普通小麥轉錄因子基因TaWRKY35的克隆及功能分析

劉自成，苗麗麗，王景一，楊德龍，毛新國，景蕊蓮

（1甘肅農業大學生命科學技術學院，蘭州 730070；2中國農業科學院作物科學研究所/農作物基因資源與基因改良國家重大科學工程/農業部農作物種質資源創新與利用重點開放實驗室，北京 100081）

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普通小麥轉錄因子基因TaWRKY35的克隆及功能分析

劉自成1,2，苗麗麗2，王景一2，楊德龍1，毛新國1,2，景蕊蓮2

（1甘肅農業大學生命科學技術學院，蘭州 730070；2中國農業科學院作物科學研究所/農作物基因資源與基因改良國家重大科學工程/農業部農作物種質資源創新與利用重點開放實驗室，北京 100081）

摘要：【目的】非生物逆境是制約小麥生產的主要因素。WRKY轉錄因子是植物特有的轉錄因子家族，參與對多種非生物逆境脅迫的應答。普通小麥基因組中至少含有200個WRKY，目前僅對少數成員的功能進行了鑒定。通過克隆小麥 WRKY轉錄因子 TaWRKY35并揭示其功能，為改良小麥的抗逆性提供基因資源。【方法】利用小麥全長cDNA數據信息，從強抗旱小麥品種旱選10號中克隆逆境脅迫應答轉錄因子基因TaWRKY35；采用實時定量PCR技術，分析目標基因在不同發育時期、不同組織器官中的表達水平，以及在PEG-6000、NaCl、ABA和低溫等逆境脅迫下的表達模式；構建目標基因與GFP融合的表達載體，轉化小麥原生質體，以確定目標蛋白在細胞中的作用位置；構建TaWRKY35過表達載體，通過農桿菌介導的方法轉化擬南芥，揭示目標基因的功能。【結果】TaWRKY35的開放閱讀框全長1 134 bp，編碼377個氨基酸的蛋白。TaWRKY35的N端有一個典型的WRKY結構域，C端有一個C2HC型的鋅指結構域，屬于WRKY家族第Ⅲ亞家族。測序發現TaWRKY35編碼區序列非常保守，在32份多態性較高的六倍體小麥材料中未檢測到DNA多態性。TaWRKY35在小麥的不同發育時期、不同組織中均有表達，其中在幼苗根基部表達量最高，約為苗期葉片中表達量的26倍；其次為幼芽根基，約為苗期葉片中表達量的21倍；接下來依次為孕穗期莖節、孕穗期穗、芽期根、孕穗期根、苗期根、胚芽、孕穗期葉片，而在幼苗葉片中表達水平最低；同時在ABA、NaCl、PEG和低溫脅迫條件下，小麥幼苗TaWRKY35的表達量均顯著上升，表明TaWRKY35參與對4種逆境脅迫的應答，但在不同脅迫條件下表達模式差異顯著，其中對鹽脅迫最敏感。亞細胞定位發現，TaWRKY35特異定位在細胞核上，是典型的核定位蛋白。在高鹽脅迫條件下，TaWRKY35過表達轉基因擬南芥子葉白化率顯著低于對照，TaWRKY35過表達轉基因擬南芥的細胞膜穩定性和幼苗存活率均顯著高于野生型對照，表明TaWRKY35能增強植物的耐鹽性。【結論】TaWRKY35編碼蛋白含有WRKY和C2HC結構域，為WRKY家族第Ⅲ亞家族成員。TaWRKY35在小麥發育的不同時期、不同組織中均有表達，且受ABA、PEG、NaCl及低溫等逆境脅迫誘導。過表達TaWRKY35能顯著提高轉基因擬南芥的耐鹽性。

關鍵詞：小麥；WRKY轉錄因子基因；非生物脅迫；耐鹽性

聯系方式：劉自成，E-mail：liuyao8916@163.com。通信作者楊德龍，Tel：0931-7631875；E-mail：yangdl@gsau.edu.cn。通信作者毛新國，Tel：010-82105829；E-mail：maoxinguo@caas.cn

