與A14間物理距離為110 kb （圖4）。

圖3 不同基因型與小穗育性分布圖Fig. 3 Distribution of different genotypes and spikelet fertility

圖4 S39（t）基因的精細定位Fig. 4 Fine-mapping of the gene S39（t）

2.5 S39（t）作用方式分析

2012—2014年間，觀察日本晴/T9424 F1發現，其花粉育性超過 50%，小穗育性只有 60%左右，推測其胚囊敗育。為了驗證該推測，一是2014年正季，以粳稻恢復系C418為父本、日本晴/T9424 F1和BT型日本晴A分別為母本配制組合，人工剪穎后（每個組合10個穗子），采用飽和授粉，9月底收取稻穗統計其結實率，其中日本晴/T9424 F1植株結實率為40.17%±19.79%，BT型日本晴 A 植株結實率為85.34%±6.98%；二是2014年正季，以子房整體透明法觀察20個親本胚囊及72個日本晴/T9424 F1的胚囊，其中親本20個胚囊均正常（圖5-A），日本晴/T9424 F1植株有28個敗育胚囊（圖5-B），胚囊育性61.11%，與其自然小穗育性相當。以上結果表明日本晴/T9424 F1植株雌配子部分敗育。

圖5 T9424及日本晴/T9424 F1胚囊Fig. 5 Embryo-sac of T9424 and F1

為明確日本晴/T9424 F1植株敗育雄配子的基因型，2014年正季，以日本晴/T9424 F1為父本、BT型日本晴A為母本配置群體。10月底收雜交種，實驗室發苗得到植株 96株，用共分離標記STS5-3檢測植株基因型，結果顯示其中24株單株為日本晴基因型，72株單株為雜合基因型，2種基因型植株數不符合1∶1的分離比（χ2= 48 ＞ χ20.05，1= 3.84），帶有日本晴基因型的植株明顯偏少，表明日本晴/T9424 F1植株中帶有日本晴基因型的花粉部分敗育。

3 討論

雜交水稻的興起與發展極大提高了水稻單產，水稻亞種間雜交較品種間雜交表現出更為強大的雜種優勢，但亞種間雜種不育限制了水稻亞種間雜種優勢的利用，克服亞種間雜種不育來充分發掘亞種間雜種優勢成為提高水稻單產的一條有效途徑。已有的研究表明，水稻雜種不育主要是由核內雜種不育基因造成的。20世紀80年代發現廣親和基因S5n［41］，為亞種間雜種優勢的利用提供了可能，但是大量的育種實踐表明 S5n不能克服所有雜種不育。因此，加強水稻雜種不育基因的挖掘及機制研究，可以為水稻的育種改良提供理論基礎，同時也有利于加深對生殖隔離現象的認識。本研究中，在一套以日本晴為背景，9311為供體的染色體片段代換系中鑒定出一個系 T9424，其與受體親本日本晴間存在不親和，是研究日本晴與9311亞種間雜種不育的理想材料。

水稻育性是一個復雜的性狀，易受環境影響，因此在水稻育性研究中，表型鑒定成為科研工作者首先面對的難題。采用 F2、三交群體、回交群體等初級群體時，群體內植株育性表現呈連續分布，不育株與可育株鑒定存在一定困難。染色體片段代換系是通過多代回交將供體親本的少部分染色體片段導入受體中構建而成，其與受體親本雜交衍生的后代遺傳背景基本一致，有利于性狀準確鑒定，是QTL精細定位與克隆的理想材料［42］。本研究中，代換系T9424在日本晴核背景中僅第1、第4、第5染色體上有少部分染色體片段被9311替換，在日本晴/T9424 F2群體中，植株抽穗期等表型一致，育性分離明顯，表型鑒定準確，有利于雜種不育基因的遺傳分析與基因定位。

