錳對外生菌根真菌生長、養(yǎng)分吸收、有機酸分泌和菌絲體中錳分布的影響

彭麗媛，熊興政，李　艷，黃建國,*

1 西南大學資源環(huán)境學院, 重慶　400716 2 四川涼山州西昌農(nóng)業(yè)科學研究所, 西昌　615000

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錳對外生菌根真菌生長、養(yǎng)分吸收、有機酸分泌和菌絲體中錳分布的影響

彭麗媛1，熊興政1，李艷2，黃建國1,*

1 西南大學資源環(huán)境學院, 重慶400716 2 四川涼山州西昌農(nóng)業(yè)科學研究所, 西昌615000

摘要:外生菌根真菌對于酸性和錳污染土壤的植樹造林和生態(tài)恢復有重要作用。采用液體培養(yǎng)方法，以大白菇Rd Fr(Russula delica Fr.)、彩色豆馬勃Pt 715(Pisolithus tinctorius 715)、土生空團菌Cg Fr(Cenococcum geophilum Fr.)和厚環(huán)粘蓋牛肝菌Sg KlS(Suillus grevillei(Kl.)Sing)為供試對象，研究了Mn2+對外生菌根真菌生長、養(yǎng)分吸收、有機酸和氫離子分泌的影響，以及錳在菌絲細胞內(nèi)外的分布情況。結果表明：在0—800 mg Mn2+/L的培養(yǎng)液中，Mn2+對Rd Fr生長無顯著影響；低濃度的Mn2+刺激Sg KlS生長，中、高濃度無抑制作用；但大幅度降低Pt 715和Cg Fr的生物量，說明Rd Fr和Sg KlS抗(耐)錳的能力較強。在Mn2+脅迫下，供試菌株的氮、鉀含量和吸收量顯著降低；含磷量和吸收量，以及草酸和檸檬酸的分泌速率因菌株不同而表現(xiàn)出多樣性，說明在減輕Mn2+毒的過程中，磷酸鹽(或聚磷酸鹽)對Mn2+固定作用和有機酸的絡合作用因菌株不同而異。但是，Mn2+顯著降低Rd Fr和Sg KlS的氫離子分泌速率，菌絲和原生質中的含Mn量顯著低于敏感性菌株，說明降低Mn2+的活性和減少吸收可能是外生菌根真菌抗(耐)Mn2+的重要機制。此外，菌絲吸收的Mn2+絕大部份存在于質外體，少量進入細胞，前者是后者的5.23—9.21倍，說明原生質膜是外生菌根真菌防御Mn2+進入細胞的重要屏障。

關鍵詞：錳脅迫；外生菌根真菌；有機酸；養(yǎng)分

由于礦山開采、金屬冶煉、煤炭燃燒、工業(yè)生產(chǎn)以及廢棄物填埋等，大量的錳(Mn)進入土壤和水體。目前，全世界每年平均排放1500萬t Mn，造成嚴重的局部污染[1]。此外，地殼平均含Mn量約為1%[2]，幾乎分布于所有的巖石和土壤礦物中。若土壤pH<5.5，巖石和原生礦物中的Mn就會以Mn2+的形式進入土壤溶液，危害植物生長發(fā)育。值得注意的是，酸性土壤占全球耕地面積的40%以上[3]，錳是僅次于鋁的危害因素[4]。我國南方也存在大面積的酸性森林土壤，pH值通常在4.0—5.5之間，土壤活性Mn2+含量較高，并因酸沉降呈逐漸增加的趨勢[5]。Mn2+對森林造成多方面的危害，如抑制樹根吸收養(yǎng)分，降低樹葉光合作用，妨礙樹木生長發(fā)育和天然更新，導致森林大面積退化和衰亡[6- 9]。外生菌根真菌是森林生態(tài)系統(tǒng)中的重要成分，與樹木根系形成外生菌根。在Hg、Cd、Cu濃度較高的培養(yǎng)液中，某些菌株表現(xiàn)出較強的抗性，仍能正常生長[10- 12]。樹木接種外生菌根真菌，抗旱、抗病、抗重金屬能力增強，在逆境中的成活率提高[13- 15]。在含Mn較高的煤礦廢墟上，非菌根樹木一般不能成活，而利用彩色豆馬勃(Pisolithustinctorius)接種松樹幼苗之后，不僅提高成活率，并且促進生長[16]。在Cu、Cd、Zn嚴重污染的礦區(qū)土壤上，種植桉樹、松樹和杉樹的菌根苗能有效提高造林成功率[17- 18]。因此，利用菌根化苗木植樹造林是綠化、美化、治理礦山和污染土壤的重要措施之一[19- 20]。