0 引言

【研究意義】小麥是世界上重要的糧食作物之一，干旱、高鹽、極端溫度等非生物逆境是制約小麥生產的主要因素。克隆抗逆基因，揭示其功能是利用現代生物技術改良小麥抗逆性的前提和基礎。【前人研究進展】遭受逆境脅迫時，植物在分子、細胞和生理水平產生一系列變化以適應不利環境［1-2］。植物體內參與逆境脅迫應答的基因很多，根據基因產物的功能分為兩大類：功能蛋白和調節蛋白，其中，功能蛋白主要包括水通道蛋白、LEA蛋白、滲透調節物質合成的酶類以及各種抗氧化酶等；調節蛋白則包括蛋白激酶、蛋白磷酸酶和轉錄因子等。WRKY轉錄因子是植物特有的一類轉錄因子，因其 N端含有高度保守的WRKYGQK基序而得名。WRKY轉錄因子最早發現于甘薯中［3］，隨后在野燕麥、荷蘭芹、擬南芥、馬鈴薯、白英、煙草和水稻中相繼被發現［4］。WRKY家族成員均含1—2個與DNA結合的WRKY結構域，該結構域由 60個左右高度保守的氨基酸組成，其中WRKYGQK是核心序列，該序列氨基酸突變將導致DNA結合活性的減弱，甚至喪失［5］；WRKY成員的C端包含一個鋅指結構域，即 C2H2或者 C2HC。根據WRKY結構域的數量和鋅指結構域的類型將WRKY家族分成3個亞家族（Group）［4］：亞家族Ⅰ（GroupⅠ）有2個WRKY結構域和1個C2H2（CX4-5CX22-23HX1H）型鋅指結構域；亞家族Ⅱ（GroupⅡ）成員只含有 1 個WRKY結構域和1個C2H2結構域；亞家族Ⅲ（GroupⅢ）成員含1個WRKY結構域和1個C2HC型（即CX7CX23HX1C）鋅指結構域［6］。WRKY轉錄因子通過WRKY結構域特異識別目標基因啟動子區域的（T）（T）TGAC（C/T）序列（W-box）進而調控目標基因的表達［4，7］。研究發現，WRKY轉錄因子在植物生長發育過程中起重要作用，并參與抗病應答［8］。近期越來越多的證據表明，WRKY轉錄因子通過ABA依賴或者非ABA依賴的逆境信號轉導途徑參與對非生物逆境脅迫的應答［9-11］。過表達WRKY轉錄因子可以增強植物的抗逆性，例如過表達 AtWRKY25、AtWRKY33能顯著增強轉基因擬南芥對高溫和高鹽的耐受性［12-14］；過表達BdWRKY36能顯著增強煙草對干旱的耐受性［15］；過表達GmWRKY13、GmWRKY21和GmWRKY54能增強植物對多種非生物逆境脅迫的耐受性［16］；過表達OsWRKY11能夠提高水稻對高溫、干旱等脅迫的耐受性［17］，過表達OsWRKY47能提高水稻的抗旱性［18］。研究推測，普通小麥基因組中至少含有200個WRKY基因［19］，但目前僅有少數成員的功能被鑒定，其中 TaWRKY10（GroupⅡ）、TaWRKY44（GroupⅠ）參與對多種非生物逆境脅迫的應答，過量表達能增強植物的抗旱性和耐鹽性［20-21］；2012年，NIU等［22］在小麥cDNA文庫中發現了43個WRKY轉錄因子，其中TaWRKY2（GroupⅠ）受干旱、鹽和ABA誘導表達，過量表達TaWRKY2能提高轉基因擬南芥的抗旱、耐鹽性。TaWRKY19（GroupⅠ）除受上述3種逆境脅迫誘導外，還參與對冷脅迫的應答，過量表達該基因能提高擬南芥的抗旱、耐鹽及耐凍性［22］。2015年，QIN等［23］研究發現TaWRKY93參與對鹽脅迫和 ABA處理的應答，過量表達 TaWRKY93 （GroupⅡ）能提高擬南芥對多種非生物逆境的耐受性。【本研究切入點】已有研究證明，小麥 WRKY轉錄因子參與對非生物脅迫的應答，然而迄今為止，僅對GroupⅠ、GroupⅡ的個別基因進行了功能分析，而關于 Group Ⅲ成員的功能研究尚未見報道。TaWRKY35屬于WRKY Group Ⅲ，它是否參與非生物脅迫的應答，以及其在逆境脅迫應答反應的功能目前均不明確。【擬解決的關鍵問題】本研究克隆了一個新的小麥 WRKY基因，屬于 Group Ⅲ，命名為TaWRKY35。對其在不同發育時期、不同組織的特異性表達水平，在ABA、PEG、NaCl、低溫逆境脅迫處理的表達模式，以及在細胞中的作用部位進行分析，并通過轉化擬南芥鑒定其功能，旨在為利用 WRKY轉錄因子提高小麥抗逆性提供理論依據。

