慢性牙周炎患者血清IL-33、TNF-α、IL-6的檢測及意義

林　梅　張冬雪　劉志強　王左敏

(首都醫科大學附屬北京朝陽醫院口腔科, 北京 100020)

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慢性牙周炎患者血清IL-33、TNF-α、IL-6的檢測及意義

林梅張冬雪劉志強王左敏*

(首都醫科大學附屬北京朝陽醫院口腔科, 北京 100020)

【摘要】目的 檢測并分析慢性牙周炎患者血清中白細胞介素(interleukin, IL)-33、腫瘤壞死因子-α(tumor necrosis factor-α, TNF-α)、IL-6的濃度。方法選取慢性牙周炎患者和健康人群共218人，采用酶聯免疫吸附法(enzyme linked immunosorbent assay, ELISA)檢測牙周炎患者的血清中IL-33、TNF-α、IL-6的濃度。結果與健康人群相比，中度及重度牙周炎患者血清中的IL-33顯著降低(P<0.01)，而重度牙周炎患者血清中的TNF-α顯著升高(P<0.01)，中度及重度牙周炎患者血清中的IL-6濃度顯著升高(P=0.042，P<0.001)。結論血清中TNF-α、IL-6濃度與牙周組織炎性反應呈正相關關系，可以作為提示牙周炎活躍期的一個信號分子，而IL-33濃度與牙周組織炎性反應呈負相關關系，在慢性牙周炎病理過程中可能具有保護協調性的作用。

【關鍵詞】白細胞介素-33；腫瘤壞死因子-α；白細胞介素-6；慢性牙周炎

牙周炎是口腔內最常見一種的慢性炎性反應性疾病，其特征表現為牙齒支持組織的非特異性感染破壞。臨床上表現為不同程度的牙齦出血、不同深度的牙周袋、進行性附著喪失和牙槽骨吸收，逐漸牙齒松動而不得不拔除患牙，是造成健康人群失牙的最主要原因之一[1]。牙周組織的破壞主要是由過度宿主免疫炎性反應過程中產生的一系列炎性反應介質和細胞因子所介導。

國內外研究發現白細胞介素(interleukin, IL)-1在牙周炎發病過程的宿主免疫反應中均起到關鍵作用[2-3]， IL-33是IL-1家族中的新發現的一個成員，IL-33的分泌可以促進炎性反應因子如IL-4、IL-5、IL-33表達增加，而IL-33前體在細胞核中的堆積能夠抑制炎性反應因子基因的表達[4-5]。因此可推測IL-33在牙周炎的病理機制中可能起協調作用。腫瘤壞死因子-α(tumor necrosis factor-α, TNF-α)是一種多活性生物蛋白酶，由單核-巨噬細胞、淋巴細胞產生，作用在不同靶器官而產生不同的生物學效應，為機體炎性反應及免疫反應的重要調節因子。牙周炎以厭氧菌為優勢致病菌，內毒素是G-菌細胞壁成分，主要成分脂多糖(lipopolysaccharides, LPS)是機體釋放TNF-α的強啟動劑[6-7]。TNF-α是牙周病發生過程中的一個重要炎性反應因子。IL-6是一種多效應細胞因子，可由多種細胞分泌，細菌、病毒、寄生蟲等可以提高其基因表達，其他炎性細胞因子(IL-1、IL-2、TNF-α等)也可促使其分泌。它能促進多種細胞的增生，如 T 淋巴細胞，抑制成纖維細胞的生長，參與骨吸收。這些功能都與牙周組織的破壞有關[8]。本研究通過酶聯免疫吸附法(enzyme linked immunosorbent assay, ELISA)測定健康人群和慢性牙周炎患者的血清中IL-33、TNF-α、IL-6的濃度，初步分析IL-33、TNF-α、IL-6在慢性牙周炎病理機制中的作用。

1資料與方法

1.1病例選擇及分組

選擇2014年6月至2015年5月在首都醫科大學附屬北京朝陽醫院、首都醫科大學附屬廣安門醫院、中西醫結合醫院、潞河醫院、煤炭醫院、首都醫科大學附屬北京友誼醫院的牙周炎患者和志愿者共218例，其中，男性136人，女性82人，年齡18～85歲，平均年齡62.13歲。

1)排除標準：① 排除糖尿病、腎炎、肝炎、類風濕等系統性疾病患者;② 無明顯錯習合畸形；③婦女未妊娠，未服避孕藥; ④1年內未行牙周治療，3個月內無急、慢性感染性疾病史，未服用抗生素。