外生菌根真菌一方面能促進樹木吸收養(yǎng)分，促進生長發(fā)育；另一方面通過吸附、絡合、沉淀等作用減少重金屬吸收[21- 23]。在重金屬脅迫下，鉚釘菇可分泌更多的酸性物質，螯合固定重金屬，降低生物有效性[24]；Ahonen-Jonnarth等報道，在Al脅迫下，接種菌根真菌的松樹幼苗比非菌根苗能夠分泌更多的有機酸[25]；鋁、錳脅迫提高外生菌根真菌Sl13、Cg04及Pt715分泌草酸和氫離子的速率，有機酸與Al3+和Mn2+發(fā)生絡合作用而減輕其毒害[22]。為此，試驗利用不同生態(tài)條件下獲得的外生菌根真菌，液培研究了Mn2+對菌絲生長，養(yǎng)分吸收，有機酸和氫離子分泌的影響，以及錳在菌絲細胞內(nèi)外的分布等，旨在篩選抗錳性較強的菌株，揭示其抗錳機理，為Mn污染土壤的植樹造林和生態(tài)修復提供科學依據(jù)和手段。

1材料與方法

1.1材料準備

在初選試驗的基礎上，利用大白菇RdFr(RussuladelicaFr.)、彩色豆馬勃Pt715(Pisolithustinctorius715)、土生空團菌CgFr(CenococcumgeophilumFr.)和厚環(huán)粘蓋牛肝菌SgKlS(Suillusgrevillei(Kl)Sing)為供試菌株。其中，RdFr來自于重慶金佛山馬尾松林的強酸性黃壤(pH ≤ 4.0)；Pt715從四川西昌干熱河谷的桉樹林(紅壤，pH = 5.9)中分離獲得；CgFr和SgKlS源于內(nèi)蒙古大青山的油松林土壤(pH ≈ 6.8—7.1)，由內(nèi)蒙古農(nóng)業(yè)大學的白淑蘭教授提供。

采用Pachlewski固體培養(yǎng)基，(25±1)℃暗培養(yǎng)供試菌株14d備用。培養(yǎng)基組成為(g/L)：0.5酒石酸銨、1.0 KH2PO4、0.5 MgSO4·7H2O、20葡萄糖、20瓊脂、0.1維生素B1、1.0 mL/L微量元素混合液(每L含8.45 mg H3BO3、5 mg MnSO47H2O、6 mg FeSO4·7H2O、0.625 mg CuSO4·5H2O、2.77 mg ZnCl2和0.27 mg (NH4)2Mo4O13·2H2O，pH 5.5。

1.2試驗設計

在我國西南錳礦和有色金屬礦區(qū)，土壤溶液中的活性錳變化于157.1— 824.50 mg/L，平均440.3 mg/L[26]。因此，試驗在Pachlewski液體培養(yǎng)基中(固體培養(yǎng)基除去瓊脂)，分別加入不同濃度的MnCl2·4H2O(分析純)，形成以下4個處理：0 mg Mn2+/L(無Mn2+，對照)、200 mg Mn2+/L(低Mn2+)、400 mg Mn2+/L(中Mn2+)和800 mg Mn2+/L(高Mn2+)。分別取25 mL含不同Mn2+濃度的液體培養(yǎng)基置于150mL三角瓶中，121℃ 高壓滅菌30min。冷卻后每瓶分別接種一塊直徑為6mm固體菌塊，(25±1)℃暗培養(yǎng)21d，重復10次。

