擬南芥花期基因轉化煙草及其早花反應特性研究

常愛霞，郭利杰，2，劉 旦，羅成剛，馮全福，魏 凱，王 蘭

（1.中國農業科學院煙草研究所，青島 266101；2.河南師范大學，河南 新鄉 453000；3.青島農業大學，青島 266109）

?

擬南芥花期基因轉化煙草及其早花反應特性研究

常愛霞1，郭利杰1，2，劉 旦1，羅成剛1，馮全福1，魏 凱3，王 蘭2*

（1.中國農業科學院煙草研究所，青島 266101；2.河南師范大學，河南 新鄉 453000；3.青島農業大學，青島 266109）

摘 要：為探討花期基因對煙草開花早晚的影響及其在加快育種進程中的利用價值，采用RT-PCR方法從擬南芥克隆獲得花期基因（FT），經過測序分析、酶切鑒定后連接到植物表達載體P22上，構建植物重組載體 P22-FT。通過農桿菌介導，將FT基因轉入烤煙品種Coker 371 gold后獲得了26株陽性植株。研究結果表明，FT基因對烤煙品種Coker 371 gold的外觀形態和花期具有較大的影響；與未轉基因對照比較，FT陽性植株平均葉片數少15～16片，平均株高矮80 cm，現蕾時間提前了75 d左右。通過陽性植株自交分離群體及陽性植株與對照植株的雜交分離群體的鑒定選擇，獲得了單拷貝FT基因的2個陽性植株。早花基因轉化煙草可以有效誘導煙草早花，縮短煙草生育期一半時間，單拷貝可分離早花植株在加快煙草育種進程中具有重要利用價值。

關鍵詞：煙草；FT基因；轉基因；花期

品種是農業發展的基礎，如何縮短育種周期，快速培育作物新品種一直是育種家追求的目標。隨著早花基因的分離及功能鑒定，研究早花基因在不同作物中誘導早花的反應特性、以及其在育種中的利用價值，對于快速培育作物新品種具有重要意義。

近年來，高等植物成花誘導研究取得了較大進展。植物開花控制基因AGAMOUS［1］、LEAFY［2］、FT等已被成功分離，并且大量研究表明，FT同源基因在擬南芥、水稻、柑橘、番茄、白楊、牽牛花、梨、向日葵和葫蘆中的過量表達都能促進開花，有研究預測FT基因具有促進開花的保守功能［2-3］。在水稻中，FT蛋白于葉片中合成之后轉運至頂端分生組織，發揮其誘導開花的功能［4-5］；在南瓜上也有類似的報道［6］；在擬南芥中，FT基因是控制光周期反應促進早花的關鍵基因［7］。鑒于FT蛋白在植物開花過程中的主要作用，利用其可以人為的改變植物花期，在植物誘導早花中具有重要利用價值。目前主要有兩種應用方法：（1）傷口處理法，將獲得的FT蛋白涂抹于植物葉片傷口，可誘導植物早花［8］；（2）利用基因工程方法，將外源FT基因導入植株，使其轉錄表達，促進開花［9-10］。第1種方法，每一代都要處理，過程繁雜，并且由于蛋白失活、植物吸收、工作人員處理技術等原因經常失敗；相比較來說，第2種是一勞永逸的方法。目前，已經從多種植物中發現并克隆了花期基因，但大都著重于理論研究［4］。FT蛋白能夠促進早花的特性在植物育種實踐中也具有重要利用價值，如利用其可以調節一些花卉植物的開花時期［4］，在開花期較長的樹木育種工作中加快育種進程［11］，在作物育種中可以加快目標性狀的快速定向轉移等，但相關研究尚處于探索階段。煙草作為重要的基因工程模式作物，國外近年來已經開始開展 FT基因轉化煙草以加快育種進程的研究［12］，國內也有利用FT基因PVX病毒瞬時表達載體，涂抹煙草使FT基因瞬時表達誘導煙草早花的報道［13］，但有關 FT基因轉化煙草的早花反應特性及其在育種中如何利用，國內尚未見相關報道。