1 材料與方法

1.1 植物材料及其培養

試驗于 2014—2015年在中國農業科學院作物科學研究所進行。利用農業部農作物種質資源創新與利用重點開放實驗室保存的強抗旱小麥品種旱選 10號進行基因克隆、基因表達模式分析和目標蛋白的亞細胞定位。挑選大小均勻一致的旱選10號種子放在玻璃培養皿中，在光照培養箱（23℃、光周期12 h·d-1）中水培，待幼苗成長至一葉一心（10 d苗齡）時，分別用50 mmol·L-1ABA、16.1％ PEG-6000（-0.5 MP）、250 mmol·L-1NaCl和低溫（4℃）進行脅迫處理，在處理0、0.5、1、1.5、2、3、6、12、24、48和72 h取幼苗葉片，-80℃保存，用于分析目標基因逆境脅迫條件下的表達模式。在培養皿上水培旱選10號，芽期取根部、根基部、胚芽；田間種植旱選10號，苗期取幼苗的根、根基和葉片，孕穗期取莖節，孕穗后期取根、葉和幼穗，-80℃保存，用于分析目標基因的組織特異表達。挑選籽粒飽滿的小麥種子在培養皿中，用去離子水室溫避光培養，培養至一葉一心時，取黃化幼苗葉片的中段制備原生質體，進行目標蛋白的亞細胞定位。

基因染色體定位材料包括普通小麥二倍體供體種材料：烏拉爾圖小麥（UR200、UR204、UR205）、擬斯卑爾托山羊草（Y2017、Y2033、Y2035和Y2178）、粗山羊草（Ae38、Ae46和Y57）；四倍體材料（DS1、DM49和DM50）和異源六倍體普通小麥材料旱選10號。基因多態性分析材料為農業部農作物種質資源創新與利用重點開放實驗室前期利用 SSR標記篩選的32份高多態性材料（表1）。室溫條件下水培，取幼苗葉片提取DNA。

1.2 目的基因克隆

利用WRKY保守結構域搜索小麥全長cDNA數據庫，得到目標基因的cDNA序列。根據cDNA序列信息設計引物WRKY35-C-F和WRKY35-C-R（表2），以旱選10號小麥cDNA為模板進行PCR擴增目標基因。以目標基因的cDNA序列為源序列，搜索小麥A基因組數據庫和D基因組數據庫，通過A基因組數據庫得到的基因組序列與cDNA序列一致性最高，以該基因組序列為模板，利用Primer Premier 5.0軟件設計擴增全長序列的引物TaWRKY35-F和TaWRKY35-R（表2）。