1.3測定項目與方法

圖1　Mn2+對外生菌根真菌的菌絲生物量的影響Fig.1　Influence of Mn2+ on the hyphal biomass of ECM fungiRd Fr: 大白菇Russula delica Fr.; Pt 715: 彩色豆馬勃Pisolithus tinctorius 715; Cg Fr: 土生空團菌Cenococcum geophilum Fr.; Sg KlS: 厚環(huán)粘蓋牛肝菌Suillus grevillei(Kl.)Sing;不同小寫字母者表示Mn2+處理間差異顯著(P < 0.05);不同大寫字母表示菌株間差異極顯著(P < 0.01)

培養(yǎng)結束后，用精密酸度計測定培養(yǎng)液pH。然后，用0.1mol/L H2SO4酸化培養(yǎng)液至pH 3.0，過濾收集菌絲，高效液相色譜測定濾液中的有機酸。色譜條件為：Ion- 300有機酸分析專用柱(Phenomenex，Torrance，CA，USA)，20 μL進樣量，2.5 mmol/L硫酸為流動相，流速0.5mL/min，柱溫35 ℃，壓力450 psi，Diode Array L- 7455 紫外檢測器，檢測波長210 nm。檢測的有機酸包括草酸、檸檬酸、乙酸，其出峰時間(min) 依次為8.88、11.52、19.71。(80±1)°C烘干菌絲，測定生物量后用硫酸-高氯酸消化，依次用靛酚藍比色法、鉬藍比色法、火焰光度計法、原子吸收光光度計法測定消化液中的氮(N)、磷(P)、鉀(K)、錳(Mn)[27]。另取部分400 mg Mn2+/L培養(yǎng)的新鮮菌絲，去離子水洗凈，濾紙吸干，置于25 mmol HCl/L + 40 mmol Ca(NO)2/L交換溶液中，振蕩10 min(70 r/min)，過濾，重復3次，合并濾液，硫酸-高氯酸消化菌絲。用原子吸收光光度計分別測定濾液和消化液中Mn2+，前者為質外體中的Mn2+，后者為原生質中的Mn2+[10]。

1.4數(shù)據(jù)處理

用Excel 2013對試驗數(shù)據(jù)進行基本計算，SPSS軟件進行統(tǒng)計分析，Duncan法比較試驗處理間的差異性，顯著水準為5%和1%。

2試驗結果

2.1外生菌根真菌的菌絲生物量

外生菌根真菌的菌絲生物量(干重)因菌株不同而異，平均值變化于4.27 mg/瓶(CgFr) — 44.25 mg/瓶 (RdFr)之間(圖1)。Mn2+對RdFr生長無顯著影響；低濃度Mn2+刺激SgKlS生長，中、高濃度無抑制作用；但是，Mn2+顯著降低Pt715和CgFr的菌絲生物量，最大降幅分別為22.75%和33.33%。

2.2N、P、K含量和吸收量

N：Mn2+顯著降低外生菌根真菌菌絲含N量和吸收量(表1)。在800 mg Mn2+/L的培養(yǎng)液中，RdFr、Pt715、CgFr和SgKlS的菌絲含N量分別比對照降低了59.26%、46.37%、17.07%和79.87%，吸收量依次減少了60.00%、56.25%、50.00%和75.00%。

