三種隱孢子蟲鈣依賴蛋白激酶的生物信息學分析

張學勇簡瑩娜馬利青

(1. 青海大學畜牧獸醫科學院， 西寧 810016;2. 青海省畜牧獸醫科學院，西寧 810016)

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三種隱孢子蟲鈣依賴蛋白激酶的生物信息學分析

張學勇1，2，簡瑩娜1，2，馬利青1，2*

(1. 青海大學畜牧獸醫科學院， 西寧 810016;2. 青海省畜牧獸醫科學院，西寧 810016)

摘要：對三種隱孢子蟲(C. parvum Iowa II、 C. hominis TU502和C. muris RN66)鈣依賴蛋白激酶(Calcium-dependent protein kinases, CDPKs)進行生物信息學分析，探索該蛋白的結構并預測其功能，為其基因功能的研究提供一定的理論基礎。通過隱孢子蟲基因組數據庫收集數據，獲得三種隱孢子蟲CDPKs蛋白的序列信息，通過生物信息學軟件進行分析，預測該蛋白的理化性質、翻譯后修飾位點、功能域、亞細胞定位、二級結構、親/疏水性、抗原表位等。隱孢子蟲CDPKs的蛋白性質不穩定，理論分子量從59.76 kDa到76.63 kDa，pI值為5.33～6.09，CDPKs不具有跨膜區和信號肽，不是跨膜分泌性蛋白，都具有蛋白激酶C 磷酸化位點、酪氨酸激酶Ⅱ磷酸化位點、酪氨酸激酶磷酸化位點、cAMP和cGMP依賴蛋白激酶磷酸化位點、N-端糖基化位點、N-端肉豆蔻?；稽c和EF-hand鈣結合域，二級結構主要以α螺旋和無規卷曲為主；CDPKs主要存在蟲體細胞內，均有20多個潛在的抗原表位。在隱孢子蟲中，CDPKs蛋白不僅可單獨發揮作用，而且還能通過相互結合發揮其生物學效應；同時，CDPKs有望成為候選疫苗及潛在藥物靶點。

關鍵詞：隱孢子蟲；鈣依賴蛋白激酶；生物信息學；蛋白結構；功能預測

隱孢子蟲(Cryptosporidiumspp.)是一種呈世界性分布的人獸共患寄生性原蟲，已成為世界范圍內水源性傳播疾病中的重要病原體，它們能感染人、家畜和野生動物，嚴重威脅著人類和動物的健康及畜牧業的發展[1]。因為隱孢子蟲是機會性致病病原體，在免疫功能低下的個體中常常出現暴發性或慢性、長期性感染，嚴重時可引發死亡，且目前尚無有效的預防治療方法[2]。隨著三株隱孢子蟲(C.parvumIowaII，C.hominisTU502和C.murisRN66)全基因組測序工作的完成[3-4]，這將更有利于對其基因結構和功能的研究。

鈣依賴蛋白激酶(Calcium-dependent protein kinases, CDPKs)是一種絲氨酸/蘇氨酸蛋白激酶，此激酶接收并傳導Ca2+信號且其活性受Ca2+的調控而不依賴鈣調素和磷脂。典型的CDPK分子是由四個結構域組成的多肽鏈，包括N末端的可變結構域(N-terminal variable domain)、激酶活性結構域(Kinases domain)、連接結構域(Junction domain，JD)和C末端鈣調素類似結構域(CaM-like domain，CLD)[5]，其參與多種生命活動的調控。

由于哺乳動物中不存在CDPKs的同源蛋白，所以CDPKs是理想的抗隱孢子蟲的候選藥靶。為了更好地分析這類蛋白激酶的功能及對隱孢子蟲的重要意義，本文對隱孢子蟲CDPKs蛋白的結構和特征進行全面的生物信息學分析，為進一步研究其生物學功能及其在疫苗和藥靶研究中的應用提供線索。

1材料與方法

1.1數據收集

在隱孢子蟲基因組數據庫(http://cryptodb.org/cryptodb/)中“Gene Text Search”信息欄輸入并搜索CDPK，收集C.parvumIowaII，C.hominisTU502和C.murisRN66基因組中的CDPKs，獲取各蛋白相對應的核苷酸序列及蛋白序列。

1.2結構域分析與驗證

將搜索獲得的蛋白序列輸入到NCBI結構域數據庫(http://www.ncbi.nlm.nih.gov/Structure/cdd/wrpsb.cgi)中進行各蛋白的結構域搜索，以進一步確定分析CDPKs結構域；而后用在線搜索工具Pfam(http://pfam.xfam.org/)驗證結構域搜索結果。

