維生素C對藏豬精液4℃保存及其精子全基因組DNA甲基化的影響

任子利，趙彥玲，王建洲，李瑜鑫，商 鵬，強巴央宗

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維生素C對藏豬精液4℃保存及其精子全基因組DNA甲基化的影響

任子利，趙彥玲，王建洲，李瑜鑫，商 鵬，強巴央宗*

（西藏農牧學院動物科學學院，林芝860000）

摘 要：旨在研究維生素C對藏豬精液4℃保存效果及其精子全基因組DNA甲基化的影響。用手握法采集健康藏豬精液，在改進的豬精液低溫稀釋液中添加不同濃度的維生素C（0.0、2.5、5.0、7.5、10.0g·L－1），4℃保存到第5天時，以藏豬精子活力、精子畸形率、精子頂體完整率和質膜完整率為評價指標，探討維生素C對藏豬精液4℃保存的效果；用甲基化熒光定量法檢測藏豬新鮮精液組、保存到第5天時未添加維生素C組、添加維生素C組（添加維生素C最佳效果組5.0g·L－1）精液DNA甲基化的水平，以探討維生素C對藏豬精液4℃保存所造成的精子全基因組DNA甲基化的影響。結果顯示：添加5.0g·L－1維生素C組其精子活力、畸形率、頂體完整率和質膜完整率均顯著好于其它組（P＜0.05）；鮮精組、未添加維生素C組、添加維生素C組的DNA甲基化水平分別為（0.604 7±0.040 3）、（0.920 2±0.016 9）、（0.656 9±0.048 3）ng，鮮精組與添加組均顯著低于未添加組（P＜0.05），而鮮精組與添加組間差異不顯著（P＞0.05）。綜上表明，在改進的豬精液稀釋液中添加5.0g·L－1維生素C可以明顯改善藏豬精液4℃保存的效果，并且可以明顯降低4℃保存對藏豬精液精子全基因組DNA甲基化的影響，這將為藏豬精液低溫保存的生產應用奠定基礎。

關鍵詞：維生素C；藏豬精液；4℃保存；DNA甲基化

藏豬主要分布于雅魯藏布江流域中游河谷區和藏東三江流域中游高山深谷區，是中國特有的能適應高海拔地區的一個重要品種［1］，有“高原之珍”的美譽。為促進藏豬產業的大發展，開展人工授精是不可或缺的環節，這就需要解決藏豬精液的妥善保存問題。冷凍能長期保存豬精液，但人工授精的受胎率低至1%［2］，常溫保存人工授精的效果好又方便經濟，但受到保存時間的限制，且公豬精液18℃保存會引發脂質過氧化，降低線粒體膜電位，提高等離子體膜透性［3］。低溫保存比如4℃從理論上講，因低溫下精子代謝活動水平更低，保存時間比常溫長，同時可應用普通冰箱保存，經濟方便。但是，在精液低溫保存過程中，豬精子對低溫的耐受能力比其他家畜差，容易發生冷休克，精子處于氧化應激狀態，產生大量的活性氧（ROS），對精子結構及功能造成損傷，甚至誘發其凋亡［4－5］。精子的DNA甲基化異常能預示男性的生育能力及其胚胎質量［6］。維生素C是一種廉價易得的抗氧化劑，如在藏豬精液4℃保存稀釋液中添加維生素C，就有可能對抗低溫對精子造成的活性氧及基因組甲基化水平異常，也就可能提高藏豬精液4℃保存的效果。李芳［7］認為6mg·mL－1維生素C能有效提高豬精液冷凍質量，陸媚等［8］認為添加2.00mg·mL－1水蛭素能顯著提高豬精液低溫保存的效果。M.Benchaib等［9］研究輔助生殖技術中精子的DNA甲基化。F.J.Cisneros［10］研究DNA甲基化與男性不育的關系。但關于維生素C對藏豬精液4℃保存及其精子全基因組DNA甲基化的影響的研究目前未見相關報道。因此，本研究擬在改進的豬精液低溫稀釋液中添加不同質量濃度的維生素C（0.0、2.5、5.0、7.5、10.0g·L－1），4℃保存到第5天時，以藏豬精子活力、精子畸形率、精子頂體完整率和質膜完整率為評價指標，探討維生素C對藏豬精液4℃保存的效果；用甲基化熒光定量法檢測藏豬新鮮精液組、保存到第5天時未添加維生素C組、添加維生素C組（添加維生素C最佳效果組5.0g·L－1）精子DNA甲基化的水平，以探討維生素C對藏豬精液4℃保存所造成的精子全基因組DNA甲基化的影響，為藏豬精液低溫保存的進一步研究奠定基礎。

