虹鱒魚傳染性造血器官壞死癥病毒的分離和鑒定

李寶玉，吳鵬程，范玉峰（.蘭州威特森生物科技有限公司，甘肅　蘭州　73000；.蘭州市漁業技術推廣中心，甘肅　蘭州　73000）

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虹鱒魚傳染性造血器官壞死癥病毒的分離和鑒定

李寶玉1，吳鵬程2，范玉峰2
（1.蘭州威特森生物科技有限公司，甘肅蘭州730010；2.蘭州市漁業技術推廣中心，甘肅蘭州730020）

摘要：本試驗從甘肅永登爆發疫情的虹鱒魚養殖場共采集了四次病料，分離出1株優勢毒株，對新分離的毒株進行培養增殖，在EPC細胞上增殖良好，且可引起良好的病變；根據IHNV的保守基因N基因序列，設計特異性引物，結果擴增出786 bp的片段。對該片段進行測序分析，發現與IHNV的參考序列有較高的相似性，證實該毒株為傳染性造血器官壞死癥病毒。結果表明傳染性造血器官壞死病毒（IHNV）在永登虹鱒魚中的存在與傳播，本研究為我國北方地區IHN疫情動態監測和防控提供依據。

關鍵詞：IHNV；虹鱒魚；分離；鑒定

傳染性造血器官壞死癥（Infectious Hematopoietic Necrosis IHN）是彈狀病毒科的虹鱒傳染性造血器官壞死癥病毒（Infectious Hematopoietic Necrosis virus IHNV）引起的分布廣泛、死亡率高、危害極大的鮭科魚類病毒性傳染病。該病1985年開始在我國東北地區各養蹲場陸續發現，目前有蔓延和加劇的趨勢，對養鱒業造成了毀滅性打擊［1、2］。近幾年，我國每年從國外引進大批的鮭魚魚卵，但因檢疫技術的不完善，致使危害嚴重、傳播力強、防治困難的傳染性造血器官壞死癥傳入我國并蔓延開來，使正在發展中的我國虹鱒養殖業留下了無窮禍患和潛在危機。

近年來省內的虹鱒魚養殖場大多從外省購進發眼魚卵自行孵化魚苗，當上浮稚魚攝食一月左右時大面積爆發疫情，表現為病稚魚體發黑，游動遲緩，隨水漂流，有時出現痙孿動作，有時一邊翻滾、一邊漂流，或靜臥池底或狂游沉入池底而死亡，腹部膨大，有淤血斑，肌肉“V”字型或線型出血，尾柄充血，腹鰭基部和肛門周圍充血，有的在肛門拖著長而不透明的白色糞便，死亡率達90%以上，對虹鱒魚的養殖造成毀滅性打擊，我省境內的大多數虹鱒魚養殖場處于停產狀態。為保障我市、我省乃至我國的養鱒業得到快速、健康的發展，對IHN疫情進行監測具有很重要的現實意義。

1　材料與方法

1.1材料

1.1.1主要材料及試劑患病魚是2013年8月采自甘肅永登虹鱒魚養殖場（體重約為20 g）；M199培養基為美國Gibco公司產品；胎牛血清購自杭州四季青生物工程公司；RNA提取試劑盒、PCR試劑盒均購自大連TaKaRa有限公司；pMD18-T載體、感受態細胞DH5α、DL-2000、質粒提取試劑盒等均為TaKaRa公司產品；鯉魚上皮瘤細胞（EPC）購自中國動物檢疫研究所；其余試劑均為分析純產品。

1.1.2引物根據已發布IHNV的保守基因N基因序列設計特異性引物，序列為：

利用該特異性引物預期擴增出大小為786 bp的片段，引物終濃度均為20μmol/L。

1.2實驗方法

1.2.1傳染性造血器官壞死癥病毒的分離

1.2.1.1組織病料的處理用組織研磨機將采集的病料組織樣品（包括腦、肝、胰腺、脾和腎）勻漿，然后用含有雙抗的M199細胞培養液按1：10的稀釋度制備成組織懸浮液，于4℃過夜孵育。7 000 r/min離心15 min，收集上清液。

1.2.1.2病毒在敏感細胞上的增殖將上清液用0.45μ的濾膜過濾除菌，然后接種生長狀態良好的EPC單層細胞，20℃吸附1 h后，加入含2%胎牛血清的細胞維持液，置于20℃低溫培養箱中培養，待細胞感染病毒后出現細胞病變（CPE）后收集細胞培養物備用。

