鎘脅迫下活性炭對小麥幼根的保護作用

馮漢青, 杜變變, 王慶文, 王榮方, 賈凌云, 孫　坤, 周田寶

1 西北師范大學生命科學學院，蘭州　730070 2 西北師范大學化學化工學院，蘭州　730070

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鎘脅迫下活性炭對小麥幼根的保護作用

馮漢青1,*, 杜變變1, 王慶文1, 王榮方2, 賈凌云1, 孫坤1, 周田寶2

1 西北師范大學生命科學學院，蘭州730070 2 西北師范大學化學化工學院，蘭州730070

摘要:對鎘處理下活性炭對小麥幼根的保護作用進行了研究。在小麥幼根的水培環(huán)境中加入鎘導致了小麥幼根根長的降低、干重及鮮重的下降、細胞死亡水平上升和可溶性蛋白含量的增加。將小麥幼根置于加入活性炭的水培環(huán)境中并未對小麥幼根的根長、干重、鮮重、細胞死亡水平和可溶性蛋白的含量造成不良的影響，且在一定程度上促進了根的生長并降低了細胞的死亡水平。而在鎘處理下加入活性炭則明顯減緩了小麥幼根的根長的降低、干重及鮮重的下降、細胞死亡水平上升和可溶性蛋白含量的增加。上述觀察表明，活性炭的加入對于鎘和氯苯脅迫下小麥幼根具有一定的保護作用。

關鍵詞：活性碳；鎘；幼根；小麥

由于活性炭具有強大的吸附作用且易于制備，從而被廣泛應用于工業(yè)、材料以及醫(yī)療等多個科學領域。盡管活性炭并不是植物自身所需要的成分，但近年來活性炭也逐漸應用于植物學和生態(tài)學的研究當中。研究發(fā)現(xiàn)，在植物生長培養(yǎng)基中加入適量的活性炭可以顯著改善培養(yǎng)基成分的比例、為根的生長創(chuàng)造暗環(huán)境、增加通氣量、并能夠吸附培養(yǎng)基中抑制植物生長的物質(zhì)，從而在植物的微繁殖、體細胞胚發(fā)生、花藥培養(yǎng)、原生質(zhì)體培養(yǎng)中發(fā)揮了一定的作用[1- 5]。 此外，植物葉片所產(chǎn)生的揮發(fā)性化合物和根部所產(chǎn)生的代謝物在植物與昆蟲的相互作用以及在植物間的信息交流中起著重要作用；而由于活性炭對這些有機物具有較強的吸收作用，其也被作為一種有力的工具去研究這些植物所產(chǎn)生的化合物的含量、組分以及生理及生態(tài)學作用[6- 7]。

隨著人類活動對自然環(huán)境影響的不斷加劇，環(huán)境污染的問題日益嚴重。其中，最為嚴重的問題之一是重金屬離子和有機物對環(huán)境的污染。這兩大類污染物通過水體大量地進入植物體內(nèi)。在污染環(huán)境的諸多重金屬中，鎘(Cd)在生物體內(nèi)的蓄積性及毒性較強。研究發(fā)現(xiàn)，當鎘在植物體內(nèi)積累到一定程度時，會導致植物生長遲緩、營養(yǎng)元素的吸收受阻、光合作用和呼吸作用水平下降、褪綠乃至植物死亡[8- 11]。因此，鎘嚴重破壞了植物在生態(tài)環(huán)境中的生長并對農(nóng)業(yè)生產(chǎn)構成了一定的威脅。

如何減少重金屬離子對植物的影響始終是植物學和生態(tài)學研究的重點和難點問題。由于活性炭同時具有吸附金屬離子的作用[12]；因此，在植物受到重金屬離子的脅迫下，活性炭的使用應有望成為一種對植物進行保護的有效方式。然而，目前國內(nèi)外往往只對活性炭對金屬離子的吸附作用進行的研究，而活性炭是否能夠起到緩解金屬離子對植物的毒害作用則研究甚少。

基于此，本文以小麥幼根為材料，研究了在重金屬離子鎘的脅迫下，活性炭對小麥幼根的保護作用。相信該研究能夠進一步豐富活性炭在植物及生態(tài)學研究領域的應用思路，并能對如何減少重金屬離子對植物的毒害這一問題的解決提供一定的借鑒和參考。