P：Mn2+對外生菌根真菌的菌絲含P量和吸收量的影響因菌株不同而表現(xiàn)出多樣性。隨培養(yǎng)液中的Mn2+濃度提高，RdFr的含P量和吸收量增加；Pt715的含P量無顯著變化，但吸收量降低；CgFr的含P量增加，吸收量無顯著變化(低濃度Mn2+除外)；SgKlS的含P量和吸收量均降低。

K：Mn2+顯著降低外生菌根真菌菌絲含K量和吸收量。在800 mg Mn2+/L培養(yǎng)液中，RdFr、Pt715、CgFr和SgKlS的含K量分別比對照降低了57.57%、23.32%、47.26%、40.91%，吸收量依次減少了61.90%、41.67%、62.50%、50.00%。

表1　Mn2+對外生菌根真菌菌絲N、P、K含量和吸收量的影響

RdFr: 大白菇(RussuladelicaFr.);Pt715: 彩色豆馬勃(Pisolithustinctorius715);CgFr: 土生空團菌(CenococcumgeophilumFr.);SgKlS: 厚環(huán)粘蓋牛肝菌(Suillusgrevillei(Kl.)Sing);在相同菌株不同Mn2+濃度處理的數(shù)據(jù)中，不同字母者表示差異顯著(P< 0.05), ** 表示差異極顯著(P<0.01)，ns表示差異不顯著

2.3有機酸和H+分泌

2.3.1有機酸

草酸：在Mn2+脅迫下，外生菌根真菌菌絲分泌草酸的速率因菌株不同而異(表2)。其中，低濃度Mn2+促進RdFr分泌草酸，但中、高濃度無顯著影響；Mn2+濃度增加，Pt715和CgFr分泌草酸的速率提高，SgKlS則相反。此外，草酸分泌速率CgFr >Pt715 >SgKlS >RdFr，平均分泌速率高低相差6.39倍。

檸檬酸：Mn2+對外生菌根真菌菌絲分泌檸檬酸的影響也因菌株不同而異(表2)。Mn2+促進RdFr分泌檸檬酸，但降低Pt715、CgFr和SgKlS的分泌速率。此外，分泌檸檬酸速率CgFr >SgKlS >RdFr和Pt715。

乙酸：在RdFr、Pt715和CgFr的培養(yǎng)液中，未檢測出乙酸(表2),但是，SgKlS分泌乙酸的速率隨Mn2+濃度增加而降低。在800 mg Mn2+/L的培養(yǎng)液中，其分泌速率比對照降低了76.30%。

2.3.2氫離子

表2可見，隨培養(yǎng)液中的Mn2+濃度提高，RdFr、Pt715和SgKlS分泌H+的速率持續(xù)降低(僅RdFr在高濃度Mn2+時例外，但仍顯著低于對照)，但CgFr分泌H+的速率則相反。在800 mg Mn2+/L的培養(yǎng)液中，RdFr、Pt715和SgKlS分泌H+的速率分別比對照降低了17.58%、65.91%和48.89%，CgFr增加了38.39%。

表2　Mn2+脅迫條件下，外生菌根真菌菌絲分泌草酸、檸檬酸、乙酸及H+的速率 (μmol g-1 d-1)

nd表示未檢出

2.4菌絲Mn含量、吸收量及其分布

2.4.1含量和吸收量

菌株不同，菌絲含Mn量和吸收量也不一樣，平均含Mn量CgFr >Pt715 >RdFr >SgKlS；平均吸收量RdFr最高，CgFr最低。隨培養(yǎng)液中的Mn2+濃度提高，菌絲含Mn量和吸收量顯著增加。在800 mg Mn2+/L培養(yǎng)液中，菌絲含Mn量和吸收量分別比對照增加了6.57—96.67倍和6.58%—112.42%(圖2)。

圖2　在不同Mn2+濃度的培養(yǎng)液中，外生菌根真菌的菌絲含Mn量和吸收量Fig.2　Mn2+ concentration and absorption by ECM hyphae grown in culture solution with variable Mn2+ concentrations