用植物總RNA提取試劑盒（TIANGEN，北京）提取小麥不同脅迫處理的葉片和不同組織的總RNA。以總RNA為模板，用M-MLV Reverse Transcriptase反轉錄試劑盒（Invitrogen，美國）反轉錄合成第一鏈cDNA。以cDNA為模板，利用高保真聚合酶TransStart Fast Pfu（Transgen，北京）進行RT-PCR擴增。反應體系包含模板DNA（50 ng·μL-1）2 μL、5×TransStart Fast Pfu buffer 4 μL、2.5 μmol·L-1dNTP 1.6 μL、DNA Polymerase 0.4 μL、正、反向引物（10 μmol·L-1）各0.8 μL，用ddH2O補足20 μL。反應條件為95℃ 5 min；95℃ 45 s，60℃ 45 s，72℃ 60 s，38個循環；72℃ 10 min。用1.5％瓊脂糖凝膠分離PCR產物，將目的片段用 PCR產物純化試劑盒（生工，上海）回收后，與pEASY-Blunt載體（Transgen，北京）連接，用BigDye Terminator Kit（ABI，美國）測序。

1.3 基因結構和序列分析

用DNAStar軟件包中Seqman和MegAlign進行基因序列分析、拼接和比對，用DNAman進行蛋白序列比對分析，用MEGA（Version 6.06）構建系統進化樹。

表1　供試小麥材料Table 1 Wheat accessions used in this study

表2　試驗中使用的引物Table 2 Primers used in the experiments

1.4 載體構建和亞細胞定位

利用生物信息學網站（http：//cello.life.nctu.edu.tw）預測 TaWRKY35在細胞中的定位。為進一步驗證預測結果，設計亞細胞定位引物（分別在引物5′和3′端引入了HindⅢ和BamHⅠ酶切位點），將TaWRKY35全長CDS（coding sequence）序列（不含終止密碼子）克隆到 pJIT163-GFP載體融合表達，構建 pJIT163-35S：：TaWRKY35：：GFP載體。用PEG法轉化小麥原生質體，室溫避光培育15 h，在Zeiss LSM700激光共聚焦顯微鏡下觀察TaWRKY35-GFP在小麥原生質體中的定位。

1.5 目標基因的實時定量RT-PCR檢測

根據TaWRKY35全長CDS序列設計qRT-PCR引物WRKY35-RT-F和WRKY35-RT-R，以小麥Actin （JQ269668.1）的引物 Actin F1和 Actin R1為qRT-PCR內參引物（表2）。根據SYBR Premix Ex Taq （Perfect Real Time）試劑盒（TaKaRa，日本）說明書操作，反應體系為1/10 cDNA first-strand 1.0 μL、2× SYBR Premix Ex Taq 10.0 μL、50×ROX Reference Dye 0.4 μL、正、反向引物（5 μmol·L-1）各0.4 μL，用ddH2O補至20 μL。用ABI 7900實時定量PCR儀進行PCR擴增，反應條件為95℃ 30 s；95℃ 5 s，退火30 s，40個循環。數據采用2-△△CT法計算目標基因的相對表達量［24］。

1.6 擬南芥轉化及其耐鹽性鑒定

利用KpnⅠ和BamHⅠ酶切位點將TaWRKY35全長CDS序列克隆到pCHF3載體上。將構建的載體轉化農桿菌GV3101菌株，采用浸花法轉化擬南芥。經卡那霉素抗性篩選和PCR檢測后獲得T3純合轉基因株系，選取目標基因表達量相對較高的3個株系用于耐鹽性分析。

將野生型（WT）、轉基因株系種子用 10％次氯酸鈉溶液消毒處理后，點播于MS培養基上，將培養皿置于人工氣候室中垂直培養。將培養7 d的幼苗分成兩部分，一部分在MS培養基上進行抗逆表型鑒定，具體操作如下：將長勢一致的幼苗10株，分別移至含有 60 μmol·L-1ABA、250 mmol·L-1NaCl和 200 mmol·L-1甘露醇的MS固體培養基上，處理7 d，觀察表型，設3次重復。另一部分移到底部有孔的長方形篩盤中（營養土∶蛭石=1∶1），每個株系一行，每行10株幼苗。正常生長3周，然后用200 mmol·L-1NaCl溶液處理（將篩盤放在鹽溶液中，直至土壤鹽溶液飽和），跟蹤觀察轉基因植株在鹽脅迫下的表型，計算植株存活率，重復3次。