本研究擬采用RT-PCR技術，從擬南芥中分離獲得FT基因，構建植物表達載體，進而通過農桿菌介導法轉入烤煙品種 Coker371gold，以期觀察了解FT基因對Coker371gold花期的影響，同時鑒定獲得轉單拷貝FT基因的煙草植株，為利用早花基因加快煙草育種進程奠定方法及種質材料基礎。

1　材料與方法

1.1 來源

擬南芥（Arabidopsis thaliana）、烤煙品種Coker371gold、根癌農桿菌EHA105、克隆載體JET由中國農業科學院煙草研究所保存；植物表達載體P22由深圳華大基因研究院（華大）合成提供。創建的轉基因陽性植株以及試驗過程中所有種質材料均在中國農業科學院煙草研究所青島溫室進行隔離種植。

1.2 方法

1.2.1 花期基因FT的克隆 根據GenBank上的FT（GeneID：842859）序列設計兩端引物，并在引物5′端引入SacⅠ酶切位點，3′端引入SpeⅠ酶切位點，以擬南芥的cDNA為模板進行RT-PCR擴增，電泳獲得的目的片段，經過切膠回收、連接克隆載體、轉化大腸桿菌之后，送菌樣至上海生工生物工程有限公司測序。前后引物序列是：FTF：AGAGCTCACCACCTGTTTGTTCAAGATC；FTR：CACTAGTGGTTATAAAGGAAGAAGCCAT。其中，下劃線兩堿基間為酶切位點。

圖1　植物表達載體 P22Fig. 1 Plant expression vector P22

1.2.2 表達載體的構建 P22載體由華大合成，如圖1。表達載體P22以及凝膠回收的PCR產物分別用限制性內切酶Sac I和Spe I處理，回收純化，用T4 DNA連接酶置于4 ℃連接，轉化大腸桿菌感受態細胞。涂布于含有潮霉素的 LB培養基，37 ℃倒置培養過夜。挑取單菌落于10 mL LB液體培養基，37 ℃、200 r/min振蕩10 h，小量提取質粒。用限制性內切酶Sac I和Spe I切割重組質粒，電泳鑒定重組子。經上海生工生物工程有限公司測序，獲得重組表達載體P22-FT。

1.2.3 P22-FT轉化農桿菌感受態細胞培養 將構建好的2.5 μL P22-FT質粒載體加入100 μL農桿菌感受態細胞中，冰浴10 min。冰浴后，液氮冷凍5 min，然后在37 ℃水溫浴5 min后，28 ℃慢速振蕩培養3 h，最后接種于YEB固體培養基28 ℃培養約48 h。以農桿菌菌液為模板進行PCR擴增，鑒定陽性克隆。獲得陽性克隆后挑取單菌落，接種于含潮霉素50 mg/L的20 mL YEB液體培養基，在27 ℃、180 r/min搖動培養后用于葉片侵染。

1.2.4 農桿菌介導煙草轉化及其再生苗的獲得采用葉盤法轉化煙草，經侵染、共培養之后，將長至1 cm以上的不定芽切下并轉移到潮霉素生根培養基（MS+NAA 0.1 mg/L+潮霉素50 mg/L）上，誘導生根，獲得轉基因煙草苗，然后移栽。

1.2.5 轉基因煙草的DNA提取及PCR檢測 對獲得的轉基因植株，提取葉片DNA，采用潮霉素抗性基因檢測引物HYG，進行PCR擴增（94 ℃變性 1 min，55 ℃復性1 min，72 ℃延伸 1 min，30個循環），預期擴增產物大小是521 bp，如轉基因植株擴增產物含有該條帶，則認為是陽性植株。引物序列是：HYGF：CGATTCCGGAAGTGCTT GAC；HYGR：CGTCTGCTGCTCCATACAAG。