1材料及方法

1.1植物材料的培養(yǎng)

將供試驗材料小麥(TriticumaestivumL.)品種為春小麥綿雜麥168。種子用水沖洗5—6次，并用0.1%的NaClO表面消毒15 min，之后用蒸餾水沖洗3—5次以去除種子表面殘余的NaClO。此后將種子放于培養(yǎng)皿中用濕紗布覆蓋，在28℃黑暗條件下催芽。待露白之后選取露白一致的種子放置于平展開的紗布上，并將紗布置于盛有蒸餾水的培養(yǎng)皿上，用皮筋固定緊繃紗布，使根生長于蒸餾水中。在28℃下培養(yǎng)生長。

1.2材料處理及方法

對于Cd的處理：待根長到2—3 cm左右時(在該時期，幼苗尚未完全進入光合生長階段，故而能降低光合作用產(chǎn)物向根部輸送而干擾根對鎘的耐受性)，選取長勢一致的小麥幼苗，用同樣的方法將小麥幼苗的幼根并分別進行以下處理：1)置于蒸餾水(對照組)；2)置于含有25、50 mg/L或100 mg/L的Cd(NO3)2溶液中；3)置于加入了活性炭的蒸餾水(添加比例為每升蒸餾水3g活性炭)中；4)置于加入了活性炭的25、50、100 mg/L Cd(NO3)2溶液(添加比例為每升溶液3g活性炭)中。在上述不同溶液中培養(yǎng)24 h或48 h后進行以下數(shù)據(jù)的測量。每個處理為5株小麥，實驗為4次獨立實驗的平均值。

1.3幼根長度的測定

將幼苗小心地從處理液中取出，立刻用蒸餾水沖洗5—6次，參考He等[13]所報道的方法測量根長并記錄數(shù)據(jù)。

1.4幼根鮮重和干的重測定

根用蒸餾水沖洗5—6次后，用吸水紙將表面水分吸干，用分析天平測其鮮重，記錄數(shù)據(jù)后放入烘箱，100℃烘箱加熱30 min，然后在(80±1)℃ 烘干至恒重，用分析天平稱其干重。

1.5可溶性蛋白質(zhì)含量的測定

將幼根切下，稱重后放入研缽中，加5 mL蒸餾水研磨成勻漿，放置0.5—1h后在4 000 r/min離心20 min，棄去沉淀，上清液轉入另一離心管，并以蒸餾水定容所得提取液。吸取提取液0.1mL，加入5mL考馬斯亮藍G- 250蛋白溶液，充分混合，放置2 min后用在595nm下比色，記錄吸光值，并依標準曲線計算蛋白質(zhì)含量。

1.6根細胞死亡程度

根細胞死亡程度參照Hung等[14]所報道的方法進行。將處理后的小麥幼根用蒸餾水清洗、吸干，在室溫下浸泡于質(zhì)量百分數(shù)0.25%的伊文思藍溶液中染色20 min。隨后取出小麥幼根, 用水清洗表面的伊文思藍染液15min，以去除過量的及未結合在細胞中的染料。然后將幼根放置在蒸餾水中過夜。之后，將幼根切成均勻小段，放入5 mL質(zhì)量分數(shù)為50%的甲醇和1% SDS(十二烷基磺酸鈉)的混合提取液中，在50 ℃下水浴1 h，將含有伊文思藍的提取液在595 nm處測量OD值(光吸收值)。

1.7統(tǒng)計學分析

以上測量取4次以上的獨立實驗結果的平均值，并將數(shù)值表示為平均值±標準偏差(SD)。使用方差檢驗的Kruskall-Wallis單因素分析的數(shù)據(jù)進行分析。以P<0.05為有統(tǒng)計學上的顯著性差異。

2結果與分析

2.1在不同Cd濃度處理下活性炭對小麥幼根的保護作用

圖1　不同處理對小麥幼根根長的影響　Fig.1　The effects of different treatments on the length of wheat seedlings′ roots數(shù)值為4次平行實驗的平均值±標準差，不同字母表示在同一濃度的Cd處理下數(shù)值之間在P < 0.05水平上具有顯著性差異;*表示Cd處理下數(shù)值較之對照在P < 0.05水平上具有顯著性差異

