新疆維、漢族宮頸鱗癌病變與PI3K、ERK、IGF-1R、ER蛋白表達的關系*

杜　靖，榮小靈，寧　超，沙　靜

(1.新疆醫科大學高職學院機能教研室，烏魯木齊 830011；2.新疆醫科大學第二附屬醫院檢驗科，烏魯木齊 830064；3.新疆醫科大學研究生學院，烏魯木齊 830011；4.新疆生產建設兵團醫院婦產科，烏魯木齊 830002)

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新疆維、漢族宮頸鱗癌病變與PI3K、ERK、IGF-1R、ER蛋白表達的關系*

杜靖1，榮小靈2，寧超3，沙靜4△

(1.新疆醫科大學高職學院機能教研室，烏魯木齊 830011；2.新疆醫科大學第二附屬醫院檢驗科，烏魯木齊 830064；3.新疆醫科大學研究生學院，烏魯木齊 830011；4.新疆生產建設兵團醫院婦產科，烏魯木齊 830002)

[摘要]目的從蛋白質水平觀察子宮頸炎和子宮頸鱗癌組織中磷酸肌醇3激酶(PI3K)、細胞外信號調節激酶(ERK)、胰島素樣生長因子-1型受體(IGF-1R)和雌激素受體(ER)在新疆維吾爾族和漢族婦女中的表達及相關關系。方法收集石蠟包埋宮頸炎組織90份(漢族46份，維吾爾族44份)、子宮頸鱗癌組織224份(漢族36份，維吾爾族188份)，采用免疫組織化學SP法鑒定蛋白表達水平。結果子宮頸鱗癌IGF-1R、PI3K陽性表達率(58.04%、92.41%)高于宮頸炎組織(13.33%、57.78%)，ER、ERK陽性表達率(22.32%、68.30%)低于宮頸炎組織(63.33%、95.56%)；漢族、維吾爾族子宮頸鱗癌IGF-1R和PI3K陽性表達率(69.44%和88.89%，55.85%和93.09%)高于宮頸炎組織(15.22%和54.35%，11.36%和61.36%)；漢族、維吾爾族子宮頸鱗癌ER和ERK陽性表達率(13.89%和83.33%，23.94%和65.43%)低于宮頸炎組織(65.22%和93.48%，61.36%和97.73%)；ERK在維吾爾族子宮頸鱗癌組織中表達(65.43%)低于漢族(83.33%)，差異均有統計學意義(P<0.01)。結論PI3K、ERK、IGF-1R和ER蛋白表達陽性或缺失與宮頸癌發生關系密切，可作為宮頸癌檢測的重要生物指標，ERK蛋白在宮頸癌中的表達存在民族間差異。

[關鍵詞]宮頸腫瘤；磷酸肌醇3激酶；細胞外信號調節激酶；受體，IGF 1型；受體，雌激素

宮頸癌是女性生殖系統最常見的惡性腫瘤之一，發病率逐年增高，而且逐漸趨于年輕化，因此，有關宮頸癌的預防、治療等相關研究近年來已引起學術界的廣泛關注。宮頸癌發生、發展是多種影響因素互相協同作用的結果，胰島素樣生長因子-1型受體(insulin-like growth factor receptor，IGF-1R)在宮頸癌中過度表達而導致預后不良[1]，并受雌激素受體(estrogen receptor，ER)調節，二者通過共同抑制IGF-1細胞增殖作用的磷酸肌醇3激酶(phosphoinositide 3 kinase，PI3K)、細胞外信號調節激酶(extracellular signal-regulated kinase，ERK)與腫瘤關聯[2]。新疆維吾爾族婦女宮頸癌患病率及病死率均明顯高于本地漢族、哈薩克族、蒙古族，病死率是新疆其他民族平均水平的3～4倍，在全國少數民族中占第1位。目前，關于子宮頸鱗癌組織中PI3K、ERK、IGF-1R和ER蛋白在維吾爾族與漢族之間表達的相關文獻在國內外的研究尚少見報道，本研究采用免疫組織化學法檢測PI3K、ERK、IGF-1R和ER蛋白在維吾爾族與漢族子宮頸不同病變中的表達情況，探究各因素與宮頸癌發生、發展的關系。