雜種不育基因的敗育機制主要分為重復隱性基因配子體致死模式和單基因座孢子體—配子體互作模式兩種。前者又叫做雙基因座模式，認為非等位基因的互作導致水稻雌、雄配子在減數分裂后期攜帶致死基因的配子體敗育。后者最早由Kitamura［43］提出，他認為在秈粳亞種間雜交 F1出現的配子體不育是由一對等位基因互作導致的。根據日本晴/T9424 F2群體單株育性與基因型鑒定結果，明確了日本晴與 T9424間不親和由單個基因控制，該基因位于第 5染色體上，符合單基因座孢子體—配子體互作模式。利用該 F2群體將基因定位到分子標記PSM8與A14之間110 kb的物理區段內。在該定位區段內，已報道了S-b［38］、S24［39］、f5-Du［40］3個雜種花粉不育基因及雌配子敗育基因 S31［19］，但相關基因未被克隆。根據基因定位結果，推測這3個雜種花粉不育基因可能為同一基因。本研究中發現的雜種不育基因能夠同時影響雌、雄配子的育性，與上述該定位區段內雜種不育基因的表現均不相同，因此將該雜種不育基因暫命名為S39（t）。S39（t）可能是一個新的雜種不育基因，不同水稻材料在 S39（t）位點上具有不同復等位基因，不同復等位基因互作效應不同，如引起雌配子敗育的S31，引起雄配子敗育的Sb；也可能是9311在S39（t）定位區段內同時存在緊密連鎖的雌配子雜種不育基因 S31和雄配子雜種不育基因 Sb，從而使得雜種雌、雄配子同時敗育，相關問題有待進一步研究探明。

4 結論

從一套以日本晴為背景，9311為供體的染色體片段代換系中鑒定出一個系 T9424，其與日本晴配置的 F1植株小穗與花粉育性較雙親顯著降低，雙親間存在不親和，受1對雜種不育基因S39（t）控制。利用日本晴/T9424 F2群體內790株單株將S39（t）定位于第5染色體分子標記PSM8與A14之間110 kb的物理區段內，該雜種不育基因同時控制雌、雄配子敗育，帶有日本晴基因型的雄配子部分敗育。

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Identification and Mapping of a Hybrid Sterility Gene between 9311 and Nipponbare

ZHANG Hong-Gen**，ZHANG Li-Jia**，SUN Yi-Biao，SI Hua，LIU Qiao-Quan，TANG Shu-Zhu*，and GU Ming-Hong
Jiangsu Key Laboratory of Crop Genetics and Physiology / Co-Innovation Center for Modern Production Technology of Grain Crops / Key Laboratory of Plant Functional Genomics of the Ministry of Education，Yangzhou University，Yangzhou 225009，China

Abstract：Exploitation of subspecific heterosis is an effective method to improve rice yield by overcoming hybrid sterility between subspecies. In this study，F1plants of the cross between Nipponbare and T9424，a line from a set of chromosome segment substitution lines with Nipponbare background as recipient and 9311 as donor，showed the decreasing spikelet and pollen fertility compared with the two parents，indicating that there was the incompatibility between the parents. Three substituted chromosome segments on chromosome 1，4，and 5，respectively，were identified by whole genome re-sequencing of T9424. Analysis of the genotypes and spikelet fertility of plants in Nipponbare/T9424 F2population indicated that hybrid sterility gene between T9424 and Nipponbare was located on chromosome 5. A total of 790 plants were then used for mapping the hybrid sterility gene，and the target gene was mapped to a candidate region with the physical distance of 110 kb between PSM8 and A14 on chromosome 5. The hybrid sterility gene，named S39（t） temporarily，controlled partial abortion of both pollen grains and embryo-sac of Nipponbare/T9424 F1plants. These results are useful for deepening understanding of the phenomenon of hybrid sterility，and lay the groundwork for the gene cloning and its use in breeding.

Keywords：Rice；Hybrid sterility gene；Gene mapping

DOI：10.3724/SP.J.1006.2016.00787

*通訊作者（

Corresponding author）∶ 湯述翥，E-mail∶ sztang@yzu.edu.cn**同等貢獻（Contributed equally to this work）

收稿日期Received（）∶ 2015-12-08；Accepted（接受日期）∶ 2016-03-14；Published online（網絡出版日期）∶ 2016-03-22.