將小麥幼苗分別置于含有25、50 mg/L或100 mg/L的Cd(NO3)2溶液中處理24 h，并以置于蒸餾水中的小麥幼根作為對照。結果顯示，在上述不同濃度的Cd處理24 h后，小麥幼根的根長較之對照顯著性下降(圖 1)。用加入活性炭(AC)的蒸餾水處理小麥幼苗，發(fā)現(xiàn)和對照相比，單獨活性炭(AC)的處理使得小麥幼根的根長有所增加。而在Cd溶液中加入活性炭(AC+Cd)則顯著性緩解了Cd處理對小麥幼根的根長的抑制作用。較之在25、50 mg/L或100 mg/L的Cd單獨處理下，在上述不同Cd溶液中加入活性炭使得小麥幼根的根長分別顯著性增加了約1.3、1.6倍和1.5倍(圖1)。

在不同濃度的Cd處理24 h后，小麥幼根的鮮重和干重較之對照也顯著性下降(圖 2)。和對照相比，單獨活性炭的處理對小麥幼根的鮮重和干重無顯著性差異。而在Cd溶液中加入活性炭(AC+Cd)則顯著性緩解了Cd處理對小麥幼根的鮮重和干重的降低作用。較之在25、50 mg/L或100 mg/L的Cd單獨處理下，在上述不同Cd溶液中加入活性炭使得小麥幼根的鮮重分別顯著性增加了約1.5、1. 6倍和1.3倍(圖2)；而使得小麥幼根的干重分別顯著性增加了1.2、1.7倍和1.4倍(圖2)。

圖2　不同處理對小麥幼根鮮重和干重的影響Fig.2　The effects of different treatments on the fresh weight and dry weight of wheat seedlings′ roots數(shù)值為4次平行實驗的平均值±標準差，不同字母表示在同一濃度的Cd處理下數(shù)值之間在P < 0.05水平上具有顯著性差異;星號表示Cd處理下數(shù)值較之對照在P < 0.05水平上具有顯著性差異

測量表明，和對照相比，小麥幼根的可溶性蛋白質(zhì)含量在Cd處理下顯著性上升。而較之在的Cd單獨處理下，在Cd處理下加入活性炭則使得可溶性蛋白質(zhì)的含量顯著性下降 (圖3)。較之在25、50 mg/L或100 mg/L的Cd單獨處理下，在上述不同Cd溶液中加入活性炭使得小麥幼根可溶性蛋白質(zhì)的含量分別顯著性降低了約27%，27%和10%(圖3)。

同時本研究對上述不同處理下的小麥幼根細胞的死亡程度進行了研究。結果表明，與對照組相比，單獨AC處理下根細胞死亡程度有一定的下降。而Cd處理下的根細胞死亡程度較之對照顯著性增加。較之在Cd單獨處理下，在Cd溶液中加入活性炭使得小麥幼根幼根細胞死亡水平有所降低。其中，在50 mg/L的Cd對細胞死亡的緩解作用最為明顯,緩解了約14%(圖4)。

圖3　不同處理對小麥幼根可溶性蛋白水平的影響　Fig.3　The effects of different treatments on the content of soluble protein of wheat seedlings′ roots數(shù)值為4次平行實驗的平均值±標準差，不同字母表示在同一濃度的Cd處理下數(shù)值之間在P < 0.05水平上具有顯著性差異;星號表示Cd處理下數(shù)值較之對照在P < 0.05水平上具有顯著性差異

圖4　不同處理對小麥幼根細胞死亡水平的影響　Fig.4　The effects of different treatments on the level of wheat seedlings′roots cell death數(shù)值為4次平行實驗的平均值±標準差，不同字母表示在同一濃度的Cd處理下數(shù)值之間在P < 0.05水平上具有顯著性差異;星號表示Cd處理下數(shù)值較之對照在P < 0.05水平上具有顯著性差異