1資料與方法

1.1一般資料收集新疆醫科大學第一附屬醫院及和田地區人民醫院石蠟包埋的宮頸炎組織90份(漢族46份，維吾爾族44份)，子宮頸鱗癌組織224份(漢族36份，維吾爾族188份)。所有標本經病理檢查確診。免疫組化試劑兔抗人多克隆抗體PI3K購自北京中杉金橋公司(1∶150)，ER購自福建萬森生物科技有限公司(1∶100)，ERK(1∶50)、IGF-1R(1∶500)購自美國SANTA公司。二抗、二氨基聯苯胺(DAB)顯色試劑盒購自北京中杉金橋公司。

1.2方法

1.2.1免疫組化S-P法檢測石蠟切片常規脫蠟水化，并在0.01 mmol/L檸檬酸抗原修復液中通過微波修復法預處理；置于0.3% H2O2孵育10 min，阻斷內源性過氧化物酶活性。滴加試劑A(含10%山羊血清)于組織切片上(需完全覆蓋待檢組織)，室溫孵育10 min，加入一抗，4 ℃培養過夜，磷酸鹽緩沖液(PBS)沖洗5 min，共3次。滴加試劑B室溫孵育10 min，PBS沖洗5 min，共3次；滴加試劑C室溫孵育10 min，PBS沖洗5 min，共3次。滴加新鮮配制的DAB顯色液，室溫顯色2～5 min(顯微鏡下控制顯色時間為3～10 min)。終止顯色，蘇木素復染，脫水，二甲苯透明、封片。

1.2.2結果判定免疫組化染色以宮頸上皮細胞胞質或細胞核染成棕黃色為陽性判定標準。PI3K、ERK和IGF-1R大部分在細胞質內表達，偶見細胞核著色，ER主要在細胞核內表達，染色后出現棕黃色顆粒為陽性細胞。高倍鏡下全視野觀測，按陽性細胞在組織中所占面積分為5個等級：<5%為陰性(-)，5%～25%為弱陽性(+)，>25%～50%為陽性(++)，>50%～75%為中等度陽性(+++)，>75%為強陽性(++++)。陰性對照為等量PBS替代一抗的宮頸組織。

1.3統計學處理采用SPSS16.0統計軟件進行分析，等級資料采用成組設計兩樣本比較的秩和檢驗，相關性采用等級相關Spearman秩相關系數和Pearson列聯系數表示，以P<0.05為差異有統計學意義。

2結果

2.1宮頸炎與宮頸鱗癌組織中PI3K、ERK、IGF-1R和ER表達比較子宮頸鱗癌IGF-1R、PI3K陽性表達率(58.04%、92.41%)明顯高于宮頸炎組織(13.33%、57.78%)，ER、ERK陽性表達率(22.32%、68.30%)低于宮頸炎組織(63.33%、95.56%)，差異有統計學意義(P<0.01)；漢族、維吾爾族子宮頸鱗癌IGF-1R、PI3K陽性表達率高于漢族、維吾爾族宮頸炎組織(P<0.01)；漢族、維吾爾族子宮頸鱗癌ER、ERK陽性表達率低于漢族、維吾爾族宮頸炎組織(P<0.01)；維吾爾族低分化宮頸鱗癌組織中IGF-1R、ERK表達低于原位癌組織(P<0.05)；ERK在維吾爾族子宮頸鱗癌組織中表達低于漢族，差異有統計學意義(P<0.01)，見圖1及表1～2。

圖1　　宮頸炎與子宮頸鱗癌組織中PI3K、ERK、IGF-1R和ER表達(IHC×400)