2)分組：將所有受試者分為4組：①牙周健康組(n=3)②輕度牙周炎組(n=47)③中度牙周炎組(n=82)④重度牙周炎組(n=58)。檢測分析各組IL-33、TNF-α、IL-6濃度。

1.2研究方法

1)檢查記錄牙周指標和牙周炎分級：根據世界衛生組織(World Health Organization， WHO)制定的口腔健康調查基本方法，使用Williams探針，探針力度≤25 g，測量口腔內所有牙齒牙周袋深度(probing depth, PD)、菌斑指數(plaque index, PLI)、出血指數(blooding index, BI)、附著喪失(attachment loss, AL)、牙槽骨吸收(alveolar bone loss, ABL)、溢膿及臨床動度等。記錄牙總數、失牙數。所有口腔檢查均有2名檢查者完成，2名檢查者進行一致性檢驗，可靠度優。

2)牙周炎分度診斷標準：輕度牙周炎：至少含有一顆牙齒PD≥3 mm且AL≥3 mm，同時PD≥4 mm且AL≥3 mm的牙齒≤30%；中度牙周炎：PD≥5 mm且AL≥4 mm的牙齒<30%；或PD≥4 mm且AL≥3 mm的牙齒30%～60%；重度牙周炎：PD≥5 mm且AL≥4 mm的牙齒≥30%；或PD≥4 mm且AL≥3 mm的牙齒≥60%[6]。

采集靜脈血清，-20 ℃下保存。采用雙抗夾心ELISA法，檢測前將血清及試劑盒平衡至室溫(20～25 ℃)方可實驗。試劑盒購自美國艾森博奧公司，操作按說明書。酶標儀(伯樂公司，美國)，人IL-33、TNF-α、IL-6試劑盒(艾森博奧，美國)。

1.3統計學方法

2結果

4組樣本人群共218例，4組間的性別和年齡構成以及體質量指數(body mass index, BMI)值比較，差異無統計學意義(P>0.05)；牙周臨床各項檢測指標中，4組的PD、BI、PLI、AL、ABL比較,差異均具有統計學意義(P<0.01，表1)。

對IL-33與BMI、收縮壓(systolic blood pressure, SBP)、 舒張壓(diastolic blood pressure, DBP)、牙周各項臨床檢測指標以及蛋白因子IL-6、TNF-α進行了相關性檢驗，IL-33濃度與 BMI、SBP和DBP不具有相關性 (BMI:r=0.007,P=0.978; SBP:r=0.020,P=0.327; DBP:r=0.010,P=0.626)。相反IL-33 濃度與 PD (r=0.110,P=0.034)，IL-6 (r=0.090,P=0.013) 和TNF-α檢測濃度 (r=0.074,P=0.045)具有相關性 (表2)。

健康對照組、輕度牙周炎組、中度牙周炎組、重度牙周炎組的IL-33、TNF-α和IL-6濃度比較，差異有統計學意義(P<0.05)。兩兩比較顯示，IL-33在健康對照組中的檢測濃度為95.97±4.85，中度和重度牙周炎組的檢測濃度(分別為73.65±3.50，72.75 ±3.97)明顯低于健康對照組(P<0.01)。輕度牙周炎組(85.70±3.48)與健康對照組比較，差異無統計學意義(P>0.05)；TNF-α濃度在健康對照組為(37.98±4.98)，與重度牙周炎組(68.28±5.06)比較，差異具有統計學意義(P<0.01)，輕度和中度牙周炎組(分別為38.76±3.25， 53.24±6.48)與健康對照組比較，差異無統計學意義(P>0.05)；IL-6在中度及重度牙周炎組檢測濃度分別為(30.15±1.92, 36.43±2.96)，明顯高于健康對照組(22.05±2.54)(P=0.042，P<0.01)，輕度牙周炎組(28.82±2.93)與健康對照組比較，差異無統計學意義(P>0.05, 圖1)。

表1　各組樣本基線表

BMI： body mass index; PD: probing depth; PLI: plaque index; BI: blooding index; AL: attachment loss; ABL: alveolar bone loss.

