高效液相色譜法分離分析藥食同源紅花中羥基紅花黃色素A

艾散江·艾海提，王 瑾，關 明*（新疆師范大學化學化工學院，新疆 烏魯木齊　830054）

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高效液相色譜法分離分析藥食同源紅花中羥基紅花黃色素A

艾散江·艾海提，王 瑾，關 明*
（新疆師范大學化學化工學院，新疆 烏魯木齊830054）

摘 要：目的：建立高效液相色譜法測定藥食同源紅花中羥基紅花黃色素A含量的方法。方法：采用微波輔助萃取法提取藥食同源紅花中的有效成分，高效液相色譜梯度洗脫法分離分析其中羥基紅花黃色素A；色譜柱為Sino Chrom ODS-BP（4.6 mm×200 mm，5 μm），流動相為甲醇-0.5%的乙酸溶液，檢測波長為403 nm，流速為1.0 mL/min。結果：羥基紅花黃色素A在5.25～80.32 μg/mL質量濃度范圍內與峰面積呈良好線性關系（r=0.999 9），加標回收率為101.0%～103.6%，相對標準偏差不大于2.27%。結論：建立的方法簡便準確、重復性好，可用于食品、保健品及其復方制劑中羥基紅花黃色素A的含量測定。

關鍵詞：紅花；羥基紅花黃色素A；高效液相色譜法；梯度洗脫

引文格式：

艾散江·艾海提, 王瑾, 關明. 高效液相色譜法分離分析藥食同源紅花中羥基紅花黃色素A[J]. 食品科學, 2016, 37(12): 152-155. DOI:10.7506/spkx1002-6630-201612027. http://www.spkx.net.cn

AISANJIANG·Aihaiti, WANG Jin, GUAN Ming. Separation and analysis of hydroxysafflor yellow a in edible and medical petals of safflower flowers by high performance liquid chromatography[J]. Food Science, 2016, 37(12): 152-155. (in Chinese with English abstract) DOI:10.7506/spkx1002-6630-201612027. http://www.spkx.net.cn

紅花（Carthamus tinctorius L.）屬菊科植物[1]，是一種藥食同源作物，原產于埃及，文字記載已有4 000多年歷史[2]。我國始載于《開寶本草》[3]，已有2 100多年的栽培、食用及藥用歷史，主產于新疆，并于我國多地廣泛栽培[4]。紅花所含成分主要為色素、黃酮類、揮發油、脂肪酸等[5]，被廣泛應用于食品、保健品領域[6-7]。紅花黃色素是從紅花的花瓣中提取的天然食用色素，具有良好的保健功能[8]，被廣泛應用于食品工業中[9]。其中，羥基紅花黃色素A是紅花的主要有效成分[10-11]，具有擴張冠狀動脈、抗氧化、保護心肌、降血壓、免疫抑制和腦保護等功效[12-14]，其含量與抗氧化能力有相關性，因此被廣泛應用于食品與保健品行業[15]。

1993年，Meselhy等[16]首次分離得到羥基紅花黃色素A，國內外對其提取、分離及測定開展了廣泛研究。目前，提取紅花中的羥基紅花黃色素A主要采用熱浸法、超聲法、滲濾法、回流提取、微波輔助萃取等方法，其中，微波輔助萃取技術因具有穿透力強、選擇性高、反應速度快、溶劑消耗低、污染小，以及設備簡單、提取收率高等多種優點[17]，成為樣品前處理技術的熱點[18]。關于紅花中羥基紅花黃色素A的含量測定，主要采用紫外分光光度法[19]、高效液相色譜法[20-22]等，其中，高效液相色譜法因其分離效率高、選擇性好、分析速度快、靈敏度高等特點，應用日益廣泛，但大多涉及食品或保健品中羥基紅花黃色素A的含量測定，此外，文獻[22]報道，采用高效液相色譜法測定紅花有效成分存在色譜峰拖尾、峰形不對稱、保留時間長、分離度不理想等缺陷。

本研究采用微波輔助萃取法對藥食同源的紅花植物原料進行了有效成分提取，并借鑒相關報道[10]，采用梯度洗脫高效液相色譜法對紅花植物原料中的羥基紅花黃色素A進行了有效地分離分析，希望為藥食同源紅花的質量評價提供參考依據。