1.3蛋白質特性預測

將各個蛋白序列輸入到ExPASy(http://www.expasy.org/)數據分析系統中，進行蛋白特性預測。采用ProtParam(http://web.expasy.org/protparam/)程序計算蛋白質的分子量、等電點和氨基酸組成等理化性質；采用TargetP(http://www.cbs.dtu.dk/services/TargetP/)和SignalP (http://www.cbs.dtu.dk/services/SignalP/)程序分析亞細胞定位序列等特征序列：分泌信號肽、質體、線粒體和過氧化物酶體等；采用Motif Scan(http://myhits.isb-sib.ch/cgi-bin/motif_scan)程序預測糖基化、磷酸化、脂?；?、cAMP和cGMP依賴蛋白激酶磷酸化位點及EF-hand鈣結合域等修飾位點和模序。

1.4蛋白質的二級結構和抗原表位分析

利用DAS-TMfilter server(http://mendel.imp.ac.at/sat/DAS/DAS.html)、HMMTOP(http://www.enzim.hu/hmmtop/index.php)和TMHMM-2.0(http://www.cbs.dtu.dk/services/TMHMM-2.0/)分析蛋白的跨膜區域，應用ProtScale(http://web.expasy.org/protscale/)分析蛋白質的親/疏水性。采用SOPMA(https://npsa-prabi.ibcp.fr/cgi-bin/npsa_automat.pl?page=npsa_sopma.html)軟件進行蛋白二級結構預測；利用Predicted Antigenic Peptides(http://imed.med.ucm.es/Tools/antigenic.pl)進行抗原表位分析。

1.5序列比對與構建系統發育樹

通過NCBI提供的BLAST在線搜索服務軟件獲取頂復門寄生原蟲弓形蟲(ToxoplasmagondiiME49)、瘧原蟲(Plasmodiumreichenowi)、巴貝斯蟲(Babesiabovis)、球蟲(Eimeriatenella)及隱孢子蟲(C.parvumIowaII，C.hominisTU502和C.murisRN66)CDPKs的氨基酸序列。使用MEGA5.05軟件的系統發育樹構建功能對這些氨基酸序列進行分析，選擇鄰近法(Neighbor-Joining method, NJ)構建系系統發育樹，并使用自展值(Bootstrap)檢驗其可靠性，重復次數為2 000，分析不同頂復門寄生原蟲CDPKs基因間的進化關系。

2結果分析

2.1含CDPK結構域蛋白的初篩和確定

在隱孢子蟲基因組數據庫的全基因組中搜索獲得15個含有CDPK的結構域蛋白，根據注釋描述分析發現5個假設蛋白(Hypothetical/putative protein)，除去這些假設蛋白，將剩余的10個蛋白序列輸入到NCBI結構域網站中搜索CDPK結構域后，只有6個蛋白是真正的CDPK蛋白，為進一步確認淘汰的是否是CDPK蛋白，將其輸入到pfam結構域搜索，結果仍不是CDPK蛋白。因此，對這6個真正的CDPK蛋白進行深入分析。

2.2蛋白基本性質分析

經過ExpASy在線系統分析，如表1所示這些蛋白的基本性質：其在氨基酸長度、分子量大小和等電點上差異不大，其氨基酸長度在523～677 aa，分子量從59.76 kDa到76.63 kDa，pI值從5.33～6.09，呈現著明顯的區別。帶正(12.35%～14.91%)、負(14.03%～16.25%)電荷氨基酸殘基數占氨基酸總數比例基本一致，且帶正電荷氨基酸殘基比帶負電荷氨基酸殘基多。假定所有的半胱氨酸都形成二硫鍵，CDPKs在280 nm處的摩爾消光系數：46 215～87 500 L/mol·cm及0.1%濃度(1 g/L)的Abs值：0.773～1.128；假定所有的二硫鍵打開時，蛋白在280 nm處的摩爾消光系數：45 840～86 750 L/mol·cm及0.1%濃度(1 g/L)的Abs值為：0.767～1.119，可見其吸光性質有所差別。CDPKs在溶液中的不穩定指數為：37.46～45.06，除Cgd5_820外均高于閾值40，推測CDPKs為不穩定蛋白。CDPKs的脂肪族指數為：84.38～87.58，親水性平均系數：-0.397～-0.486，蛋白總體親水性較低。