細胞膜穩定性測定：利用電導儀分別測定煮沸前與煮沸后幼苗的相對電導率，評價細胞膜穩定性（cell membrane stability，CMS）。從垂直培養的幼苗中取長勢一致的幼苗10株，移至含有250 mmol·L-1NaCl 的MS固體培養基上，處理7 d。測定幼苗電導率，10株為一次重復，設3次重復。CMS（％）=（1－煮前電導率/煮后電導率）×100％。CMS值越大，表明細胞膜穩定性越高，植物受損傷程度越低。

2 結果

2.1 目標基因克隆

以普通小麥旱選10號cDNA為模板，利用引物對WRKY35-C-F和WRKY35-C-R擴增目標基因。測序表明，該基因開放閱讀框全長1 134 bp，編碼377個氨基酸。NCBI數據庫比對發現該蛋白的N端有一個典型的WRKY結構域，C端有一個C2HC型鋅指結構域。

2.2 TaWRKY35氨基酸序列同源性分析

將TaWRKY35編碼的氨基酸序列提交到NCBI網站上進行蛋白質序列比對，發現其與大麥HvWRKY35 （ABL_11228.1）、短柄草BdWRKY2（XP_014757278.1）、水稻 OsWRKY35（NP_001056863.1）、擬南芥AtWRKY35（XP_008660715.1）具有較高的相似性，序列一致性分別為79％、60％、50％和45％，因此將其命名為 TaWRKY35。盡管在序列一致性方面有差異，但TaWRKY35與上述WRKY成員的序列結構相同，均含有一個WRKY結構域和C端鋅指結構（圖1-A）。小麥TaWRKY35含有一個WRKY結構域和一個C2HC類型的鋅指結構域，屬于WRKY轉錄因子GroupⅢ（圖1-B）。

2.3 TaWRKY35結構及序列多態性分析

以小麥二倍體供體種（烏拉爾圖小麥、擬斯卑爾托山羊草、粗山羊草）、四倍體和六倍體小麥基因組 DNA為模板，利用引物 TaWRKY35-F和TaWRKY35-R擴增目標基因，發現只能在含有A基因組的材料中擴增出 TaWRKY35，說明其可能來自小麥A基因組。測序表明該基因編碼區全長2.55 kb，含有3個外顯子，2個內含子。用上述引物在32份高多態性的六倍體小麥中擴增 TaWRKY35，測序結果未發現DNA多態性，說明TaWRKY35編碼區序列非常保守，預示在小麥生長發育中可能具有極其重要的作用。

2.4 TaWRKY35組織特異性表達

TaWRKY35組織特異性表達模式的分析表明，該基因在小麥發育的不同時期、多種組織器官中均有表達。其中在幼苗根基中表達量最高，約為葉片中表達量的26倍；其次為幼芽根基，約為苗期葉片中表達量的21倍；接下來依次為孕穗期莖節、孕穗期穗、芽期根、孕穗期根、苗期根、胚芽、孕穗期葉片、苗期葉片（圖2）。

2.5 逆境脅迫誘導下TaWRKY35的表達模式

在ABA、NaCl、PEG和低溫脅迫條件下，小麥幼苗TaWRKY35的表達量均顯著上升，表明TaWRKY35參與對4種逆境脅迫的應答。在外源ABA誘導下，TaWRKY35表達模式呈波浪形，在1.5 h達到一個初級峰值，約為對照的8倍，而后逐漸降低，12 h時表達量降至最低，隨后又逐步回升，48 h達到最大值（約為對照的13倍），表明TaWRKY35可能在ABA信號通路中起作用（圖3-A）。TaWRKY35對低溫脅迫比較敏感，低溫處理1 h即達到最大值，隨后急劇下降（圖3-B）。NaCl脅迫下，TaWRKY35的表達在24 h時達到高峰，約為對照的31倍，隨后迅速下降（圖3-C）。在PEG處理6 h時，TaWRKY35表達量達到第一個高峰，約為對照的4倍，隨后下降，在72 h表達量最高，約為對照的5倍（圖3-D），說明TaWRKY35受滲透脅迫誘導表達。