1　材料與方法

1.1材料

紅花花瓣，采自新疆喀什岳普湖縣。

羥基紅花黃色素A標準品（純度≥98%）天津馬克生物技術有限公司；甲醇（色譜純）美國Sigma-Aldrich公司；高純水；乙酸（分析純）。

1.2儀器與設備

1200LC高效液相色譜儀 安捷倫科技有限公司；E1817525 Sino chrom ODS-BP色譜柱（4.6 mm×200 mm，5 μm）；XH300B型超聲波微波組合合成/萃取儀北京祥鵠科技發展有限公司。

1.3方法

1.3.1色譜條件

流動相：甲醇（A）-0.5%乙酸溶液（B），梯度洗脫（表1），每次運行后平衡柱子5 min；流速：1.0 mL/min；檢測波長：403 nm；柱溫：30 ℃；進樣體積20 μL。

表1　梯度洗脫條件Table 1　Gradient elution conditions

1.3.2標準品溶液的制備

1.3.2.1儲備液的制備

準確稱取羥基紅花黃色素A標準品2.6 mg，置于25 mL的容量瓶中，加水溶解并稀釋至刻度。經0.45 μm微孔濾膜過濾，配制0.104 mg/mL的儲備液，混勻。

1.3.2.2標準品溶液的制備

從0.104 mg/mL的標準品儲備液中，分別精密吸取0.5、1、2、8 mL到10 mL的容量瓶中，混勻，配制成質量濃度分別為0.005 2、0.010 4、0.020 8、0.041 6、0.083 2、0.104 mg/mL的標準品溶液。

1.3.3標準曲線的繪制

精密吸取1.3.2.2節系列標準品溶液各20 μL，進樣，按照1.3.1節下色譜條件進行測定。以羥基紅花黃色素A對照品的質量濃度為橫坐標X，羥基紅花黃色素A峰面積為縱坐標Y，繪制標準曲線。

1.3.4供試品溶液的制備

取紅花粉末（過40目篩）1 g，在功率300 W、溫度70 ℃條件下，微波提取5 min，過濾，稀釋，得到1 mg/mL的供試品溶液，再用0.45 μm微孔濾膜過濾，即得供試品溶液。

1.3.5樣品測定

吸取供試品溶液各20 μL，注入高效液相色譜儀，按1.3.1節條件進行色譜分析，測定羥基紅花黃色素A的峰面積，按外標法計算其含量。

2　結果與分析

2.1提取條件的確定

對提取時間、微波功率、提取溫度、提取次數等影響微波輔助萃取效果的主要因素進行了考察，確定微波功率 300 W、提取溫度 70 ℃、提取時間5 min、提取1 次時，紅花植物原料中羥基紅花黃色素A的提取率最高。

2.2色譜條件的優化

2.2.1流動相的選擇

考察了乙腈-水[21]、甲醇-乙腈-0.7%磷酸溶液、乙腈-甲醇、甲醇-水及甲醇-0.05%乙酸溶液[10]等幾種流動相系統，結果發現，使用前幾種流動相系統，羥基紅花黃色素A與其他成分分離度不高，峰形不對稱；最終，選擇甲醇-0.05%乙酸溶液為流動相，并進行梯度洗脫，羥基紅花黃色素A的分離效果得到明顯改善，羥基紅花黃色素A標準品溶液與供試品溶液色譜圖見圖1。

圖1　羥基紅花黃色素A標準品溶液（A）與供試品溶液（B）色譜圖Fig. 1　HPLC chromatograms of HSYA standard solution and sample solution

2.2.2流速的選擇

考察0.8、1.0、1.2、1.5 mL/min條件下流速對分離效果的影響。結果表明，流速越大，樣品的分離時間越短，但是分離效果不佳，當流速為1.0 mL/min時，分離效果最佳，分離時間較短，故確定1.0 mL/min為最佳流速。

2.2.3檢測波長與柱溫的選擇

配制羥基紅花黃色素A標準品溶液，以超純水為空白，用紫外-可見分光光度計在200～800 nm掃描范圍內進行掃描，發現在403 nm波長處有最大吸收，故確定403 nm為檢測波長。改變柱溫，考察分離度改善情況，結果發現，柱溫為30 ℃時，分離情況最佳，故確定柱溫為30 ℃。

2.3標準曲線線性關系考察結果

在5.25～80.32 mg/mL質量濃度范圍內，羥基紅花黃色素A的質量濃度與其峰面積呈良好的線性關系，回歸方程為Y=49.745X－2.487 5，r=0.999 9。