1 材料與方法

2015年5月－11月在西藏大學農牧學院藏豬研究中心進行試驗。

1.1 材料

1.1.1 主要試劑與儀器設備 維生素C（西安利君制藥有限公司）、考馬斯亮藍（國藥集團化學試劑有限公司）、Diff－Quik染液、亞衛牌精液稀釋粉（丹麥）、瓊脂糖（西班牙）、溴化乙錠（EB）（Sigma公司）、MethylFlashTMMethylated DNA Quantification Kit（Epigentek公司）、新鮮藏豬精液由西藏大學農牧學院實習基地提供。

倒置熒光顯微鏡（NI－KON TE2000，日本）、冰箱（青島海爾股份有限公司）、電熱恒溫水槽（上海精宏實驗設備有限公司）、NanoDrop?ND－1000紫外分光光度計（美國NanoDrop公司）、Eppendorf Centrifuge 5417R離心機（德國Eppendorf公司）、M200熒光酶標儀（TECAN公司）。

1.1.2 改進的低溫稀釋液配制 參照孫時軍等［11］的試驗結果，使用亞衛牌精液稀釋劑作為基礎稀釋劑，在稀釋后的精液中加入1%乙二醇作為低溫保護劑。

1.1.3 精液采集及處理 用手握法采集健康藏豬精液，采用兩次稀釋法將藏豬精液（精子活力0.8以上）做4倍稀釋，用數層紗布包裹后放入培養箱中，17℃平衡2h后，放入冰箱4℃保存。

1.2 試驗方法

1.2.1 精子質量評價 精子活力：用平板壓片法測出直線前進運動的精子占總精子的百分率。精子畸形率：用商品化Diff－Quik染液染色檢測畸形率。精子頂體完整率：考馬斯亮藍R250染色法。精子質膜完整率：低滲腫脹試驗—HOST。具體方法參照文獻［4］。

1.2.2 精子基因組DNA甲基化檢測 用苯酚—氯仿抽提法提取藏豬新鮮精液組、保存到第5天時未添加維生素C組、添加維生素C組（添加5.0g·L－1維生素C最佳效果組）這3組精液其精子的基因組DNA，用NanoDrop?ND－1000紫外分光光度計檢測其濃度、純度，用瓊脂糖凝膠電泳檢測其完整性，當其純度為1.8～2.0、檢測結果為未擴散的清晰、單一、整齊的條帶時，表明所提取的DNA質檢合格，然后按照MethylFlashTMMethylated DNA Quantification Kit說明書提供的方法進行操作，再按照要求作出標準曲線后，計算樣品DNA中甲基化的DNA量。

1.3 試驗設計

1.3.1 維生素C對藏豬精液4℃保存的影響試驗分5組，在改進的豬精液低溫稀釋液中添加不同質量濃度的維生素C（0.0、2.5、5.0、7.5、10.0 g·L－1，分別對應第1、2、3、4、5組），4℃保存到第5天時以藏豬精子活力、精子畸形率、精子頂體完整率和質膜完整率為評價指標，探討維生素C對藏豬精液4℃保存的效果。試驗重復3次。

1.3.2 維生素C對藏豬精液4℃保存所造成的精子全基因組DNA甲基化的影響 試驗分3組：藏豬新鮮精液組、保存到第5天時未添加維生素C組、添加維生素C組（添加維生素C 5.0g·L－1最佳效果組）。用甲基化熒光定量法檢測這3組精液DNA甲基化的水平，以探討維生素C對藏豬精液4℃保存所造成的精子全基因組DNA甲基化的影響。試驗重復3次。

