不同注射劑量的雷帕霉素對小型豬全身情況的影響

朱　釗　龐寶興　吳曉珊　胡　磊　胡　亮　王勁松　張春梅　王松靈

(首都醫科大學口腔醫學院全牙再生與口腔組織功能重建北京市重點實驗室，北京 100050)

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不同注射劑量的雷帕霉素對小型豬全身情況的影響

朱釗龐寶興吳曉珊胡磊胡亮王勁松張春梅王松靈*

(首都醫科大學口腔醫學院全牙再生與口腔組織功能重建北京市重點實驗室，北京 100050)

【摘要】目的 研究不同注射劑量的雷帕霉素對小型豬全身情況的影響。方法選擇12頭小型豬分為4組，連續7 d分別注射不同濃度的雷帕霉素(0、0.05、0.10、0.15 mg/kg),觀察12周，期間每2周進行血常規和血生化檢測。12周后，對小型豬主要臟器進行組織學觀察。結果注射不同劑量的雷帕霉素2周后，各組小型豬的白細胞、血小板及淋巴細胞比率會出現劑量依賴性的下降，4周后恢復正常水平，血生化各項指標未見明顯異常，12周后，小型豬的主要臟器的組織結構未見明顯異常。結論連續7 d注射雷帕霉素不會對小型豬全身情況產生長期影響。

【關鍵詞】雷帕霉素；劑量依賴性；小型豬

雷帕霉素是一種新型大環內酯類免疫抑制劑，自2000年以來，廣泛應用于器官移植術后抗免疫排斥反應，其在胞外與蛋白FKBP-12形成穩定復合物，直接作用于胞內一種哺乳類動物靶蛋白(mammalian target of rapamycin, mTOR)，通過抑制翻譯的啟動[1]，阻斷T淋巴細胞周期[2]等作用，發揮免疫抑制效應[3]。臨床實驗[4]結果表明，雷帕霉素是一種療效好、無細胞毒性及腎毒性的高效免疫抑制劑。近十年來，通過對其作用機制的研究，發現雷帕霉素通過促進細胞自噬作用具有抗衰老[5]及治療神經退行性疾病[6]的潛在功能，同時因抑制磷酯酰肌醇3激酶/蛋白激酶/mTOR(PI3K/Akt/mTOR)異常信號途徑的激活[7]，而起到抗腫瘤的作用[8]，還通過保護口腔黏膜表皮干細胞及唾液腺祖細胞，緩解放射性口腔黏膜炎[9]及唾液腺放射損傷[10]等癥狀。然而目前雷帕霉素多數探索實驗僅僅局限于細胞實驗和嚙齒類動物。大型動物實驗是開發雷帕霉素新用途的必經階段，故本研究通過評估不同注射劑量的雷帕霉素對小型豬全身情況的影響，為今后在小型豬疾病模型中的應用奠定堅實的理論基礎。

1研究對象與方法

1.1研究對象

健康8～12月齡的小型豬12只(由北京實創世紀小型豬養殖基地提供)，實驗動物許可證號：SYXK(京) 2013-0029，雄性，體質量35～40 kg，單籠飼養，自由獲得水和食物。采用抽簽法將小型豬隨機分為4組，分別連續7 d腹腔注射劑量為0、0.05、0.10、0.15 mg/kg的雷帕霉素,觀察12周。此研究得到首都醫科大學動物實驗及實驗動物福利委員會允許(編號：AEEI-2015-089)。

1.2雷帕霉素血藥濃度測定

在連續7 d的注射過程中，每天在注射前收集全血樣本，測定雷帕霉素在24 h內最低的血藥濃度值。小型豬采用復方氯胺酮(氯胺酮加麻保靜)按0.1 mL/kg劑量耳后肌注麻醉，麻醉滿意后，取仰臥位，前腔靜脈取全血4 mL，用Architect Sirolimus Reagent Kit (Abbott Laboratories) 檢測雷帕霉素血藥濃度。

1.3血常規及血清生化檢測

注射雷帕霉素前后每2周，前腔靜脈取全血5 mL，其中2 mL分裝于抗凝采血管，2 h內血常規檢測；3 mL置于離心管中，3 000 r/min離心10 min，收集血清，-80 ℃凍存，用于血清生化檢測。目前測定方法及儀器與臨床檢驗采用的方法相同。

1.4組織學檢測

雷帕霉素注射12周后，取各組小型豬主要臟器，4%(質量分數)多聚甲醛固定，脫水浸蠟，石蠟包埋，切片，蘇木精-伊紅染色，顯微鏡下進行組織學觀察。

1.5統計學方法

2結果

2.1雷帕霉素的血藥濃度

在連續7 d給藥過程中，注射劑量為0.1 mg/kg時，小型豬體內血藥濃度的最低值穩定維持在20 ng/mL左右，7 d平均血藥濃度為(24.03±0.733)ng/mL(圖1)。

圖1　不同注射劑量的雷帕霉素在小型豬體內最低血藥濃度值

2.2雷帕霉素對小型豬血常規血生化的影響

本研究初步評估了連續注射雷帕霉素對小型豬血常規的影響，將注射后3個時間點(2、4、 12 week)分別與注射前數值進行比較，差異有統計學意義(P<0.05)。結果表明注射后2周各組小型豬的白細胞、血小板及淋巴細胞比率呈劑量依賴性的下降趨勢，注射后4周逐漸恢復至注射前水平，詳見表1。血常規余各項指標(紅細胞、血紅蛋白、血細胞比容、單核細胞、粒細胞比率等)及血生化指標(Na+、K+、Cl-、總蛋白、丙氨酸氨基轉移酶、門冬氨酸氨基轉移酶、尿素氮、肌酐等)未見明顯異常。