Ta：小麥；Hv：大麥；Bd：短柄草；Os：水稻；At：擬南芥；WRKY：WRKY轉錄因子。* 代表WRKY結構域中核心序列WRKYGQK所在位置；? 代表鋅指結構中半胱氨酸所在位置；◇ 代表鋅指結構中組氨酸所在位置Ta： Triticum aestivum； Hv： Hordeum vulgare； Bd： Brachypodium distachyon； Os： Oryza sativa； At： Arabidopsis thaliana； WRKY： WRKY-type transcription factor. * indicates the WRKYGQK of WRKY domain； ? indicates the cysteine of zinc finger； ◇ indicates the histidine of zinc finger圖1　幾種植物WRKY序列比對（A）與系統進化分析（B）Fig. 1 Alignment （A） and phylogenetic tree （B） of WRKYs from different plant species

GR：芽期根；GRB：幼芽根基；GP：胚芽；SR：苗期根；SRB：幼苗根基；SL：苗期葉片；BR：孕穗期根；BN：孕穗期莖節；BL：孕穗期葉片；BE：孕穗期穗。以苗期葉片中的TaWRKY35表達量為標準。數據為3次獨立試驗的平均值 ± SEGR： Germination stage root； GRB： Germination stage root base； GP： Germ； SR： Seeding stage root； SRB： Seeding stage root base； SL： Seeding stage leaf blade；BR： Booting stage root； BN： Booting stage node； BL： Booting stage leaf； BE： Booting stage ear. The expression level of TaWRKY35 in seedling leaf （SL） is assigned a value of 1. Values are the mean ± SE of three biological replicates圖2　TaWRKY35在小麥不同發育時期的組織特異性表達Fig. 2 Dynamic expression of TaWRKY35 in multi-tissue at different stages of wheat

2.6 TaWRKY35亞細胞定位

生物信息學預測TaWRKY35定位在細胞核上。用激光共聚焦顯微鏡觀察小麥原生質體，發現TaWRKY35：：GFP只在細胞核上有熒光信號，而細胞質和細胞膜中無GFP信號（圖4），表明TaWRKY35特異定位在細胞核上。

圖3　脅迫條件下小麥幼苗TaWRKY35的表達模式Fig. 3 Expression patterns of TaWRKY35 in wheat seedlings under different treatments

圖4　TaWRKY35特異定位在小麥細胞核中Fig. 4 TaWRKY35 specifically locates in the nucleus in wheat

2.7 過表達TaWRKY35能提高擬南芥的耐鹽性

根據轉基因株系中TaWRKY35表達水平，選取表達量相對較高的3個株系L-2、L-4和L-5分析基因功能（圖5）。將在MS固體培養基上生長7 d的轉基因和野生型擬南芥幼苗移至含有250 mmol·L-1NaCl的MS固體培養基上，培養7 d，部分幼苗子葉開始變白（圖6-A）。

以轉基因擬南芥株系L-1的表達量作為內參；數據為3次獨立試驗的平均值 ± SEThe lowest expression of TaWRKY35 in transgenic Arabidopsis line L-1 was regarded as standard. Data represent means ± SE of three replicates圖5　TaWRKY35在5個轉基因擬南芥株系中的表達水平Fig. 5 Expression levels of TaWRKY35 in five transgenic Arabidopsis lines

將種在篩盤中的擬南芥幼苗用200 mmol·L-1NaCl溶液處理7 d，野生型植株葉片明顯黃化，而轉基因株系的葉片僅略微黃化；鹽處理21 d，近55％的野生型植株死亡，而轉基因株系的存活率為70％—75％。為進一步驗證 TaWRKY35過表達能增強擬南芥的耐鹽性，在土壤中進行了耐鹽性鑒定試驗，結果和培養皿上的存活率統計結果基本吻合，如圖6-B所示。考慮到土壤中的鑒定更接近自然條件下鹽脅迫的實際情況，故此處使用了土壤中存活率統計結果。