表1　　宮頸炎及子宮頸鱗癌組織中PI3K、ERK蛋白表達比較

續表1　　宮頸炎及子宮頸鱗癌組織中PI3K、ERK蛋白表達比較

a：P<0.01，與宮頸炎比較；b：P<0.01，與漢族宮頸炎比較；c：P<0.01，與維吾爾族宮頸炎比較；d：P<0.01，與漢族子宮頸鱗癌比較；e：P<0.01，與原位癌比較。

表2　　宮頸炎及子宮頸鱗癌組織中IGF-1R、ER蛋白表達比較

a：P<0.01，與宮頸炎比較；b：P<0.01，與漢族宮頸炎比較；c：P<0.01，與維吾爾族宮頸炎比較；d：P<0.05，與原位癌比較。

2.2PI3K、ERK、IGF-1R和ER間表達相關性維吾爾族子宮頸鱗癌組織中ERK、ER與PI3K呈正相關(r=0.34、0.23，P=0.00)，ERK與IGF-1R呈正相關(r=0.34，P=0.00)，ER與ERK相關(r=0.21,P=0.00)，PI3K、ER與IGF-1R相關(r=0.36、0.24，P=0.00)；各組標本中PI3K、ERK、ER和IGF蛋白表達，見表3。

表3　　各組標本中PI3K、ERK、IGF-1R和ER蛋白表達(n)

3討論

HPV感染是子宮頸癌的主要致病因素，其在誘導宮頸發生上皮內瘤變或惡性轉變的過程當中，需要多種因素協同參與和相互作用[3]，有研究發現，ER在浸潤型子宮頸鱗癌和子宮頸腺癌的陽性率均低于在正常宮頸組織中的表達，ER作為配體轉錄因子，與腫瘤的發生發展、宮頸癌細胞的生長及病變特性緊密相連[4]。

本研究中ER在子宮頸鱗癌中的陽性表達率(22.32%)低于宮頸炎組織(63.33%)，與Zhai等[5]結論一致。雖然本研究發現ER在維吾爾族、漢族子宮頸鱗癌中的陽性表達率(23.94%，13.89%)均低于宮頸炎組織(61.36%，65.22%)，差異有統計學意義(P<0.01)，但在兩民族間比較，ER表達率差異無統計學意義(P>0.05)。ER在宮頸鱗癌組織中陽性率低表達的原因很可能是由于宮頸癌患者體內雌激素水平相對正常值較高，而大量雌激素與其受體結合導致受體水平降低。也可能是由于ERα異常甲基化導致其轉錄水平變化，從而導致蛋白質表達降低或缺陷[6]。由于ER蛋白在不同階段宮頸病變組織中存在表達差異，可以運用檢測ER蛋白的表達水平來預測宮頸病變的嚴重程度。

IGFs是一類多功能細胞增殖調控因子，已被證實其具有促進細胞有絲分裂、轉移和抑制凋亡的作用，是重要的促腫瘤生長因子，IGF-1R被配體激活后與細胞增殖及腫瘤發生密切相關，其表達上調可以促進癌細胞的生長。有研究表明，IGF-1R陽性表達率越高，宮頸癌組織侵襲能力越強[7]。

本研究結果證實，在維吾爾族、漢族子宮頸鱗癌中IGF-1R的陽性表達率(55.85%，69.44%)高于宮頸炎組織(11.36%，15.22%)，差異有統計學意義(P<0.01)，維吾爾族、漢族組間IGF-1R表達比較差異無統計學意義(P>0.05)。在對188例維吾爾族宮頸癌分析結果顯示，低分化宮頸癌與原位癌比較差異有統計學意義(P<0.05)，說明IGF-1R陽性表達與宮頸分化程度有關。

本研究結果表明，ER在維吾爾族子宮頸鱗癌中低表達(23.94%)，且與IGF-1R存在相關性(r=0.24，P=0.00)，原因可能是患者體內高雌激素水平與IGF系統協同作用致IGF-1R表達增多，IGF-1R是雌激素調節蛋白，而高雌激素與受體結合導致ER水平降低。梁元姣等[8]報道臨床上單純抗雌激素治療可使雌激素水平下降，游離ER增多，從而表現出IGF-1R高活性。宮頸癌的發生與卵巢甾體激素之間的聯系已無可爭議，IGF-1R水平與卵巢甾體激素水平均呈顯著正相關，說明IGF系統與卵巢甾體激素在宮頸癌的發生過程中相互促進和協同[9]。