2.3主要臟器的組織學分析

注射后12周，對各組小型豬主要臟器(心、肝、脾、肺、腎)的組織結構及細胞形態進行組織學分析，結果表明，本研究選取的3個雷帕霉素注射劑量(0.05、0.10、0.15 mg/kg)對小型豬全身情況無明顯影響，圖2示本研究最高注射濃度組(0.15 mg/kg)小型豬主要臟器的HE染色。

3討論

小型豬動物模型因其在解剖結構、生理學、疾病的發生發展等方面與人類極為相似，已被廣泛應用于心血管疾病、代謝性疾病、皮膚燒傷模型、異種器官組織移植和口腔疾病模型等方面[11]。目前對雷帕霉素研究的方向主要集中在器官移植、心血管疾病、抗腫瘤[12]等方向，小型豬因此成為研究雷帕霉素新用途的橋梁動物模型，本實驗得出當腹腔注射劑量為0.1 mg/kg時，可以使小型豬體內血藥濃度在24 h內穩定維持在20 ng/mL，此濃度為器官移植術后安全、有效的血藥濃度，還應用在抑制實體瘤的Ⅰ期臨床實驗[13]。

表1　注射雷帕霉素前后小型豬部分血常規指標的變化

n=3 per group.*P<0.05，**P<0.01 vs pre-intraperitoneal; WBC： white blood cell; PLT： platelets; LYM：lymphocyte ratio.

圖2　雷帕霉素對小型豬重要臟器的影響

After receiving 7 continuous days injection dose of 0.15 mg/kg of rapamycin for 12 weeks, there was no significant difference in the main viscera of minipigs(HE staining, bar：100μm).

最新研究[9-10]表明20 ng/mL的雷帕霉素可以增強口腔黏膜表皮干細胞及唾液腺前體細胞的自我更新能力和增生能力，較好地預防放射性口腔黏膜炎及治療唾液腺放射損傷等。

mTOR是一種絲氨酸/蘇氨酸激酶，參與調控細胞生長和增生，蛋白質翻譯的啟動，細胞衰老與凋亡等多種重要生理機能。雷帕霉素因靶向抑制mTOR，難以避免對生長發育造成一定程度的影響，有報道[14]顯示部分兒童腎移植術后使用雷帕霉素會造成生長發育遲緩。目前，雷帕霉素在臨床上主要應用于器官移植術后的抗免疫排斥反應，不良反應包括頭暈、惡心、關節疼痛等不適以及血常規血生化部分指標的異常[15-16]。本研究表明，雷帕霉素血藥濃度與血常規部分指標的異常成正比，停藥后2～3周，各項指標均恢復正常，具有可逆性。如何維持有效、穩定、安全的血藥濃度是發揮雷帕霉素最大功效的關鍵[17]，同時雷帕霉素及其衍生物與其他臨床藥物的協同用藥已成為研究的熱點。

綜上所述，注射不同劑量的雷帕霉素對小型豬全身情況無明顯影響，雷帕霉素在小型豬動物模型的研究與應用具有廣闊的前景[18]。

4參考文獻

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編輯陳瑞芳

Effect of different injection doses of rapamycin on general function changes in miniature pig

Zhu Zhao, Pang Baoxing, Wu Xiaoshan, Hu Lei, Hu Liang, Wang Jinsong, Zhang Chunmei, Wang Songling*

(MolecularLaboratoryforGeneTherapyandToothRegeneration,BeijingKeyLaboratoryofToothRegenerationandFunctionReconstruction,SchoolofStomatology，CapitalMedicalUniversity,Beijing100050,China)

【Abstract】ObjectiveTo evaluate the effect of different injection doses of rapamycin on general function changes in miniature pig (minipig). MethodsTwelve minipigs were divided into 3 groups (n=3 per group), which were injected with 0, 0.05, 0.10, 0.15 mg·kg-1·day-1for 7 continuous days separately. Blood samples were obtained every 2 weeks. The assessment of main viscera of minipigs 12 weeks after injection was performed by hematoxylin and eosin (H&E) staining. ResultsThe numbers of white blood cells, platelets and lymphocyte ratios were dose-dependently decreased at week 2 after injection, and returned to normal range at week 4. However, there was no significant difference in the main viscera of minipigs. ConclusionSeven continuous days injection with rapamycin had no impact on general condition of minipigs.

【Key words】rapamycin; dose-dependent; miniature pig

基金項目：國家重點基礎研究規劃項目(973 Program)(2010CB944801)， 北京學者項目(PXM2014，PXM2013，TJSHG201310025005 )。This study was supported by Major State Basic Research Development Program of China (2010CB944801)， Beijing Municipality Government Grants (Beijing Scholar Program (PXM2014, PXM 2013 and TJSHG201310025005).

*Corresponding author， E-mail：slwang@ccmu.edu.cn

[doi：10.3969/j.issn.1006-7795.2016.03.002]

【中圖分類號】R 979.5

(收稿日期：2016-03-29)

網絡出版時間：2016-06-0718∶38網絡出版地址：http://www.cnki.net/kcms/detail/11.3662.r.20160607.1838.002.html

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