選取了50 mg/L的Cd溶液處理下小麥幼根細胞進行伊文思藍染色發(fā)現(xiàn):50 mg/L Cd處理下的根細胞染色程度與對照組相比明顯加深。單獨AC處理下小麥幼根細胞染色程度略淺于對照；而Cd和AC共同處理后的小麥幼根與單獨Cd處理下的小麥幼根相比，前者染色程度明顯性低于后者(圖5)。上述結果表明，AC的加入明顯緩解了50 mg/L Cd處理下幼根細胞的死亡，可見Cd處理下AC的加入對小麥幼根細胞具有一定的保護作用。

圖5　利用伊文思藍染色檢測不同處理下小麥幼根死亡程度Fig.5　The effects of different treatments on the level of cell death in wheat seedlings′roots examined using Evans blue staining assay

2.2在同一Cd濃度不同時間處理下活性炭對小麥幼根的保護作用

為了進一步探索在Cd處理不同時間下活性炭對小麥幼根的保護作用。將小麥幼苗置于100 mg/L的Cd(NO3)2溶液中分別處理24h或48h。并在Cd溶液處理不同時間下，比較了Cd單獨處理和在Cd溶液中加入活性炭(AC+Cd)處理下小麥幼根參數(shù)的差異。實驗發(fā)現(xiàn)，在Cd溶液48 h下活性炭對小麥幼根的保護作用強于在24 h下。在100 mg/L的Cd(NO3)2溶液處理24后，Cd處理和AC+Cd處理下小麥幼根根長、鮮重和干重的差值分別為0.96 cm、4 mg 和0.29 mg；而在Cd(NO3)2溶液處理48 h后，Cd處理和AC+Cd處理下小麥幼根根長的差值為2.12 cm、13 mg 和1.59 mg(圖6)。而在100 mg/L的Cd(NO3)2溶液處理24 h后，Cd處理和AC+Cd處理下幼根蛋白質(zhì)含量和細胞死亡的差值分別為1.69 mg/g 和0.0082；而在Cd(NO3)2溶液處理48h后，Cd處理和AC+Cd處理下小麥幼根根長的差值為2.41 mg/g 和0.016(圖6)。

圖6　不同時間Cd(100 mg/L)處理下活性炭對小麥幼根的保護作用Fig.6　The role of activated carbon in protecting the roots of wheat seedlings under cadmium stress with different times數(shù)值為4次平行實驗的平均值±標準差

3討論

根是植物經(jīng)受水體或土壤中污染物的主要器官。本研究發(fā)現(xiàn)，不同濃度的Cd處理導致了小麥根長和生物量(鮮重及干重)的顯著性降低(圖1和圖2)以及細胞死亡的發(fā)生(圖4和圖5)，表明了Cd脅迫抑制了小麥根的生長；而由于植物組織的生長抑制和生物量的下降是細胞死亡的必然結果，因而提示了Cd對小麥根生長和生物量的抑制作用可能和其導致了細胞死亡有關。

有學者認為，植物在受到環(huán)境脅迫時會大量合成一些可溶性蛋白質(zhì)來保護或維持植物的基本結構或功能[15- 16]。Alayat 等[17]報道了Cd處理引起了小麥葉片可溶性蛋白含量上升，且可溶性蛋白含量的上升水平和Cd處理濃度正相關。Kavita 和Dubey發(fā)現(xiàn)，Cd也可以通過抑制蛋白酶的活性而導致了植物中可溶性蛋白含量的上升[18]。因此，盡管Cd脅迫下可溶性蛋白含量的變化有著較為復雜的機理，但可溶性蛋白含量的上升反映了植物受到了Cd的脅迫壓力。而本研究也發(fā)現(xiàn)，不同濃度的Cd引起了根可溶性蛋白含量的增加(圖3)。

單獨對小麥根施加活性炭使得根長略有增加，也使得根細胞死亡程度有所降低，但其對小麥幼根的鮮重、干重以及可溶性蛋白質(zhì)的含量無顯著性影響(圖1—圖5)，這表明了在非脅迫環(huán)境下加入活性炭能夠在一定程度上優(yōu)化根的生長和細胞活力。推測這可能是由于活性炭可以增加根部的通氣量和吸附植物的代謝廢物[1- 5]所致。而在不同濃度的Cd處理下，活性炭均能夠在不同程度上減緩小麥幼根根長、干重及鮮重的下降，以及細胞死亡水平和可溶性蛋白含量的增加(圖1—圖5)。本文還進一步研究了在較長時間Cd脅迫下活性炭對小麥幼根的保護作用。以100 mg/L的Cd溶液處理24 h和48 h為例：在Cd溶液處理48 h下活性炭對小麥幼根的保護作用較之在24 h下更加明顯(圖6)。綜上的結果顯示，活性炭的加入能起到緩解Cd對植物的毒害作用。