表2　控制年齡因素后， IL-33與 BMI, SBP, DBP,IL-33, TNF-α, IL-6和牙周檢測指標的相關性檢驗

IL:interleukin; TNF-α:tumor necrosis factor-α; SBP:systolic blood pressure; DBP:diastolic blood pressure; PD: probing depth; PLI: plaque index; BI: blooding index; AL: attachment loss; ABL: alveolar bone loss.

圖1　各組樣本血清中IL-33，TNF-α,IL-6濃度比較

**P<0.01vshealth control group,*P=0.042vshealth control group; IL:interleukin; TNF-α:tumor necrosis factor-α.

3討論

IL-33是IL-1的超家族成員，結構上與IL-18相似，抗IL-18對于牙周炎的治療已經進入臨床試驗階段。IL-1β能刺激IL-33前體(pro-IL33)的合成，活化的caspase-1能裂解pro-IL33產生成熟IL-33。最初IL-33在支氣管和小氣道的上皮細胞中被檢測到，隨后Carriere等[9]在多種炎性反應組織中檢測到IL-33的表達，提示IL-33在多種炎性反應中發揮作用。

目前IL-33對于炎性反應的影響作用還沒有統一的認識：IL-33可能與IL-1家族的其余成員不同，作為一個免疫調節細胞因子而非促炎細胞因子對Th2細胞的免疫應答進行調控。細胞學研究[10]表明外源性的IL-33可以增加IL-5、IL-13以及血漿免疫球蛋白濃度表達，而外源性的IL-33處理的小鼠多種黏膜上皮組織產生病理學改變，并且血漿中的IgA、IgE水平增加，這提示IL-33可能作為一把“雙刃劍”，作為調控因子影響炎性反應的疾病過程。因此，Carriere等[9]認為IL-33應歸為“雙重功能(dual function)”一類因子，對于炎性反應具有雙相影響。IL-33可能通過不同的信號通路產生對炎性反應的雙相影響。

TNF-α由單核細胞、巨噬細胞、T淋巴細胞分泌，通過誘導成骨細胞/基質細胞、牙周初代細胞、T細胞和牙周膜細胞等表達核因子κ B受體活化因子配體(receptor activator for nuclear factor-κ B ligand, RANKL)，通過和RANKL相互作用，能增強人破骨細胞活性。進而促進牙槽骨吸收；增加基質金屬蛋白酶的產生，導致膠原纖維的破壞、刺激基質細胞的凋亡，限制牙周組織的修復等[11]。TNF-α既可以誘導表達趨化介質，促進形成破骨細胞，又可以誘導成骨細胞表達RANKL和巨噬細胞集落刺激因子(macrophage colony-stimulating factor, M-CSF)，從而間接促進破骨細胞分化，還可以直接促進RANKL誘導形成破骨細胞和增高骨吸收活性[12]，因此TNF-α的濃度與牙周炎的病程密切相關，在牙周病發展過程中，加重炎性反應，促進牙槽骨破壞。Branetti等[13]臨床試驗證實，牙周炎患者外周血單核細胞培養上清液中TNF-α的濃度僅略高于正常對照，但經脂多糖刺激后, TNF-α的含量明顯升高。在實驗性牙周炎中，使用TNF-α的拮抗刻可使骨喪失減少50%[14]。

IL-6能作用于多種細胞，是一種多功能炎性因子，與機體的免疫功能、造血功能和防御反應密切相關。IL-6的誘導因子包括牙周致病菌LPS、 IL-16、TNF-α等。IL-6可以誘導成骨細胞產生破骨細胞分化因子及基質金屬蛋白酶，從而誘導破骨細胞前體轉化為成熟的破骨細胞，同時促進骨基質的降解。IL-6還能抑制成纖維細胞、膠原細胞和基質細胞等牙周膜細胞的生長，并降低成纖維細胞的附著力，從而影響牙周膜的修復和代謝功能，破壞牙周組織[8]。IL-6可促進成骨細胞分化產生RANKL，通過OPG/RANKL/RANK信號通路調節破骨細胞前體的集中、增生、分化及破骨細胞的形成和活化，促進骨吸收；而活化的破骨細胞能分泌IL-6、更加促進的破骨細胞生成。Preshaw等[15]認為IL-6的表達與牙周炎的嚴重程度正相關，并以其表達水平作為牙周組織破壞程度的指標。

