降鈣素基因相關肽通過抑制Nod樣受體蛋白3表達促進小鼠成骨細胞分化的研究

蔡俊 呂俊 李適庭 高強國 張綱

第三軍醫大學附屬新橋醫院口腔頜面外科，重慶 400037

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降鈣素基因相關肽通過抑制Nod樣受體蛋白3表達促進小鼠成骨細胞分化的研究

蔡俊 呂俊 李適庭 高強國 張綱

第三軍醫大學附屬新橋醫院口腔頜面外科，重慶 400037

［摘要］目的 研究降鈣素基因相關肽（CGRP）作用下相關炎癥體和信號因子的表達變化，探討CGRP對成骨細胞分化的作用機制。方法 將不同濃度的CGRP（0、10、30、100 ng·mL-1）加入到成骨細胞中，采用實時聚合酶鏈反應技術檢測細胞內Nod樣受體蛋白3（NLRP3）及白細胞介素-1β（IL-1β）mRNA的表達水平，蛋白質印跡法檢測NLRP3的蛋白表達，酶聯免疫吸附測定檢測IL-1β的蛋白表達，流式細胞儀檢測細胞內活性氧（ROS）含量，茜素紅染色顯示成骨細胞分化情況。結果 隨著CGRP濃度的增加，NLRP3和IL-1β的蛋白表達及mRNA表達均呈降低趨勢（P＜0.05），而且細胞內ROS濃度逐漸下降（P＜0.05）。100 ng·mL-1CGRP實驗組較0 ng·mL-1CGRP對照組顯著促進成骨細胞分化。結論 CGRP在一定條件下，可通過抑制細胞內炎癥因子的表達促進成骨細胞分化。

［關鍵詞］降鈣素基因相關肽； Nod樣受體蛋白3； 白介素1-β； 活性氧； 成骨細胞

骨折愈合過程中炎癥細胞分泌的大量細胞因子刺激成纖維細胞增殖分化、膠原蛋白及血管生成［1］。如果白細胞介素-1β（interleukin-1β，IL-1β）等促炎因子未能得到抑制而過度表達，則會使炎癥期延長，從而影響骨折愈合［2］。通過調控IL-1β的表達，降低炎癥反應，可達到調控骨愈合的速度。

降鈣素基因相關肽（calcitonin gene-related peptide，CGRP）作為一種肽類神經遞質，可以調節頜骨的生長、發育、修復及改建過程［3］。CGRP主要由感覺神經纖維分泌，成骨細胞自身也能分泌少量的CGRP［4］。研究［5-6］證實，CGRP可調控機體炎癥反應及IL-1β的表達，其相關機制為CGRP直接作用于巨噬細胞和樹突細胞，抑制這些細胞產生炎性細胞因子和抗原呈遞細胞。在免疫細胞中，Nod樣受體蛋白3（Nod-like receptor protein 3，NLRP3）的活化能激活中游分子半胱氨酸天冬氨酸蛋白酶（caspase）-1，繼而誘導下游分子IL-1β的加工與釋放［7］。成熟的IL-1β既可活化T細胞，又可激活核轉錄因子（nuclear factor kappa B，NF-κB）和促分裂原活化蛋白激酶（mitogen-activated protein kinase，MAPK）等信號通路，啟動先天性免疫應答清除病原體。細胞內活性氧（reactive oxygen species，ROS）是NLRP3活化的一個關鍵因子［8］。CGRP是否可以通過抑制成骨細胞內ROS的水平，從而抑制NLRP3的表達和減少IL-1β的釋放，達到促進成骨分化的作用呢？本研究以NLRP3、ROS、IL-1β為研究對象，通過觀察CGRP作用下相關炎癥體和信號因子的表達變化，探討CGRP對成骨細胞分化的作用和可能的調控機制，為骨創傷修復重建提供新的研究思路和途徑。

1 材料和方法

1.1 主要試劑與儀器

DMEM高糖培養基、0.1%Ⅱ型膠原酶、青鏈霉素混合液、胎牛血清（Gibco公司，美國），0.25%胰蛋白酶（Hyclone公司，美國），CGRP（Sigma公司，美國），RNAiso Plus、實時聚合酶鏈反應（Realtime polymerase chain reaction，Real-time PCR）試劑盒［寶生物工程（大連）有限公司］，BCA蛋白濃度測定試劑盒、辣根酶標記山羊抗兔IgG抗體、ROS檢測試劑盒（上海碧云天生物技術有限公司），兔抗鼠NLRP3 IgG抗體（Santa Cruz公司，美國），小鼠IL-1β酶聯免疫吸附測定（enzyme-linked immunosorbent assay，ELISA）檢測試劑盒（eBioscience公司，美國），SW-CJ-2FD潔凈工作臺（蘇州蘇潔凈化設備有限公司），3111水套式CO2培養箱、NanoDrop2000超微量分光光度計、Varioskan F酶標儀（Thermo公司，美國），ViiA7DX高產率熒光定量PCR儀（ABI公司，新加坡），Image quant Las 4000數字成像系統（GE公司，美國），MoFlo XDF流式細胞儀（Beckman公司，美國）。