PI3K是一種胞內磷脂酰肌醇激酶，由催化亞基和調節亞基構成的異源二聚體。免疫組織化學分析多種腫瘤及癌前病變發現PI3K基因突變和絲氨酸/蘇氨酸蛋白激酶B(AKT)的高磷酸化水平是腫瘤發生、發展的主要特征之一。PI3K/AKT信號通路參與多種腫瘤的發生進程，促進腫瘤細胞增殖生長和轉化、抑制其凋亡等[10]，促進宮頸癌發生，在宮頸癌細胞中P13K蛋白表達顯著增加[11]。本研究結果證實，PI3K在維吾爾族、漢族子宮頸鱗癌中的陽性表達率(93.09%，88.89%)高于宮頸炎組織(61.36%，54.35%)，差異有統計學意義(P<0.01)，結果同廖書杰等[12]一致。而維吾爾族、漢族組間的PI3K表達比較，差異無統計學意義(P>0.05)，表明PI3K/AKT信號通路異常激活與宮頸癌細胞的增殖、浸潤和轉移存在相關性。

眾所周知，絲裂原活化蛋白激酶家族(mitogen-activated protein kinases，MAPKs)，參與細胞凋亡和周期的調控，在細胞生物學反應(如細胞增殖、分化、轉化及凋亡等)的過程中具有至關重要的作用[13]，ERK作為細胞存活調節子，是MAPK信號通路中控制細胞存活、增殖和凋亡的關鍵角色[14]。據報道ERK蛋白在除了腦組織以外的各類上皮組織來源的腫瘤中表達水平均高于正常組織[15]，如在卵巢上皮癌組織中則有過高表達[16]。本研究中ERK在子宮頸癌中的陽性表達率(68.30%)低于宮頸炎組織(95.56%)，在維吾爾族、漢族子宮頸鱗癌中的陽性表達率(65.43%，83.33%)均低于宮頸炎組織(97.73%，93.48%)，差異有統計學意義(P<0.01)。ERK在維吾爾族、漢族宮頸鱗癌組織中表達比較，差異有統計學意義(Zc=2.85，P<0.01)。ERK是MAPK信號轉導通路的三級激酶級聯反應的重要因素，ERK相關的細胞內信號轉導途徑被認為是經典MAPK信號轉導途徑，ERK信號通路非常精確和復雜，不同刺激活化的ERK傳遞不同的信息，發生不同的生物學效應。研究中發現，ERK在不同民族間具有表達差異性，很可能是由于民族之間相異的某種機制導致ERK通路異常，影響了腫瘤細胞的增殖、侵襲及分化，從而抑制細胞凋亡的程度。

本研究發現，在維吾爾族子宮頸鱗癌組織中PI3K與IGF-1R(r=0.36，P=0.00)和ER(r=0.23，P=0.00)表達相關；ERK與IGF-1R(r=0.34，P=0.00)有相關性；上述相關性報道尚不多見，ERK和PI3K是MAPK信號轉導通路的三級激酶級聯反應的重要因素，而本研究中IGF-1R在維吾爾族子宮頸鱗癌組織中的表達與其有明顯的相關性，IGF-1可通過下游激酶ERK、PI3K聯合調節大量靶基因而發揮相互獨立的抑制作用，且其受體水平對所調節基因的轉錄調節和下調也是獨立的，由此推測ERK與PI3K可能作為共同靶點作用于IGF-1而改變IGF-1R與ER的相互調節作用。此外，ERK與PI3K顯著相關(r=0.34,P=0.00)說明在維吾爾族子宮頸鱗癌的發生、發展過程當中PI3K/AKT和MAPK/ERK信號轉導通路被同時激活，這在維吾爾族子宮頸鱗癌的發生、發展過程中至關重要。因此，找出針對ERK途徑中各個環節的抑制物，用以切斷信號轉導的途徑，從而達到預防和治療新疆維吾爾族子宮頸鱗癌的目的。