1.2.2傳染性造血器官壞死癥病毒的RT-PCR鑒定

1.2.2.1IHNV基因組RNA的提取和cDNA模板的合成用RNA提取試劑盒從有明顯病變的細胞培養物中提取IHNV基因組作為模板，在PCR管中加入20μL模板溶液和2μL引物IHNS，加8μL DEPC水至總體積為30μL，置于70℃水浴反應5 min后立即冰浴然后反應管中繼續加入：10μL 5倍逆轉錄酶濃縮緩沖液、5μL dNTP、1μL RNA酶抑制劑（20U）、2μL逆轉錄酶AMV（10IU），最后加DEPC水定容至50μL，混勻后42℃反應60 min，合成模板cDNA。

1.2.2.2N基因的擴增用1.2.2.1合成的cDNA作為模板，加入模板和上、下游引物進行N基因的擴增，反應體系為50μL，反應條件：94℃4 min后，變性94℃1 min，55℃退火1 min，72℃延伸 1 min；，30次循環，最后72℃引伸10 min。

1.2.1.3擴增片段序列分析將PCR產物進行序列測定、分析，與GENBANK中已登錄的IHNV序列進行比較分析。

2　結果與分析

2.1IHNV在EPC細胞上的增殖

將采集的病料組織經研磨、浸毒和過濾等處理后接種生長兩天的EPC細胞，在14℃條件下盲傳，傳至第三代五天就可出現典型的病變。（見圖1、見圖2）

圖1　正常的EPC細胞接種

圖2　IHNV五天后的EPC病變細胞

2.2從EPC細胞傳至第五代出現明顯病變后收集的細胞毒中提取總RNA，用設計的一對特異性引物經RT-PCR擴增出大小786 bp的片段，結果與預期相符。（見圖3）

2.3將PCR擴增的IHNV核蛋白基因產物純化回收，克隆于pMD18-T載體中，然后轉化感受態細胞DH5α，將提取的陽性質粒測序，序列分析結果顯示目的片段為IHNV部分核蛋白基因，與發布于NCBI上編號為J04321和IHU50402的核蛋白基因序列的相似性為98.6%和97.2%。

圖3　M為DL-2000 Marker 1、2、3為PCR擴增產物用于鑒定IHNV的部分核蛋白基因RT-PCR產物的電泳圖

3　討論

我國是漁業生產大國，水生動物貿易在我國進出口貿易中占有重要的地位。但是近年來，從國內到國外，水生動物養殖病害普遍加重，嚴重威脅著漁業經濟的健康發展。甘肅冷水資源豐富，是我國虹鱒魚養殖大省［3、4］，但由于近年來IHN持續爆發和流行，對養鱒也造成了毀滅性打擊，絕大多數虹鱒魚養殖場處于停產狀態。目前為止我國對IHN的研究還比較少，尚未有該病毒檢測方法的行業標準和國家標準，國內外也沒有防控該病的疫苗上市，現有的DNA疫苗處于研發階段［5］。

國外對感染IHNV的病魚采取的措施是全部消毀，養殖場地和設備進行全面消毒。在我國，對于養殖者來說，只考慮當前的經濟損失，不考慮長遠利益，僅僅是想辦法推遲和減輕病魚的死亡，致使IHN傳播范圍愈來愈廣泛。加上IHNV非常穩定，對外界環境有較強的抵抗力，IHN流行停止后幸存魚群處于帶毒狀態，這些病毒攜帶者通過排泄物散毒，其卵和精液也帶有IHNV，使養殖環境持續處于污染狀態。因此，對IHN的流行病學調查、快速檢測及防治愈發顯得重要。

參考文獻：

［1］牛魯琪，趙志壯.東北地區虹鱒IHN和IPN流行病學的初步研究［J］.水產學報，1988，（12）：327-331.

［2］趙志壯，牛魯琪.中國本溪虹鱒魚傳染性造血器官壞死癥（IHN）的初步研究［J］.鮭鱒漁業，1991（4）：5-6.

［3］羅浩亮.甘肅金鱒養殖技術研究［J］.水產養殖，2007（11）：8-9.

［4］劉陽河.甘肅省鮭鱒魚養殖現狀與發展途徑［J］.甘肅農業科技，2004（10）：51-52.

［5］Kurath G，Garver KA.Protective immunity and lack of histopathological damage two years after DNA vaccination against infectious hematopoietic necrosis virus in trout［J］.Vaccine，2006，24（3）：345-54.

中圖分類號：S965.122

文獻標識碼：

文章編號：1006-799X（2015）02-0035-02

作者簡介：李寶玉（1973-），男，甘肅岷縣人，助理研究員，主要從事預防獸醫學。