外源性核苷酸對小鼠非酒精性肝損傷保護作用初探

高麗芳　羅　葵　崔淑香

(首都醫科大學食品藥品安全評價中心，北京 100069)

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外源性核苷酸對小鼠非酒精性肝損傷保護作用初探

高麗芳羅葵崔淑香*

(首都醫科大學食品藥品安全評價中心，北京 100069)

【摘要】目的 初步探討外源性5′-核苷酸對小鼠非酒精性肝損傷的保護作用。方法將75只雌性ICR小鼠根據體質量分為5組：模型對照組、低劑量核苷酸組、中劑量核苷酸組、高劑量核苷酸組和空白對照組。經口給予外源性5′-核苷酸(40、160、640 mg/kg)，實驗持續30 d。于實驗第30天將各組動物隔夜禁食16 h，模型對照組及各劑量組動物經口一次性給予1% 四氯化碳致急性肝損傷模型，空白對照組給玉米油，受試組繼續給予受試樣品，次日處死動物，測定血清轉氨酶并取肝臟做病理。結果受試物組小鼠血清轉氨酶活性低于模型對照組，同時肝細胞壞死程度減輕，各種類型病理變化的總評分低于模型組。結論外源性5′-核苷酸對小鼠非酒精性肝損傷具有潛在保護作用。

【關鍵詞】5′-核苷酸；肝保護作用；小鼠

近年來，隨著生活水平的提高，生活方式和飲食習慣的改變，非酒精性肝病(nonalcoholic fatty liver disease, NAFLD)的發病率呈逐年上升的趨勢，它是一種與胰島素抵抗和遺傳易感密切相關的代謝應激性肝臟損傷，是21世紀全球重要的公共健康問題之一[1]。它的病理機制至今未完全闡明，且無有效的治療方案[1-2]。

核苷酸(necleotides)作為核酸的基本構成單位，以游離核苷酸或核酸的形式廣泛存在于動植物來源的所有食物中。雖然沒有證據表明膳食核苷酸缺乏會導致特定疾病發生，但是核苷酸在細胞結構、代謝、能量和調節功能等方面起著重要作用，能促進腸道功能的健全和脂肪代謝，對肝損傷具有一定的保護作用[3-5]。膳食中缺乏核苷酸會影響肝臟和小腸的蛋白合成，同時會影響肝臟和小腸特定基因的表達[6]。急性四氯化碳(carbon tetrachloride, CCl4)肝損傷動物模型是一種經典的實驗性肝損傷模型，常用于篩選改善肝細胞損傷的藥物并對其活性進行評價[7]。本實驗通過評價外源性5′-核苷酸對急性CCl4肝損傷小鼠血清轉氨酶及病理變化的影響，初步探討5′-核苷酸的保肝作用，為其應用提供理論基礎。

1材料與方法

1.1樣品

5′-核苷酸得贈于北京大學營養與食品衛生學系李勇教授課題組。該受試物由大連珍奧集團生產，白色粉末狀，從啤酒酵母RNA中提取，純度高于99%。人擬用推薦量為每人1.2 g/d，人均體質量按60 kg計算。

1.2實驗動物及環境

SPF級ICR雌性小鼠75只，體質量約16～18 g，由北京維通利華實驗動物技術有限公司提供，動物合格證號：SCXK(京)2012-0001。動物飼養環境：SPF級動物室[合格證號：SYXK(京)2010-0020]，室溫為22 ℃±2 ℃，相對濕度為50%±20%，合籠飼養，5只/籠。飼料來源：北京科澳協力飼料有限公司提供，合格證號：SCXK(京)2014-0010。動物試驗經過首都醫科大學倫理審查委員會認可。

1.3主要儀器與試劑

7180全自動生化分析儀購自日本日立公司，測試所用試劑為瑞士羅氏公司提供，系列病理脫水機、包埋機、切片機購自日本Leica公司，80i熒光顯微鏡購自日本Nikon公司。

1.4實驗方法[8]

1)實驗分組：雌性小鼠75只，根據體質量分5組，分別為模型對照組，5′-核苷酸低、中、高3個劑量組及空白對照組。每組15只。分組方法如下：①稱量已經標記好的小鼠，將體質量記錄到動物分組記錄表上；②當所有小鼠體質量稱量記錄完成后，動物分組記錄表上動物編號呈現出體質量由小到大的規律；③根據實驗方案所設定的實驗組(5組)，按體質量從小到大的順序將動物編號填寫到1至5組，完成每組第一只動物分配；然后連續上一輪分配方法接著往下填寫，填寫順序為5至1組，完成每組第二只動物分配；④以此類推，按著“之”字形，將所有稱量編號的動物平均分配到各實驗組。