表1　CDPKs基本性質分析

注：A*：假定所有的半胱氨酸都形成二硫鍵，蛋白在280 nm處的摩爾消光系數值(L/mol·cm)及0.1%濃度(1 g/L)的Abs值；

B*：假定所有的二硫鍵打開時，蛋白在280 nm處的摩爾消光系數值(L/mol·cm)及0.1%濃度(1 g/L)的Abs值。

2.3 翻譯后修飾和結構特征性序列分析

模序分析潛在的翻譯后修飾位點顯示(如表2)，CDPKs蛋白含有糖基化位點：1～3個，糖基化位點保證CDPKs能夠正確折疊且可以傳導信號。蛋白激酶C 磷酸化位點：6～9個；酪氨酸激酶Ⅱ磷酸化位點：11～14個；酪氨酸激酶磷酸化位點：1～2個；cAMP和cGMP依賴蛋白激酶磷酸化位點：1～3個；這可以促進其和其他蛋白質相互作用而形成多蛋白復合體，再進一步促進蛋白質的磷酸化。N端肉豆蔻酰化位點：2～5個； EF-hand鈣結合域：7～8個；EF-hand結構域能與Ca+2離子結合而改變構象，進而暴露靶結合位點而發揮生物學功能。這些結構特征性序列如表2所示，表明CDPKs具有重要的生物學功能。

2.4蛋白的亞細胞定位、抗原表位和二級結構預測與分析

對CDPKs的信號肽和信號肽酶剪切位點的預測顯示(如表3), 它們的序列信號肽預測分值為：0.043～0.280，cutoff預測值均為0(< 0. 9) ，表明CDPKs序列無信號肽和信號肽酶剪切位點。CDPKs的亞細胞定位分析發現，CDPKs序列定位于線粒體的部分得分為：0.063～0.274(< 0. 9) ，而定位于其他部分的得分為：0.678～0.954(> 0. 95)，說明CDPKs序列沒有線粒體等定位序列，且該預測具有較高可信度。CDPKs的二級結構預測分析發現α螺旋比例為：34.62%～49.33%，β折疊比例為：7.53%～11.66%，無規則卷曲比例為：23.14%～34.17%，延伸鏈比例為：13.86%～21.30%，可見CDPKs的二級結構以無規則卷曲為主。對CDPKs蛋白的氨基酸序列中潛在的抗原表位做進一步分析, 顯示有20～29個潛在的抗原表位，且平均抗原傾向性均大于1.000，CDPKs蛋白含有較多的優勢抗原表位結構，可作為一種免疫原性蛋白。

2.5 系統發育樹的構建

通過MAGE5.05軟件構建的NJ 樹如圖1所示，其中用于構建系統發育樹的3種隱孢子蟲分析序列分為3個類群，有意思的是它們均與ToxoplasmagondiiME49聚為一支，可見在系統發育樹上發現它們之間的進化距離最近。并且Chro.20142、cgd2_1300和Chro.70214、cgd7_1840一致性最高，可見C.parvumIowaII和C.hominisTU502的親緣關系較近。這為后續從分子遺傳學角度探索CDPKs的功能及其作為候選藥靶和疫苗提供了新的思路。

表2　翻譯后修飾和結構特征性序列分析

表 3　亞細胞定位和抗原表位分析及二級結構預測與分析

3討論

CDPKs是一類屬于絲氨酸/蘇氨酸蛋白激酶，在各種植物和原生動物中廣泛存在并參與多種生命活動的調控。如在植物中，CDPKs參與離子泵/離子通道的開合、基因轉錄、細胞骨架構建、基因轉錄和新陳代謝等過程的調控[6]。隨著原生生物基因組測序工作的開展，在弓形蟲、瘧原蟲等頂復門原蟲中發現了多個CDPKs同源蛋白[5]。在弓形蟲和瘧原蟲研究中發現，CDPKs參與調控弓形蟲蟲體入侵細胞、運動、分化和蛋白分泌等生理過程；瘧原蟲的CDPKs可調控其入侵按蚊小腸上皮細胞和在宿主體內發育等過程。Manja Etzold等實驗研究表明，隱孢子蟲的CDPKs具有階段性表達特征，CDPKs在隱孢子蟲的生長發育以及進化過程中均發揮了重要作用[7]。同時，研究表明在哺乳動物中不存在CDPKs，所以CDPKs可以作為有效的疫苗和藥靶研究候選分子[8-9]。