1.2.6 轉基因植株的表型觀察 將對照植株和轉基因陽性植株同時置于相同條件的溫室中培養，通過觀察和分析兩類植株的花期表型以及株型變化，確認外源FT基因對是否對煙草花期起調控作用。

1.2.7 轉單拷貝 FT基因煙草的植株鑒定篩選分別建立轉基因植株自交群體以及轉基因植株和非轉基因植株雜交群體，統計不同遺傳群體中早花植株數量和非早花植株數量，用 SPSS 19.0軟件作卡方檢驗，驗證自交群體早花植株與非早花植株比例是否符合3∶1，雜交群體是否為1∶1，據此統計結果篩選轉單拷貝FT基因植株。

2　結果

2.1 FT基因的克隆及轉化

從擬南芥中提取RNA，利用合成的FT基因引物進行RT-PCR，獲得擴增產物約為600 bp（圖2），符合預期片段大小，切膠回收并測序，做序列比對分析，結果表明克隆產物為FT基因的完全編碼序列，與GenBank上登錄的FT基因同源性達100%。

進一步構建含有FT基因的P22表達載體，經過Sac I和Spe I雙酶切電泳，從重組的質粒中獲得了約600 bp的片段（圖3），與目的基因大小相符合，說明外源 FT基因已經插入到質粒中，P22-FT表達載體構建成功。

圖2　FT cDNA片段的RT-PCR擴增Fig. 2 Amplification of partial FT cDNA fragment by RT-PCR

圖3　P22-FT連接載體檢測Fig. 3 Digestion electrophoresis test of recombinant plasmid of P22-FT

構建成功的植物表達載體 P22-FT用凍融熱擊法轉化農桿菌感受態細胞之后，28 ℃倒置培養2～3 d，隨機挑取平板上的單菌落，于YEB液體培養基中搖菌培養，并用菌液做模板進行PCR擴增，結果顯示在所挑選的菌斑中有4個顯示有預期大小的PCR 擴增產物（圖 4），說明植物表達載體轉入農桿菌中。

圖4　農桿菌陽性克隆的PCR檢測Fig. 4 PCR test of positive colone of Agrobacterium

用農桿菌侵染Coker371gold的葉片，經過共培養和選擇培養后，抗性芽逐漸伸長，長至2～3 cm的時候，將其轉移到生根培養基上生長，約1周之后生根，獲得再生植株，其中少部分再生植株在生根培養基上便開始現蕾或開花（圖5）。

2.2 轉FT基因陽性植株的PCR檢測

以轉基因再生植株的DNA為模板，用HYG檢測引物進行PCR 檢測，鑒定轉FT基因陽性植株。陰性對照無擴增條帶，轉基因的陽性植株擴增出了約521 bp的條帶，與HYG標記基因大小相符，初步表明FT基因已經轉入煙草基因組中，共獲得了Coker371gold轉FT基因陽性植株26株，PCR檢測結果如圖6。

2.3 轉FT基因植株的花期和外觀形態觀察

將轉 FT基因陽性植株和未轉基因對照植株從生根培養基轉移至營養土中，種植在自然溫室環境下，前期在生根培養基中已經現蕾或開花的陽性植株由于營養體較小，轉移至營養土中種植一段時間后多數死亡，在生根培養基中未現蕾的陽性植株在營養土中經過約15 d的營養生長，陽性植株開始現蕾開花。從陽性植株和野生對照植株花期和外觀形態觀察發現，陽性植株現蕾開花時，植株一般有3～4片葉片，株高平均約35 cm（圖 7A），同期轉移的未轉基因野生對照植株仍然處于營養生長階段，株高約27 cm（圖7 B）。90 d后，野生對照植株開始現蕾開花，對照植株現蕾時平均株高約115 cm，葉片數一般18～20片（圖7 C）。可見，FT基因對烤煙品種Coker371gold的外觀形態和花期具有較大的影響，與未轉基因野生對照植株相比，轉FT陽性植株平均葉片數比野生對照植株少15～16片，平均株高比野生對照植株矮 80 cm，現蕾時間比野生對照植株提前了75 d。