1.4 數據分析

所得試驗數據用Excel進行前期處理，再用SPSS17.0軟件進行單因素方差分析，并進行多重比較，試驗結果用“平均數±標準誤”表示，確定差異的顯著性，P＜0.05為差異顯著，柱狀圖使用Sigma－Plot 10.0軟件制作。

2 結 果

2.1 維生素C對藏豬精液4℃保存的影響

由表1可以看出，藏豬精液4℃保存到第5天時，第3組即添加5.0g·L－1維生素C組的精子活力、精子畸形率、精子頂體完整率和質膜完整率：0.69、15.11%、64.58%、61.33%，這4個指標均顯著好于其他組（P＜0.05）。

表1 維生素C對藏豬精液4℃保存的影響Table 1 Effect of vitamin C at 4℃on the preservation of Tibetan boar semen

2.2 DNA質檢結果

經NanoDrop?ND－1000紫外分光光度計檢測提取到的3組藏豬精液的精子全基因組DNA，其濃度為300～350ng·μL－1、純度為1.9～2.0、凝膠電泳圖結果如圖1所示，條帶未擴散且清晰、單一、整齊，表明所提取的DNA質檢合格，把濃度均稀釋成100ng·μL－1，可用于后續試驗。

2.3 藏豬精子基因組DNA甲基化水平檢測結果

2.3.1 標準曲線 標準曲線用的6個點的陽性對照（50%甲基化的DNA）的量分別為0.0、0.5、1.0、 2.0、5.0、10.0ng。如圖2所示，線性回歸分析取前4個點，擬合的曲線：y＝1 115.5x＋119.2，擬合度R2為0.990 4。根據該斜率計算5－mC含量及百分比。

根據前4個點擬合的曲線線性較好，結果可靠。

2.3.2 藏豬精子基因組DNA甲基化水平定量結果 如圖3所示，鮮精組、未添加維生素C組、添加維生素C組的DNA甲基化水平（（0.604 7± 0.040 3）、（0.920 2±0.016 9）、（0.656±0.048 3）ng）中，鮮精組與添加組均顯著低于未添加組（P＜0.05），而鮮精組與添加組間差異不顯著（P＞0.05）。結果表明，添加質量濃度5.0g·L－1維生素C可以明顯改善藏豬精液4℃保存的效果，并且可以明顯降低4℃保存對藏豬精子DNA甲基化的影響。

圖1 DNA電泳Fig.1 Electrophoresis results of genomic DNA

圖2 5－mC檢測得到的標準曲線Fig.2 Standard curve of 5－mC quantity

圖3 100ng精子DNA中5－mC的量Fig.3 5－mC amount of every 100ng sperm DNA

3 討 論

3.1 維生素C對藏豬精液4℃保存的影響

李芳［7］認為黃酮類、維生素C、多不飽和脂肪酸和維生素E這些抗氧化劑對豬冷凍精子均有保護作用，其中6mg·mL－1維生素C的適宜添加濃度為6mg·mL－1，而本研究中添加5.0g·L－1維生素C則可以明顯改善藏豬精液4℃保存的效果，二者結果基本一致，至于需要添加的維生素C濃度略有不同，這可能是4℃保存產生的活性氧比冷凍少些，所以需要的維生素C濃度也相對稍低。適宜濃度的L－精氨酸也可以明顯改善4℃豬精液的保存效果［12］。可見，以藏豬精子活力、精子畸形率、精子頂體完整率和質膜完整率為評價指標，這些抗氧化劑均能對豬精液4℃保存有較好的效果。