新疆維吾爾族婦女子宮頸癌具有高發病、高病死率的特點，但其機制尚不清楚。因此，作者對ERK在維吾爾族子宮頸鱗癌組織中的研究結果可為進一步研究其發病機制奠定一定的基礎。隨著對多個蛋白表達深入研究，聯合檢測有望成為判斷宮頸癌早期診斷及預后的腫瘤標志物，并為宮頸癌的靶基因治療奠定基礎，也作為維吾爾族宮頸癌機制研究的起點。

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Relation between cervical squamous cancer lesion among Uighur and Han ethnic women in Xinjiang with expression of PI3K,ERK,IGF-1R and ER protein*

DuJing1,RongXiaoling2,NingChao3,ShaJing4△

(1.TeachingandResearchingSectionofFunction,HigherVocationalCollege,XinjiangMedicalUniversity,Urumqi,Xinjiang830011,China;2.DepartmentofClinicalLaboratory,SecondAffiliatedHospital,XinjiangMedicalUniversity,Urumqi,Xinjiang830064,China;3.GraduateSchool,XinjiangMedicalUniversity,Urumqi,Xinjiang830011,China;4.DepartmentofGynecologyandObstetrics,GeneralHospitalofXinjiangProductionandConstructionCorps,Urumqi,Xinjiang830002,China)

[Abstract]ObjectiveTo observe the expression levels of PI3K,ERK,IGF-1R and ER in cervicitis and cervical squamous cancer tissues among Uighur and Han ethnic patients and their correlation.MethodsThe 90 paraffin embedding samples of cervicitis tissue( 46 cases for Han and 44 cases for Uighur) and 224 paraffin embedding samples of cervical squamous cancer tissue(36 cases for Han and 188 cases for Uighur) were collected and detected the protein expression levels by using immunohistochemistry.ResultsThe positive expression rates of IGF-1R and PI3K in cervical squamous cancer were 58.04% and 92.41% respectively,which were higher than 13.33% and 57.78% in cervicitis tissue,the positive expression rates of ER and ERK in cervical squamous cancer were 22.32% and 68.30% respectively,which were lower than 63.33% and 95.56% in cervicitis tissue;the positive expression rate of IGF-1R and PI3K of cervical squamous cancer in Han and Uighur were 69.44%,88.89% and 55.85%,93.09% respectively,which were higher than 15.22%,54.35% and 11.36%,61.36% of cervicitis tissue;the positive expression rate of ER and ERK of cervical squamous cancer in Han and Uighur were 13.89%,83.33% and 23.94%,65.43% respectively,which were lower than 65.22%,93.48% and 61.36%,97.73% of cervicitis tissue respectively;the expression of ERK in Uighur cervical squamous carcinoma tissue was 65.43%,which was lower than 83.33% in Han,the difference was statistically significant (P<0.01).ConclusionPI3K,ERK,IGF-1R and ER protein expression positive or deficiency is closely related to the occurrence of cervical cancer,which may serve as the important biological indicators for detecting cervical cancer,and the ethnic difference of ERK protein expression exists in cervical cancer.

[Key words]uterine cervical neoplasms;phosphoinositide 3 kinase;extracellular signal-regulated kinase;receptor,IGF type1;receptors,estrogen

doi:論著·臨床研究10.3969/j.issn.1671-8348.2016.18.011

基金項目：自治區高校科研計劃立項項目(XJEDU2012I24)；新疆醫科大學科研創新基金項目(XJC201104)。

作者簡介：杜靖(1974-)，副教授，碩士研究生導師，主要從事宮頸癌發病機制研究。△通訊作者，E-mail:1650195334@qq.com。

[中圖分類號]R737.33

[文獻標識碼]A

[文章編號]1671-8348(2016)18-2484-04

(收稿日期：2015-11-18修回日期：2016-03-03)