2.4 單拷貝FT基因的陽性植株的鑒定

圖6　轉FT 煙草植株的PCR檢測Fig. 6 PCR test of transgenic plants

將最終成活的 16株轉基因陽性植株分別構建自交群體，同時分別與非轉基因對照植株雜交構建雜交群體。通常情況下，烤煙品種Coker371gold從播種到現蕾一般120 d左右，而轉FT陽性植株一般比對照植株現蕾期提前75 d左右（有的植株在培養基中就開始開花，現蕾期比對照植株提前90 d左右），由此推算，含FT基因的后代植株從播種到現蕾一般需要40～65 d（后續其他試驗中已得到驗證）。本研究中，以播種后70 d為限分別統計各自交群體和雜交群體中早花植株數和未早花植株數，用 SPSS 19.0軟件作卡方檢驗，分別檢驗自交后代群體早花分離比例是否符合3∶1（表1），雜交后代群體早花分離比例是否符合1∶1（表2）。根據表1、表2自交和雜交后代分離群體卡方檢驗結果，在 0.05顯著水平下，陽性植株C-9、C-11、C-13、C-19、C-20自交群體后代早花性狀表現單基因分離規律，陽性植株C-1、C-2、C-9、C-10、C-11雜交群體后代早花性狀表現單基因分離規律，綜合自交和雜交群體鑒定結果，初步篩選出C-9、C-11兩個單拷貝FT基因陽性植株。這兩個植株可以提供進一步的早花育種利用研究。

圖7　花期和株高觀察Fig. 7 Flowering and plant height observation

3　討論

表1　陽性植株自交后代分離群體開花情況和卡方檢驗Table 1 Flowering statistics and chi-square test of positive plant selfing group

表2　陽性植株與對照植株雜交后代群體開花情況和卡方檢驗Table 2 Flowering statistics and chi-square test of positive and controlled plant hybridization group

在煙葉生產過程中，早花是煙草對環境脅迫的一種適應性反應，同時也是困擾煙葉生產的一種不利現象。魏彬等［14］曾探討了早花控制的措施和機理；楊靜等［15］通過對不同品種莖尖端花芽分化過程中基因的表達差異，探討了烤煙早花與抗早花的形成及調控機制。這些研究對煙葉生產均具有重要意義。然而，在煙草育種過程中，為了加快世代進程快速培育新品種，早花成為一個有利性狀，育種家希望有簡單有效的手段來誘導煙草早花以加快世代進程。大量研究表明，大豆、楊樹、水稻等多種植物的 FT同源基因均有促進植物早花的功能［16-18］。因此，本研究探討了早花基因FT轉化煙草后煙草的早花反應特性以及在育種中的利用價值，目的是探索既能快速培育新品種又能滿足生產實際需求的快速育種方法，這對煙草生產持續發展具有重要意義。

本研究中擬南芥 FT基因在煙草中異源過表達導致煙草花期大大提前，比正常非轉基因植株花期提前75 d左右，進一步驗證了FT及其同源基因在功能上的保守性。對轉基因煙草的形態學觀察發現，植株營養生長階段時間變短，提前進入生殖生長階段，導致株型矮小，葉片數量減少。在轉基因陽性植株群體中，大部分是轉移到營養土中后約15 d開花，而有些陽性植株在培養瓶中就已經開花，并且花期相差較大。推測造成這種差異的主要原因是外源基因的整合位置或者拷貝數不同，從而導致其轉錄水平存在一定的差異。在培養基中就開花的陽性植株可能是其 FT基因的表達水平較高，而這種過早開花的植株，由于營養生長不足，使其移栽土中后很快死亡，不利于后期研究利用。