2) 劑量設定與受試物給予方式：根據李勇教授課題組前期研究結果[9-10]，設定3個受試物組，分別為低劑量組40 mg/kg，中劑量組160 mg/kg，高劑量組640 mg/kg。

3)實驗方法：實驗動物適應環境3 d，選健康成年雌性ICR小鼠75只。受試組每日經口給予受試樣品，模型對照組及空白對照組給予蒸餾水，灌胃劑量為1 mL/100g。實驗期間動物每周稱體質量2次，以調整灌胃量。實驗期間各組小鼠飼以SPF級飼料，自由進食及飲水。實驗持續30 d，于實驗第30天將各組動物隔夜禁食16 h，模型組及各劑量組小鼠經口一次性給予1%(體積分數) CCl4(用玉米油配制，灌胃劑量為5 mL/kg)，空白對照組給玉米油，4 h后受試組給予受試樣品，24 h處死動物，摘眼球取血，分離血清，測定血清丙氨酸氨基轉移酶(alanine aminotransferase， ALT)和血清門冬氨酸氨基轉移酶(aspartate aminotransferase， AST)，并取肝臟進行病理組織學檢測。血清生物化學檢測剔除溶血樣本。動物肝臟左葉用10%(體積分數)甲醛固定，從肝左葉中部做橫切面取材，常規病理制片(石蠟包埋，HE染色)。鏡檢時從肝臟的一端視野開始記錄細胞的病理變化，用20倍物鏡連續觀察整個組織切片。根據評分標準，分別記錄每個視野中的各種病變所占視野面積，并累計所觀察視野的病變總分。

1.5統計學方法

2結果

2.1對小鼠體質量的影響

小鼠分組后，經統計學檢驗F=0.071，P=0.991， 體質量差異無統計學意義。實驗期間，各組小鼠生長發育正常。由圖1可見各劑量組小鼠體質量(0 d、7d、14 d、21 d、28 d)與模型對照組、空白對照組比較差異無統計學意義(P>0.05)。

圖1　外源性核苷酸對小鼠體質量的影響

2.2對血清肝功生物化學指標的影響

由圖2可見模型組小鼠血清ALT、AST異常升高，且與陰性對照組比較差異有統計學意義(單因素方差分析顯示ALT組間差異，F=31.987，P<0.01；AST組間差異，F=14.847，P<0.01)，提示四氯化碳誘導的急性肝損傷模型成功。各劑量組小鼠血清轉氨酶活性均低于模型對照組；其中低劑量組(40 mg/kg)實驗小鼠血清ALT活性與模型對照組比較差異有統計學意義(P<0.05)，高劑量組(640 mg/kg)小鼠血清AST活性與模型對照組比較差異有統計學意義(P<0.05)。

2.3對肝臟病理組織學變化的影響

由表1及圖3可見，模型組小鼠與空白對照組比較，肝細胞壞死程度重，差異有統計學意義，提示四氯化碳誘導小鼠急性肝損傷模型建立成功。高劑量及低劑量組小鼠與模型組比較，肝細胞壞死程度減輕，各種類型病理變化的總評分低于模型組，且差異有統

計學意義(P<0.05)。

3討論

CCl4在肝細胞內質網中經細胞色素P450依賴性混合功能氧化酶的代謝，生成活潑的三氯甲基自由基和氯自由基。這些自由基與細胞內和細胞膜的大分子發生共價結合，使酶的功能喪失，細胞膜脂質過氧化，胞質Ca2+濃度升高，導致肝細胞損傷壞死，胞質內轉氨酶滲入血液。在形態上主要表現為肝小葉中央區壞死和脂肪變性，血清學檢查可見轉氨酶ALT和AST升高，并能靈敏地反映肝損傷的程度[7，11-12]。因此，本實驗采用小鼠急性CCl4肝損傷模型，通過檢測實驗小鼠血清學轉氨酶及肝臟病理改變，預測外源性

圖2　外源性核苷酸對小鼠血清ALT和AST的影響

A:effect of 5′-nucleotide on serum ALT; B:effect of 5′-nucleotide on seron AST;*P<0.05vsnormal control group；#P<0.05vsCCl4treatment only group;n=15;CCl4:carbon tetrachloride; ALT:alanine aminotransferase; AST:aspartate aminotransferase.

表1　外源性核苷酸對小鼠肝臟病理組織學變化的影響

圖3　小鼠肝臟病理組織改變

A:normal control; B:CCl4treatment only;C: CCl4treatment and oral administration of 5′-nucleotide at 40 mg/kg; D: CCl4treatment and oral administration of 5′-nucleotide at 160 mg/kg; E: CCl4treatment and oral administration of 5′-nucleotide at 640 mg/kg;CCl4:carbon tetrachloride.