細胞膜穩定性檢測結果表明，TaWRKY35過表達轉基因株系細胞膜穩定性顯著高于野生型對照（圖6-C）。

A：NaCl處理7 d的擬南芥表型；B：NaCl處理的擬南芥存活率比較；C：NaCl處理的細胞膜穩定性（CMS）比較，數據為3次獨立試驗的平均值 ±SE；* 表示轉基因株系與野生型在0.05概率水平有顯著差異（t-檢驗）。WT：擬南芥野生型；L-2、L-4和L-5：3個TaWRKY35過表達擬南芥株系A： Arabidopsis seedlings treated with NaCl for 7 days； B： Plant survival rates in soil saturated with NaCl solution； C： Comparison of seedling cell membrane stability （CMS） of Arabidopsis seedlings treated with NaCl for 7 days. Values are the mean ± SE of three biological replicates. * indicates significant difference between the transgenic lines and WT at 0.05 probability level （t-test）. Values are the mean ± SE of three biological replicates. WT： Wild type； L-2， L-4 and L-5：Three individual TaWRKY35 transgenic lines圖6　TaWRKY35過量表達能提高擬南芥的耐鹽性Fig. 6 Overexpression of TaWRKY35 confers enhanced tolerance to salt stress in Arabidopsis

3 討論

植物基因的時空表達是其參與不同生命過程的直接反映。在不同逆境脅迫條件下，基因的功能不同，其表達模式也千差萬別，調節基因通常在逆境脅迫的早期表達，而功能基因的表達則相對滯后［25］。本研究發現TaWRKY35受ABA、PEG、NaCl和低溫等多種逆境脅迫誘導表達，同時不同逆境脅迫條件下基因的表達模式差異顯著，說明該基因參與對多種逆境脅迫的應答，暗示TaWRKY35在不同逆境應答途徑中參與的調節機制可能不同。

蛋白質在細胞中的定位一定程度上反映了其行使功能的部位。生物信息學預測結果表明 TaWRKY35可能定位在細胞核中，亞細胞定位結果進一步證明TaWRKY35-GFP融合蛋白僅出現在細胞核中，該結果與已發表的一些 WRKY轉錄因子的亞細胞定位結果一致［26］，同時也與TaWRKY35作為轉錄因子參與調控基因的表達相吻合。

在正常生長條件下，TaWRKY35過表達擬南芥和野生型對照在表型上沒有差異，但在鹽脅迫條件下，轉基因擬南芥子葉白化率顯著低于對照（圖 6-A），同時幼苗存活率顯著高于野生型（圖 6-C）。細胞膜穩定性是衡量植物抗逆性強弱的重要指標，在高鹽條件下植物細胞膜透性通常會增加，但耐鹽植物質膜透性變化較小，因此，細胞膜穩定性較高，而鹽敏感植物則正好相反。本研究發現轉基因植株的細胞膜穩定性顯著高于野生型對照（圖 6-B），進一步證明TaWRKY35提高了擬南芥的耐鹽性。在增強植物的耐鹽性方面，TaWRKY35與之前報道的 BcWRKY46、TaWRKY2、TaWRKY19、TaWRKY44和 HvWRKY38的功能相似［20，22，27-29］。

實時定量PCR結果表明，在ABA、PEG脅迫條件下TaWRKY35表達量顯著升高。在表型分析時，在MS培養基上對轉基因擬南芥和野生型分別進行了ABA（60 μmol·L-1）和甘露醇（200 mmol·L-1）脅迫處理，發現野生型和轉基因株系的表型差異不明顯，這可能與TaWRKY35在信號調節通路中的作用有關，這一現象與GmWRKY21、GmWRKY54轉基因過表達的表型類似［16］。比較TaWRKY35在不同逆境脅迫下的表達水平，發現其在鹽脅迫下表達量最高，該結果與其過表達提高植物的耐鹽性吻合。