本研究通過轉 FT基因陽性植株自交群體以及陽性植株與非轉基因對照植株的雜交群體，明確了 FT基因控制的早花性狀不但能通過有性雜交遺傳給后代，而且可以通過有性雜交有效地被分離掉。并且通過轉單拷貝FT基因陽性植株的鑒定獲得，使FT基因控制的早花性狀在有性雜交后代群體中的遺傳和分離更易于人為控制，這在加快作物育種進程中具有重要的利用價值。例如，由于Coker371gold是黑脛病的一個抗源，且研究已經證明，其黑脛病抗性屬于單基因控制，利用Coker371gold轉單拷貝FT基因陽性植株，在后續進一步驗證 FT基因與黑脛病抗性基因不連鎖的情況下，可以利用單拷貝早花陽性植株進行煙草黑脛病抗性的快速定向改良，在回交早期分離世代選擇含有黑脛病抗性的早花植株連續回交縮短育種周期，而在回交高世代群體中，選擇含有黑脛病抗性基因而不含 FT基因且不含任何轉基因元件的非早花目標植株提升鑒定及應用，這樣將大大加快品種改良的周期，加快新品種培育的進程。利用早花基因加快育種進程將是作物育種的一個重要研究方向。

除了縮短育種周期外，使煙草的花期提前，在植物學，生理學和遺傳學教學中也具有很高的實用價值［19］。由于正常煙草花期較長，學生們在一個學期很難觀察到煙草的一個生長周期，但是轉FT基因煙草的生長周期大大縮短，使學生能夠在較短時間內觀察煙草生活史和各器官變化；同時，可應用于生理學和遺傳學的研究，縮短研究所用時間。

4　結論

本研究通過農桿菌介導，將擬南芥FT基因轉入烤煙品種Coker371gold后獲得了26株陽性植株。FT基因對陽性植株的外觀形態和花期具有較大的影響，與未轉基因對照植株比較，FT陽性植株平均葉片數少15～16片，平均株高矮80 cm，現蕾時間提前了75 d左右。通過陽性植株自交分離群體及陽性植株與對照植株的雜交分離群體的鑒定選擇，獲得了含單拷貝FT基因的2個陽性植株，其在加快煙草育種進程中具有重要利用價值。

參考文獻

［1］ Yanofsky M F，Ma H，Bowman J L，et al. The protein encoded by the Arabidopsis homeotic gene AGAMOUS resembles transcription factors ［J］. Nature 1990，346∶35-39.

［2］ Weigel D，Alvarez J，Smyth D R，et al. LEAFY controls floral meristem identity in Arabidopsis［J］. Cell，1992，69（5）∶ 843-859.

［3］ P A PIN，O NILSSON. The multifaceted roles of FLOWERING LOCUS T in plant development［J］. Plant Cell and Environment，2012（35）∶ 1742-1755.

［4］ 姜丹，梁建麗，陳曉麗，等. 擬南芥花期基因FT轉化切花菊‘神馬’［J］. 園藝學報，2010，37（3）：441-448.

［5］ Tamaki S，Matsuo S，Wong H L，et al. Hd-3a protein is a mobile flowering signal in rice［J］. Science，2007，316∶1033-1036.

［6］ Lin M K，Belanger H，Lee Y J，et al. FLOWERING LOCUS T protein may act as the long-distance florigenic signal in the cucurbits ［J］. Plant Cell，2007，19∶ 1488-1506.

［7］ Abe M，Kobayashi Y，Yamamoto S，et al. FD，a bZIP protein mediating signals from the floral pathway integrator FT at the shoot apex［J］. Science，2005，309∶1052-1056.

［8］ Noriko Yamagishi，Nobuyuki Yoshikawa. Expression of FLOWERING LOCUS T from Arabidopsis thaliana induces precocious flowering in soybean irrespective of maturity group and stem growth habit［J］. Planta，2011，233∶ 561-568.

［9］ 常麗麗，吳連成，庫麗霞，等. 植物 FLOWERING LOCUS T/TERMINAL FLOWER1基因家族的研究進展［J］. 西北植物學報，2008，28（4）：0843-0851.