3.2 維生素C對藏豬精液4℃保存所造成的精子基因組DNA甲基化的影響

表觀遺傳修飾是精子的特征性標志物，對保證精子的正常形態和機能至關重要，DNA甲基化、組蛋白修飾、RNAs以及精蛋白等異常會導致精子機能降低和胚胎發育失敗，甚至誘發后代表觀遺傳疾病的發生［13］。K.E.Waterhouse等［14］研究表明，冷凍程序改變了牛精子DNA的完整性。G.B.Boe－Hansen等［15］用精子染色質結構分析（SCSA）研究公豬精液液體保存后其精子染色質結構的完整性與生育力的關系，認為SCSA技術可能能鑒定出個體的低繁殖力甚至（由這些個體輸精所導致的）低窩產仔數，而且將來能在成本效益分析后應用于養豬業。全基因組DNA甲基化的分析揭示了一個正常的啟動子甲基化CpG島［16］。M.Benchaib等［17］通過免疫組化染色，用流式細胞儀定量分析表明：在正常的輔助生殖程序中，研究人類精子是否具有讓人受孕能力的一種新方法便是看精子全基因組DNA甲基化水平。全基因組DNA甲基化與水牛生育能力有關［18］。O.Tunc等［19］研究也有類似的結論，即人類精子DNA片段化同全基因組DNA甲基化間存在負相關，添加抗氧化劑可以減少DNA損傷并且使精子DNA甲基化狀態正常。這與本研究結果一致。然而，也有相反的結論，認為冷凍保存對于人類精子DNA甲基化沒有影響［20］，這可能與物種及試驗條件等有關，若究其原因，尚需進一步研究。

4 結 論

本研究結果表明，在改進的豬精液稀釋液中添加5.0g·L－1維生素C可以明顯改善藏豬精液4℃保存的效果，并且可以明顯降低4℃保存對藏豬精子基因組DNA甲基化的影響，這將為藏豬精液低溫保存的生產應用奠定基礎。

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（編輯 程金華）

Effect of Vitamin C on Tibetan Boar Semen Preserved at 4℃and Levels of the Sperm Global Genome DNA Methylation

REN Zi－li，ZHAO Yan－ling，WANG Jian－zhou，LI Yu－xin，SHANG Peng，CHAMBA Yangzom*
（Faculty of Animal Science，Tibet Agricultural and Animal Husbandry College，Linzhi 860000，China）

Abstract：This research was conducted to study the effect of vitamin C on Tibetan boar semen preserved at 4℃and the subsequent influence on global genome DNA methylation.The semen was collected from Tibetan boar and preserved at 4℃in modified medium supplemented with vitamin C at 0.0，2.5，5.0，7.5，10.0g·L－1.Sperm motility，abnormality，acrosome integrity and plasma membrane integrity were evaluated 5days after preservation.And the global methylation level of the fresh and preserved sperm was detected by using MethylFlashTM.The results showed that a significantly higher sperm motility and plasma membrane integrity，acrosome integrity and less abnormality was observed in group supplemented with 5.0g·L－1vitamin C（P＜0.05）.DNA methylation levels of fresh sperm（0.604 7±0.040 3）ng and sperm preserved with vitamin C（0.656 9±0.048 3）ng were significantly lower than those preserved without vitamin C （0.920 2±0.016 9）ng（P＜0.05），but no significant difference was found between fresh semenand sperm preserved with vitamin C（P＞0.05）.These results indicated that supplementation of vitamin C at 5.0g·L－1semen extender could improve quality of Tibetan boar semen preservation at 4℃and mitigate effect on DNA methylation of Tibetan boar sperm.The results in the current study would be helpful for further investigation of the freezing protocol for Tibetan boar semen.

Key words：vitamin C；Tibetan boar semen；preservation at 4℃；DNA methylation

中圖分類號：S828.8＋9.2；S814.8

文獻標志碼：A

文章編號：0366－6964（2016）05－1057－05

doi：10.11843/j.issn.0366－6964.2016.05.025

收稿日期：2015－11－25

基金項目：2014年畜牧資源平臺建設；2013年畜牧體系研究團隊；科技部支撐項目（2012BAD03B03）；西藏自治區自然科學基金資助項目（2015ZR－13－32）

作者簡介：任子利（1969－），男，河南衛輝人，副教授，博士，主要從事動物繁殖研究，E－mail：zlren0925@163.com，Tel：0894－5822924

*通信作者：強巴央宗，教授，E－mail：qbyz628@126.com