2.4精密度實驗結果

按1.3.4節方法制備供試品溶液6 份，按1.3.1節條件進行羥基紅花黃色素A峰面積的測定，結果見表2，相對標準偏差（relative standard deviation，RSD）為1.00%，表明該方法精密度滿足分析要求。

表2　精密度實驗結果Table 2　Results of precision test

2.5穩定性實驗結果

按1.3.4節方法制備供試品溶液6 份，按1.3.1節條件，分別在0、12、18、24 h進行羥基紅花黃色素A峰面積的測定，結果見表3，其RSD為1.95%，表明供試品溶液，在24 h內穩定。

表3　穩定性實驗結果Table 3　Results of stability test

2.6加標回收率實驗結果

準確稱取紅花植物原料樣品，分別加入不同質量的羥基紅花黃色素A標準品，按1.3.4節方法制備供試品溶液，測定羥基紅花黃色素A含量，計算回收率，結果見表4，加標回收率為101.0%～103.6%，相對標準偏差不大于2.27%，表明該方法準確度高，滿足分析要求。

表4　回收率實驗結果Table 4　Results of recovery test

2.7樣品的含量測定結果

準確稱取紅花植物原料樣品1 g，按1.3.4節方法制備供試品溶液，按1.3.1節條件進行羥基紅花黃色素A含量的測定，計算得到紅花植物原料樣品中羥基黃色素A的含量為16.2 mg/g（1.62%）。文獻[23]對新疆不同產地的紅花植物原料質量進行了比較，得出了32 批新疆不同產地紅花中羥基紅花黃色素A含量為0.93%～2.25%，與文獻比較結果表明，本研究所采集的紅花植物原料樣品質量屬于中等水平。

3　結 論

本研究采用微波輔助萃取法提取紅花植物原料樣品中有效成分，提取溶劑為純水，具有易得、綠色、環保、提取效果優異等優點，大大降低了提取溶劑的成本，并減少了環境污染。

本研究采用甲醇-0.05%乙酸溶液為流動相，對藥食同源紅花植物原料樣品中的羥基紅花黃色素A進行了梯度洗脫，具有峰形對稱、分離時間短、分離效果好等優點，方法學考察結果表明，各項實驗達到分析要求，方法簡便準確、重復性好，可用于食品、保健品及其復方制劑中羥基紅花黃色素A的含量測定。

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Separation and Analysis of Hydroxysafflor Yellow A in Edible and Medical Petals of Safflower Flowers by High Performance Liquid Chromatography

AISANJIANG·Aihaiti, WANG Jin, GUAN Ming*
(College of Chemistry and Chemical Engineering, Xinjiang Normal University, ürümqi830054, China)

Abstract:Objective: To e stablish a method for the determination of hydroxysafflor yellow A (HSYA) in medical and edible petals of safflower flowers by high performance liquid chromatography (HPLC). Methods: The HSYA in the safflower flowers was extracted by microwave-assisted extraction, chromatographically separated using gradient elution and analyzed by HPLC. The separation was performed on Sino Chrom ODS-BP column (4.6 mm × 200 mm, 5 μm) using methanol-0.5% acetic acid as the mobile phase at a flow rate of 1.0 mL/min. The analyte was detected at 403 nm. Results: The calibration curve had good linear relationship in the range of 5.25–80.32 μg/mL for safflower yellow A (r = 0.999 9). The spiked recoveries were 101.0%–103.6%, with relative standard deviation (RSD) not exceeding 2.27%. Conclusions: The method was simple and accurate with good repeatability and could be used for the determination of hydroxysafflor yellow A in foods, health products, and compound medicinal preparations.

Key words:safflower (Carthamus tinctorius); hydroxysafflor yellow A; high performance liquid chromatography (HPLC); gradient elution

收稿日期：2015-09-14

基金項目：新疆維吾爾自治區自然科學基金項目（2015211A033）；新疆維吾爾自治區研究生科技創新項目（XJGRI2014119）

作者簡介：艾散江·艾海提（1989—），男，碩士研究生，主要從事儀器分析新方法研究。E-mail：326821579@qq.com

*通信作者：關明（1974—），男，教授，博士，主要從事儀器分析新方法研究。E-mail：guanm@xjnu.edu.cn

DOI:10.7506/spkx1002-6630-201612027

中圖分類號：TS201.2

文獻標志碼：A

文章編號：1002-6630（2016）12-0152-04