［10］ 賈小明，張煥玲. 3種FT基因誘導楊樹早期開花比較［J］. 東北林業大學學報，2011，39（11）：1-4.

［11］ 張煥玲. FT基因轉化白楊雜種促進其早期開花的研究［D］. 楊陵：西北農林科技大學，2010.

［12］ Ramsey S，Lewis S P，Kernodle. A method for accelerated trait conversion in plant breeding［J］. Theor Appl Genet，2009，118∶ 1499-1508.

［13］ 高玉龍，肖炳光，Ralph E Dewey誘導煙草早花的PVX-FT系統的建立［J］. 中國煙草學報，2013，19（6）：102-105.

［14］ 魏彬，陳建軍，呂永華，等. 不同調控措施下烤煙開花時間與碳氮代謝關系的研究［J］. 中國煙草科學，2007，28（1）：14-17.

［15］ 楊靜，陳杰，陳建軍，等. 烤煙品種K326及其耐低溫抗早花變異系基因表達譜分析［J］. 中國煙草科學，2015，36（2）：93-98.

［16］ 胡瑞波. 大豆FT/TFL l基因克隆、表達模式及功能分析［D］. 北京：中國農業科學院，2009.

［17］ Hsu C Y，Liu Y，Luthe D S，et al. PoPlar FT2 shortens the juvenile Phase and Promotes seasonal flowering［J］. Plant Cell，2006，18∶ 1846-1861.

［18］ Komiya R，Ikegami A，Tamaki S，et al. Hd3a and RFT1 are essential for Flowering in rice. Development［J］. 2008，135∶ 767-774.

［19］ 沈火林，王志源. 早花基因在植物教學及遺傳育種中的應用［J］. 生物學雜志，1992（5）：1-3..

Study on Transgenic Arabidopsis Flowering Gene FT into Tobacco and Its Early Blooming Properties

CHANG Aixia1，GUO Lijie1，2，LIU Dan1，LUO Chenggang1，FENG Quanfu1，WEI Kai3，WANG Lan2*
（1. Institute of Tobacco Research，Chinese Academy of Agricultural Sciences，Qingdao 266101，China；2. Henan Normal University，Xinxiang，Henan 453000，China；3. Qingdao Agriculture University，Qingdao 266109，China）

Abstract:To explore the effect of Flowering Locus T （FT） gene on the flowering of tobacco and stimulate its utility in tobacco breeding. FT gene was cloned by RT-PCR from Arabidopsis. After confirmation by sequencing and digestion，the fragment with proper digested sites was inserted into plant expression vector P22，and the expression vector FT-P22 was constructed. Then FT gene was introduced into Coker371 gold tobacco genome by Agrobacterium-mediated transformation，and 26 positive clones obtained. The result shows that the FT gene exhibited more influence on morphology and flowering of flue-cured tobacco variety Coker371 gold than wild type. The average leaf number of transgenic plant was less 15-16 pieces than control，their average height shorted 80 cm，and their budding time was ahead of about 75 days. By using the self-fertilization segregation population of positive plant and the hybridization separation group between positive plants and the control plants，we had got two positive plants with single copy of the FT gene. The transgenic FT tobacco could induce the early blossoming and short the half time of breeding cycle，the single copy segregation plant exhibited the very important utility value in speeding up the breeding process of tobacco.

Keywords:tobacco；FT gene；transgenic；flowering

中圖分類號：S572.03

文章編號：1007-5119（2016）01-0001-07

DOI：10.13496/j.issn.1007-5119.2016.01.001

基金項目：中國煙草總公司科技重點項目“彰顯皖南‘焦甜香’、涼山‘清甜香’風格特色的烤煙新品種選育”（110201302003）

作者簡介：常愛霞（1975-），女，副研究員，從事煙草育種理論與方法研究。E-mail：changaixia75@126.com。*通信作者，E-mail：041099@htu.edu.cn

收稿日期：2015-02-02 修回日期：2015-12-04