圖1　隱孢子蟲與其他頂復門寄生原蟲CDPKs的系統發育分析

通過分析發現隱孢子蟲的CDPKs是不具備分泌信號肽的疏水性蛋白，推測其在細胞內合成后可以直接發揮生物學功能。蛋白的多肽鏈合成后，不具有生物學活性，翻譯完成后需要經過一系列的加工形成相對穩定的空間結構，從而發揮生物學功能；通過預測蛋白的二級結構發現，CDPKs由α螺旋和無規則卷曲構成。多項研究表明，蛋白質的去磷酸化和磷酸化對于細胞內信號傳導十分重要，可以調控多種細胞過程活動[10]；對隱孢子蟲的CDPKs分析發現，CDPKs具有多個磷酸化位點，如蛋白激酶C磷酸化位點、酪氨酸激酶Ⅱ磷酸化位點、酪氨酸激酶磷酸化位點和cAMP和cGMP依賴蛋白激酶磷酸化位點。同時，N-端糖基化位點與物質轉運和蛋白定位粘附密切相關[11]，N-端肉豆蔻酰化位點也參與蛋白的定位過程[12]；對隱孢子蟲的CDPKs研究發現，其具有N-端糖基化位點和N-端肉豆蔻?；稽c。同時CDPKs均具有EF-hand結構域，其能與Ca2+結合從而促使CDPKs的構象改變，從而發揮Ca2+依賴蛋白激酶蛋白的各種功能[13]。本研究對CDPKs的抗原表位預測發現，均具有20多個，可能成為抗隱孢子蟲感染疫苗的有效成分之一。因此，對CDPKs的理化性質、二級結構和功能位點的預測和分析，在該蛋白功能的進一步研究具有重要意義。

4結論

本研究通過生物信息學方法分析了三種隱孢子蟲的CDPKs的基本性質，蛋白翻譯后的修飾和結構特征性序列，及其亞細胞定位、抗原表位和二級結構等特征；此外，通過遺傳關系比較分析，三種隱孢子蟲的CDPKs均與弓形蟲的聚在一起，可借鑒弓形蟲的相關成果來研究隱孢子蟲的CDPKs。研究發現，在瘧原蟲(Plasmodiumreichenowi)、巴貝斯蟲(Babesiabovis)、球蟲(Eimeriatenella)等頂復門原蟲中都存在CDPKs蛋白，同時，該蛋白與蟲體對宿主細胞的粘附和入侵及其生長發育密切相關。因此，CDPKs基因有望成為研制隱孢子蟲基因工程疫苗的候選基因以及抗隱孢子蟲的潛在藥物靶點。

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Function analysis of Calcium-dependent protein kinases inCryptosporidiumbased on bioinformatics

ZHANG Xueyong1，2, JIAN Yingna1，2, MA Liqing1，2*

(1.TheAcademyofAnimalandVeterinarySciences,QinghaiUniversity,Xining810016,China;2.QinghaiAcademyofAnimalSciencesandVeterinaryMedicine,Xining810016,China)

Abstract：The propose of this study is to conduct bioinformatics analysis about the calcium-dependent protein kinases of Cryptosporidium(C.parvum Iowa II,C.hominis TU502 and C.muris RN66),and to explore the structures and predict the functions of the protein family for the studies of genetic function of Cryptosporidium offering theoretical basis. The protein sequences of Cryptosporidium CDPKs were obtained from the Genome Database and then the bioinformatics softwares were used to analyze and predict the physico-chemical properties of the proteins, such as post-translational modification sites, functional domains, subcellular localization, secondary structure, hydrophilicity/hydrophobicity and epitopes.The proteins had unstable physico-chemical characteristics. The theoretical molecular weight of the deduced proteins were from 59.76 to 59.76 kDa, theoretical pI from 5.33 to 6.09,no transmembrane regions and signal peptides, all had N-glycosylation sites, protein kinase C phosphorylation sites, casein kinase II phosphorylation sites, Tyrosine kinase phosphorylation sites,N-myristoylation sites,cAMP-and cGMP-dependent protein kinase phosphorylation sites and EF-hand calcium-binding domains; Secondary structure mainly were alpha helix and random coil;CDPKs mainly exist in body cells,had more than 20 potential antigen epitopes.In Cryptosporidium,CDPKs were able to work alone, but also through mutual supports exert biological effects,meanwhile CDPKs will promise to be vaccine candidates and potential drug targets.

Keywords：Cryptosporidium；Calcium-dependent protein kinases；Bioinformatics；Protein structure；Function prediction

收稿日期：2016-03-06；修回日期：2016-04-15.

基金項目：國家外專局“外專千人計劃”專項基金項目(No.WQ20136300172)。

作者簡介：張學勇，男，執業獸醫師，碩士，研究方向：動物疫病的診斷和防治；E-mail：zhang_xyong@163.com. *通信作者：馬利青，男，研究員，研究方向：動物疫病的診斷和防治；E-mail：maliq67@hotmail.com.

doi:10.3969/j.issn.1672-5565.2016.02.03

中圖分類號：Q51

文獻標志碼：A

文章編號：1672-5565(2016)02-078-06