齦溝液是結締組織內的液體不斷通過齦溝內壁上皮和結合上皮進入齦溝內所形成的，它來源于齦下菌斑、各種代謝產物及血清[16-18]。對齦溝液中細胞因子的檢測有助于牙周炎診斷確定或預測牙周炎性反應活動性破壞情況。牙周炎活動期齦溝液中的炎性反應相關因子水平升高到一定程度，它們能穿過破潰的內皮進入循環系統導致循環中相關因子濃度升高，另外牙周炎也可刺激機體產生全身免疫反應，導致血清中相關炎性反應因子濃度發生變化。Zheng 等[16]研究表明，牙周炎患者跟溝液與血清中的炎性反應因子呈正相關。IL-33、TNF-α、IL-6有可能是牙周炎或全身性系統疾病病理過程中的重要介質，同時可能在牙周炎與系統性疾病的關系中發揮著重要作用。因此，在本研究中檢測血清中相關炎性反應因子，為以后的牙周炎與全身系統疾病的研究提供科研數據。

本研究收集了牙周炎及健康對照人群，并將其分為4組，ELISA檢測各組患者血清中的IL-33、IL-6、TNF-α濃度。研究發現在非炎性反應與炎性反應組比較：炎性反應組IL-33水平降低，兩組之間差異有統計學意義(P<0.05)。這一結果提示IL-33可能是炎性反應性疾病的保護因子，并且隨著炎性反應的加重，這種作用更為顯著，因此IL-33在牙周炎的病理發展機制中可能起到一定的協調作用。在本實驗中血清中TNF-α、IL-6濃度與牙周組織炎性反應破壞程度呈正相關關系，在慢性牙周炎的病變過程中，作為始動因子的菌斑微生物作用于單核巨噬細胞時，細胞可分泌包括IL-6、TNF-α在內的多種炎性反應細胞因子，提示可以把TNF-α、IL-6總量作為反映牙周炎性反應活躍期的一個信號指標。

綜上所述，IL-33、TNF-α、IL-6等細胞因子在慢性牙周炎的發病機制中發揮著重要的作用并參與其發病過程。因此深入研究IL-33、TNF-α、IL-6 等細胞因子在慢性牙周炎病理發展中所起到的作用將為牙周炎臨床診治提供幫助。

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編輯慕萌

Levels of IL-33, TNF-α, and IL-6 in peripheral blood of the patients with chronic periodontitis

Lin Mei, Zhang Dongxue, Liu Zhiqiang, Wang Zuomin*

(DepartmentofStomatology,BeijingChaoyangHospital,CapitalMedicalUniversity,Beijing100020,China)

【Abstract】ObjectiveTo investigate the levels of interleukin (IL)-33， tumor necrosis factor-α(TNF-α)， IL-6 expression in peripheral blood of the patients with chronic periodontitis(CP). MethodsThirty-one healthy controls，187 cases with CP who were divided into 4 groups: healthy controls, mild periodontitis, moderate periodontitis, severe periodontitis were enrolled．IL-33，TNF-α，IL-6 were examined by enzyme linked immunosorbent assay (ELISA)．Periodontal indexes were measured．ResultsIn the CP group of moderate and severe periodontitis, IL-33 were significantly lower than that of healthy controls (P<0.01).TNF-α in severe periodontitis was higher than those in the control group (P<0.01) (between moderate periodontitis and healthy controls，P>0.05), and IL-6 in the group of moderate and severe periodontitis were significantly higher than healthy control(P=0.042, P<0.01). ConclusionThe levels of TNF-α and IL-6 in serum positively correlated with periodontal tissue inflammation, and therefore they may be used as signal molecules suggestive of active stage periodontitis; IL-33 level negatively correlated with inflammation of periodontal tissue, which may have protective coordinating effects in the pathological processes of chronic periodontitis.

【Key words】interleukin-33; tumor necrosis factor-α; interleukin-6; chronic periodontitis

基金項目：國家自然科學基金面上項目 (81271158)，北京市科學技術委員會首都市民健康項目培育項目(Z131100006813027)。This study was supported by National Natural Science Foundation of China(81271158)， Fund of the Capital Public Health Project from Beijing Municipal Commisson of Science and Technology(Z131100006813027).

*Corresponding author， E-mail：wzuomin@sina.com

[doi：10.3969/j.issn.1006-7795.2016.03.001]

【中圖分類號】R 781.4

(收稿日期：2016-03-29)

網絡出版時間：2016-06-0718∶38網絡出版地址：http://www.cnki.net/kcms/detail/11.3662.r.20160607.1838.006.html

· 口腔醫學專題 ·