2.4.2Mn分布

表3可見，菌絲原生質含Mn量變化于0.53—2.01mg/g之間，質外體含Mn量為4.88—10.52mg/g，后者是前者的的5.23—11.2倍。此外，原生質和質外體含Mn量CgFr最高，分別是其它菌株的2.45—3.79倍(原生質)和1.64—2.15倍(質外體)。

表3　Mn在外生菌根真菌細胞內(nèi)外的分布/ (mg/g)

在同一列中，有不同字母者表示差異顯著(P= 0.05)

3討論

在逆境條件下，生物的生長狀況是反映其抗性的最重要指標[28- 29]。Mn2+對RdFr生長無顯著影響；低濃度Mn2+刺激SgKlS生長，中、高濃度仍無抑制作用，說明RdFr和SgKlS抗(耐)Mn的能力較強。繼續(xù)開展RdFr和SgKlS菌根植物抗(耐)Mn的研究，有益于它們的實際應用。

Blaudez等認為，外生菌根真菌對重金屬抗性的差異與它們的來源地有關[30]。供試菌株RdFr生長于重慶市金佛山馬尾松林下強酸性土壤(pH≤4.0)，活性Mn2+含量高，為了適應生存環(huán)境，物競天擇，逐漸進化出抗(耐)Mn能力較強的生物學特性。但是，SgKlS則來源于內(nèi)蒙古大青山油松林的中性土壤(pH 6.8—7.1)，活性錳含量較低[9]，推測SgKlS抗錳性較強可能為固有生物學特性。在培養(yǎng)基中添加不同濃度的Mn2+，均未抑制RdFr和SgKlS生長。推測在Mn2+含量較高的土壤中，RdFr和SgKlS也可能較好的生長。當它們與樹木根系形成外生菌根之后，生長良好的外延菌絲廣泛深入土壤，有益于擴大養(yǎng)分吸收空間，維持養(yǎng)分吸收，保持寄主植物健康，增強抗逆能力[31]。

值得注意的是，培養(yǎng)液中的Mn2+顯著降低RdFr和SgKlS分泌氫離子的速率。在土壤pH 3—9范圍內(nèi)，每提高一個pH值單位，Mn2+濃度下降100倍，故pH對活性Mn含量影響巨大[35]。因此，在Mn2+脅迫條件下，外生菌根真菌減少氫離子分泌可降低Mn的活性，是防止Mn2+進入菌絲的有效的途徑之一。在RdFr和SgKlS的菌絲和原生質中，含Mn量顯著低于CgFr和Pt715，說明抗(耐)Mn能力較強的菌株能有效地阻止Mn2+進入菌絲和原生質，減輕Mn毒。松樹幼苗接種彩色豆馬勃(Pisolithustinctorius)之后，Mn主要存在于根系表面的菌套中，僅有少量進入根系和運輸?shù)降厣喜?，由此減輕Mn的毒害作用[16]。此外，無論抗Mn2+性強弱，外生菌根真菌吸收Mn2+后，大量存在于質外體，僅少量進入原生質，類似Bidwell等[36]的研究結果。說明原生質膜是防御Mn2+進入細胞的重要屏障。

總之，RdFr和SgKlS具有較強的抗(耐)Mn2+性。在Mn2+脅迫的條件下，外生菌根真菌吸收P和分泌有機酸表現(xiàn)出多樣性，但減少氫離子分泌和Mn2+進入菌絲和原生質是抗性菌株的共同特性，可視為拮抗Mn2+害的重要機制之一。

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Influence of manganese on growth, nutrient uptake, and organic acid efflux by ectomycorrhizal fungi and manganese distribution in hyphae

PENG Liyuan1, XIONG Xingzheng1, LI Yan2, HUANG Jianguo1,*

1CollegeofResourcesandEnvironment,SouthwestUniversity,Chongqing400716,China2AgriculturalResearchInstituteofSichuan,Liangshanzhou,Xichang615000,China