以前的研究表明，活性炭對水中的Cd具有較強的吸附性能[12]，因而，活性炭對于鎘處理下小麥幼根的保護作用可能主要歸結于活性炭對Cd的吸附。而Rao等的工作表明，隨著活性炭劑量的增加，活性炭的可交換位點及表面積不斷上升，因而可以進一步提高對Cd的吸附性[19]。在植物生長的過程中，活性炭可能吸附了Cd與根代謝物所形成的其他可能抑制根細胞生長或活力的化合物,其細節(jié)化的機理有待探討。同時，除了Cd之外，活性炭能夠?qū)Χ喾N污染性的重金屬及有機物進行吸附[20- 21]。因此，施加活性炭有望成為減少重金屬離子和有機物對植物毒害的有效方式。但活性炭的劑量必須以考慮其成本為前提。本實驗室通過生物廢料研制了一些成本低廉的活性炭[22]，將會降低該方法的使用成本。

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The role of activated carbon in protecting the roots of wheat seedlings under cadmium stress

FENG Hanqing1,*, DU Bianbian1, WANG Qingwen1, WANG Rongfang2, JIA Lingyun1, Sun Kun1, ZHOU Tianbao2

1CollegeofLifeSciences,NorthwestNormalUniversity,Lanzhou730070,China2CollegeofChemistryandChemicalEngineering,NorthwestNormalUniversity,Lanzhou730070,China

Abstract：Aims: Our objectives were to reveal the role of activated carbon in protecting the roots of wheat (Triticum aestivum L.) seedlings under Cd (cadmium) stress. Methods: The roots of wheat seedlings were subjected to hydroponic conditions, and the length, dry weight, fresh weight, level of cell death, and soluble protein content of the roots were measured and compared under Cd stress in the presence of activated carbon. Important findings: Under Cd stress, the length, dry weight, and fresh weight of the roots of wheat seedling significantly decreased, while the level of cell death and content of soluble proteins of the roots significantly increased. These observations indicate that Cd stress causes obvious damages to the roots of wheat seedlings. Sole application of activated carbon had no negative effects on the length, dry weight, fresh weight, level of cell death, and content of soluble proteins of the roots of wheat seedlings. In addition, the application of activated carbon enhanced the growth of the roots and decreased the level of cell death of the roots to some extent. Further, the values of the length, dry weight, fresh weight, level of cell death, and content of soluble proteins of the roots under Cd stress were compared with those under Cd stress in the presence of activated carbon. The results revealed that the values of the length, dry weight, and fresh weight of the roots under Cd stress were significantly lower than those under Cd stress in the presence of activated carbon, while the level of cell death and content of soluble proteins of the roots under Cd stress were significantly higher than those under Cd stress in the presence of activated carbon. These results indicate that application of activated carbon can protect the roots of wheat seedlings against Cd stress.

Key Words:activated carbon; cadmium; root; wheat

基金項目:國家自然科學基金資助項目(31260059)

收稿日期:2014- 11- 13; 網(wǎng)絡出版日期:2015- 09- 28

*通訊作者

Corresponding author.E-mail: fenghanq@nwnu.edu.cn

DOI:10.5846/stxb201411132244

馮漢青, 杜變變, 王慶文, 王榮方, 賈凌云, 孫坤, 周田寶.鎘脅迫下活性炭對小麥幼根的保護作用.生態(tài)學報,2016,36(10):2962- 2968.

Feng H Q, Du B B, Wang Q W, Wang R F, Jia L Y, Sun K, Zhou T B.The role of activated carbon in protecting the roots of wheat seedlings under cadmium stress.Acta Ecologica Sinica,2016,36(10):2962- 2968.