近期人們對 WRKY轉錄因子的結構、功能以及在其調控脅迫應答反應、信號分子傳遞、植物衰老以及器官發育等一系列生理活動過程進行了大量的研究，然而對WRKY轉錄因子所介導的植物應答反應及基因調控網絡研究較少，未來應將更多的精力聚焦于解析WRKY在抗逆調控網絡中的作用。

4 結論

從小麥品種旱選10號中克隆到WRKY轉錄因子基因TaWRKY35。TaWRKY35的N端含有典型的WRKY結構域，C端含有 C2HC型鋅指結構，屬于WRKY家族的亞家族Ⅲ，定位于細胞核中。TaWRKY35在小麥幼苗根基部位表達量最高，其次為幼芽根基部，同時TaWRKY35受ABA、低溫、高鹽和PEG-6000誘導上調表達；過表達TaWRKY35能顯著提高轉基因擬南芥的耐鹽性。

References

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（責任編輯 李莉）

Cloning and Characterization of Transcription Factor TaWRKY35 in Wheat （Triticum aestivum）

LIU Zi-cheng1， 2， MIAO Li-li2， WANG Jing-yi2， YANG De-long1， MAO Xin-guo1，2， JING Rui-lian2
（1College of Life Science and Technology， Gansu Agricultural University， Lanzhou 730070；2Institute of Crop Science， Chinese Academy of Agricultural Sciences/National Key Facility for Crop Gene Resources and Genetic Improvement/Key Laboratory of Crop Germplasm and Utilization， Ministry of Agriculture， Beijing 100081）

Abstract：【Objective】Abiotic stresses are major limitations to wheat production worldwide. Transcription factors play crucialroles in abiotic stress signaling in plants. It is predicted that there are at least 200 WRKY genes in common wheat genomes， yet only a few of them have been functionally characterized. The aim of this study is to decipher the roles of WRKY transcription factors in abiotic stress signaling and facilitate the utilization of WRKY genes in the improvement of abiotic stress tolerance in wheat. 【Method】A wheat WRKY gene designated TaWRKY35 was cloned via the wheat full-length cDNA libraries. Quantitative real-time PCR was performed to identify the dynamic expression of target gene in different tissues at various developmental stages， and to characterize the transcriptional patterns responding to ABA， PEG， NaCl and low temperature treatments in wheat. To probe the subcellular location of TaWRKY35， the construct encoding TaWRYK35：：GFP fusion protein was transferred into wheat protoplast by PEG mediated method. To characterize the function of TaWRYK35， target gene driven by the 35S promoter was delivered into Arabidopsis by Agrobacterium mediated method. 【Result】The cDNA of TaWRYK35 contains an 1 134 bp open reading frame，encoding a 377- amino acid protein. TaWRYK35 possesses a typical WRKY domain in the N-terminal and a C2HC type zinc finger domain in the C-terminal， belonging to group III of WRKY family. In 32 hexaploid wheat materials of highly polymorphic，TaWRKY35 coding region sequence is very conservative. The dynamic expression of TaWRKY35 was identified in different tissues at various developmental stages， and the highest expression occurred in the root base of seedling， while the lowest expression was observed in seedling leaf. Furthermore， its transcript was inducible by ABA， PEG， NaCl and low temperature treatments， yet the expression patterns to difference stress varied significantly. Subcellular localization indicated that TaWRKY35 specifically located in the nucleus. Overexpression of TaWRKY35 resulted in enhanced tolerance to high salinity， supported by improved cell membrane stability and survival rate relative to wild type Arabidopsis. 【Conclusion】TaWRKY35 transcription factor contains a WRKY and a C2HC type zinc finger domain， belonging to subgroup III of the WRKY family. The expression of TaWRKY35 occurs in different tissues at various developmental stages， and TaWRKY35 is an abiotic stress responsive gene. Overexpression of TaWRKY35 confers remarkably enhanced tolerance to high salinity.

Key words：wheat； WRKY transcription factor gene； abiotic stress； salt tolerance

收稿日期：2016-03-04；接受日期：2016-04-15

基金項目：國家高技術研究發展計劃（“863”計劃）（2011AA100501）、北京市自然科學基金（BJNSF6132030）