Abstract：Acid soils are widespread in tropical and subtropical areas in the world and contain a high concentration of active manganese (Mn) at pH lower than 5.5. Ectomycorrhizal (ECM) fungi are important for artificial forestation in acid soils and ecological restoration in Mn-polluted regions. A better understanding of resistance mechanisms to Mn and selection of proper ECM fungi are vital prerequisites for producing ECM seedlings in nursery beds. Therefore, Russula delica Fr. (Rd Fr), Pisolithus tinctorius 715 (Pt 715), Cenococcum geophilum Fr. (Cg Fr), and Suillus grevillei (Kl.) Sing (Sg KlS) were grown in liquid culture media with various Mn2+concentrations, in order to study the growth, nutrient uptake (nitrogen, phosphorus, and potassium), organic acid efflux, and Mn distribution in fungal hyphae. The results showed no significant influence of Mn2+on the growth of Rd Fr at concentrations between 0 and 800 mg Mn2+/L. Low Mn2+concentrations simulated the growth of Sg KlS and no growth inhibition was observed at high Mn2+concentrations. In contrast, the growth rate of Pt 715 and Cg Fr was significantly reduced by Mn2+, and the biomass was decreased by 22.75% for Pt 715 and 33.33% for Cg Fr at high Mn2+concentrations, compared to the control (0 mg Mn2+/L). These results suggested that Rd Fr and Sg KlS were highly resistant to Mn2+, probably because of their environmental adaptation and biological evolution, as a result of their long-term habitation in acid soils with high concentrations of active Mn2+. A significant decrease was observed in both the content and absorption of nitrogen and potassium by ECM fungi in liquid media with Mn2+added, which could be unbeneficial to host nutrient uptake after the formation of ectomycorrhizas under Mn stress. The content and uptake of phosphorus and efflux of oxalate and citrate by ECM fungi showed diverse changes among fungi grown in culture media with added Mn2+. These results indicated that Mn2+fixation by phosphate or polyphosphates and Mn2+complexation by organic acids in the process of alleviating Mn2+toxicity varied among ECM fungal strains. Under Mn2+stress, proton efflux rate, and Mn content in hyphae, particularly in protoplasm, of Rd Fr and Sg KlS were consistently lower than those of Cg Fr and Pt 715, the sensitive fungi to Mn2+. The decreased availability and absorption of Mn2+could thus be considered as an important mechanism of ECM fungi to alleviate Mn2+toxicity. In addition, most of Mn2+absorbed by fungal hyphae located in apoplasts and only few entered into protoplasm. Mn2+in apoplast ranged between 5.23 and 9.21 folds of protoplasm. Therefore, plasma membrane could be considered as an important barrier of ECM fungi against Mn2+entry into the cells. Since lab culture and field conditions are different, further studies are necessary on the influence of Mn stress on tree roots and ECM fungi in the field.

Key Words:manganese stress; ectomycorrhizal fungus; organic acid; nutrient

基金項目:國家自然科學基金資助項目(40771112, 41171215); 西南大學資源環(huán)境學院大學生科技創(chuàng)新“光炯”培育重點項目(20130215)

收稿日期:2014- 09- 29; 網(wǎng)絡出版日期:2015- 10- 10

*通訊作者

Corresponding author.E-mail: huang99@swu.edu.cn

DOI:10.5846/stxb201409291929

彭麗媛，熊興政，李艷，黃建國.錳對外生菌根真菌生長、養(yǎng)分吸收、有機酸分泌和菌絲體中錳分布的影響.生態(tài)學報,2016,36(10):2819- 2825.

Peng L Y, Xiong X Z, Li Y, Huang J G.Influence of manganese on growth, nutrient uptake, and organic acid efflux by ectomycorrhizal fungi and manganese distribution in hyphae.Acta Ecologica Sinica,2016,36(10):2819- 2825.