核苷酸對小鼠非酒精性肝損傷的保護作用。實驗結果表明小鼠急性CCl4染毒前，采取外源性5′-核苷酸干預，能改善肝臟病理組織損傷，降低急性CCl4染毒組實驗動物血清ALT、AST指標的升高，提示外源性核苷酸對肝細胞具有保護作用。根據《保健食品檢驗與評價技術規范(2003版)》[8]中對化學性肝損傷有輔助保護作用檢驗方法的結果判定標準，可認為外源性5′-核苷酸對CCl4誘導的小鼠急性肝損傷有輔助保護作用。可能機制為外源性核苷酸影響了肝細胞的增生與分化，調節免疫系統、小腸和肝臟的生理功能[4]。外源性核苷酸對非酒精性肝損傷的保護作用機制有待進一步研究，為5′-核苷酸的深度開發提供依據。

4參考文獻

[1]中華醫學會肝病學分會脂肪肝和酒精性肝病學組. 中國非酒精性脂肪性肝病診療指南(2010年修訂版)[J]. 中國醫學前沿雜志： 電子版,2012,4(7):4-10.

[2]Ferolla S M, Silva L C, Ferrari Mde L, et al. Dietary approach in the treatment of nonalcoholic fatty liver disease[J]. World J Hepatol,2015, 7(24): 2522-2534.

[3]Pérez M J, Sánchez-Medina F, Torres M, et al. Dietary nucleotides enhance the liver redox state and protein synthesis in cirrhotic rats[J].J Nutr, 2004,134(10): 2504-2508.

[4]Pérez M J, Suárez A, Gómez-Capilla J A, et al. Dietary nucleotide supplementation reduces thioacetamide-induced liver fibrosis in rats[J]. J Nutr, 2002, 132(4): 652-657.

[5]Singhal A, Macfarlane G, Macfarlane S, et al. Dietary nucleotides and fecal microbiota in formula-fed infants: a randomized controlled trial[J]. Am J Clin Nutr, 2008, 87(6): 1785-1792.

[6]Sanchez-Pozo A, Gil A. Nucleotides as semiessential nutritional components[J]. Br J Nutr, 2002, 87 Suppl 1: S135-S137.

[7]徐叔云, 卞如濂, 陳修.藥理實驗方法學[M]. 北京：人民衛生出版社, 2002:1346.

[8]衛生部衛生監督司.保健食品的功能學評價程序和檢驗方法[M]. 北京：人民衛生出版社，2003.

[9]梁銳，張召峰，劉志剛，等. 5′-核苷酸抗疲勞作用研究[J]. 現代預防醫學, 2010,37(10): 1853-1855.

[10]Xu M, Zhao M, Yang R, et al. Effect of dietary nucleotides on immune function in Balb/C mice[J].Int Immunopharmacol, 2013, 17(1): 50-56.

[11]孫淑豐, 韓剛. MicroRNA-122與利福平所致小鼠肝損傷的關系[J]. 中國煤炭工業醫學雜志. 2014,17(12):2000-2003.

[12]劉曉娜, 劉密鳳,賈栗,等. 藥源性肝損傷潛在血清生物標志物的研究進展[J]. 首都醫科大學學報， 2014,35(4):511-515.

編輯孫超淵

Hepatoprotective effects of dietary 5′-nucleotide on nonalcoholic liver injury in mice

Gao Lifang, Luo Kui, Cui Shuxiang*

(CenterforFoodandDrugSafetyEvaluation，CapitalMedicalUniversity,Beijing100069,China)

【Abstract】ObjectiveTo investigate the hepatoprotection effects of dietary 5’-nucleotide in mice. MethodsThe 5’-nucleotide was administered by oral administration (40, 160, 640 mg/kg) for 30 days prior to acute carbon tetrachloride (CCl4) hepatic damage in mice. ResultsPretreatment with 5’-nucleotide effectively attenuated serum alanine aminotransferase (ALT) and improved pathological changes of the liver tissues in mice. ConclusionThe 5’-nucleotide has potential hepatoprotective effects.

【Key words】5’-nucleotide; hepatoprotective effects; mice

基金項目：首都醫科大學校長基金(2015JS20-1150170420)。This study was supported by the Principal Fund of Capital Medical University (2015JS20-1150170420).

*Corresponding author， E-mail： lifanggao@ccmu.edu.cn

[doi：10.3969/j.issn.1006-7795.2016.03.021]

【中圖分類號】R 15

(收稿日期：2016-01-15)

網絡出版時間：2016-06-0719∶07網絡出版地址：http://www.cnki.net/kcms/detail/11.3662.r.20160607.1907.058.html

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