1.2 小鼠原代成骨細胞培養與鑒定

取新生BABL/c小鼠10只（第三軍醫大學附屬新橋醫院實驗動物中心），拉尾處死后，無菌條件下取其顱骨，刮除骨膜及周圍結締組織，PBS液沖洗2次后將骨片剪成1 mm×1 mm大小，用0.25%胰蛋白酶消化20 min，0.1%Ⅱ型膠原酶于37 ℃ CO2孵箱消化60 min，離心后去除上清液，加入細胞培養液（90 mL DMEM高糖培養基+10 mL胎牛血清+2 mL青鏈霉素混合液）吹打成細胞懸液后，將細胞懸液連同骨塊移入50 mL細胞培養瓶中，在5%CO2、37 ℃培養箱中培養， 24 h后換液1次，之后每2 d換液1次，鏡下觀察其生長至80%時傳代，并用差數貼壁法提純細胞。取提純后的第3代細胞行下一步實驗并行堿性磷酸酶（alkaline phosphatase，ALP）與茜素紅染色鑒定。

1.3 細胞分組

將細胞按每孔5×105個的密度接種于6孔板中，分為4組，24 h后分別加入不同濃度的CGRP，A組（對照組）0 ng·mL1、B組10 ng·mL-1、C組30 ng·mL-1、D 組100 ng·mL-1。3 d后提取RNA、蛋白以及取細胞培養液行下一步實驗。

1.4 IL-1β、NLRP3 mRNA的檢測

利用Real-time PCR法檢測細胞內IL-1β、NLRP3 mRNA的表達水平。將各組細胞去除培養基后，PBS清洗3次，加入RNAiso Plus提取細胞內總RNA，經NanoDrop2000超微量分光光度計測得各組RNA濃度（A260/A280為1.8～2.0）。按照反轉錄試劑盒說明，將2 μg RNA反轉錄cDNA，于-80 ℃冰箱保存，備用。根據GenBank數據庫，用Primer 5.0設計GAPDH （內參照）、IL-1β、NLRP3的引物，引物由生工生物工程（上海）股份有限公司合成。 各引物的具體序列如下。GAPDH擴增產物序列，正向：5’-ATGGCCTTCCGTGTTCCTAC-3’，反向：5’-CACCTTCTTGATGTCATCATACTTG-3’。IL-1β擴增產物序列，正向：5’-TGTGAGAAGCAGGTTCTACTCT-3’，反向：5’- GGATGCTCCTTGACCAGTTGG-3’。NLRP3擴增產物序列，正向：5’- CTCACAAGCAGAGCACAAGC-3’，反向：5’-CAGTCCAGCCCATACTTTAGG-3’。PCR反應體系（總體積25 μL）包括：2× SYBR Premix ExTaqTMⅡ12.5 μL，10 μmol·L上、下游引物各1 μL，cDNA 2 μL，雙蒸水8.5 μL。PCR反應條件：95 ℃預變性30 s；95 ℃變性5 s，60 ℃退火延伸34 s，共40個循環。每一樣品做3個復孔，取其平均值。反應結束后，根據溶解曲線判斷擴增產物的特異性；以 GAPDH為內參基因，采用相對定量法（2-ΔΔCt）計算GAPDH、IL-1β、NLRP3的表達情況，實驗重復3次。

1.5 蛋白質印跡法（Western blot）檢測NLRP3的蛋白表達

提取各組細胞內蛋白，BCA法測定蛋白濃度，十二烷基硫酸鈉聚丙烯酰胺凝膠電泳（sodium dodecyl sulfate polyacrylamide gel electropheresis，SDS-PAGE）電泳，將蛋白轉移至PVDF膜上，用含6%脫脂奶粉的1×TBST溶液封閉。加入兔抗小鼠NLRP3（一抗），洗滌后加入辣根酶標記山羊抗兔IgG抗體（二抗）。用電化學發光法（electrochemiluminescence，ECL）檢測目的條帶，顯影、定影，Image quant Las4000數字成像系統采集影像，以β-肌動蛋白（β-actin）為內參進行分析。

1.6 ELISA檢測IL-1β的蛋白表達

取各組細胞培養液放置于1.5 mL離心管中，立即檢測或-20 ℃冷凍保存。嚴格按照小鼠IL-1β ELISA檢測試劑盒說明書操作，每個樣品均設3個復孔。反應終止后用酶標儀檢測450 nm處的吸光度（A450）。根據標準品濃度和A值做標準曲線，計算各組樣本A值對應的濃度值。

1.7 流式細胞儀檢測ROS含量

取各組細胞并新增一組空白細胞，去除培養基后，PBS清洗3遍，胰蛋白酶消化后加入培養基移入10 mL離心管中，離心處理后按ROS檢測試劑盒說明書操作，其中空白細胞組不加入檢測試劑。流式細胞儀檢測各組細胞內2’，7’-二氯二氫熒光素二乙酯（2’，7’-dichlorofluorescin，DCF）的熒光量從而得出ROS水平。

1.8 茜素紅染色檢測成骨細胞分化

將第3代成骨細胞計數后接種到96孔板（細胞數為每孔5 000個），分為2組，每組20孔。其中對照組只加入成骨誘導液，實驗組除加入成骨誘導液外，還加入100 ng·mL CGRP，每3天換液一次。處理14 d后行茜素紅染色，倒置顯微鏡下觀察礦化結節，評估成骨細胞分化情況。

1.9 統計學分析

采用SPSS 17.0軟件進行統計分析，對數據進行one-way ANOVA檢驗和配對t檢驗。

2 結果

2.1 原代成骨細胞的培養和鑒定

取小鼠顱骨經二次酶消化后常規培養2周，ALP染色陽性（圖1左），茜素紅染色可見礦化結節形成（圖1右）。

2.2 NLRP3、IL-1β mRNA的表達

NLRP3、IL-1β mRNA的表達見表1。1）與A組比較，隨著CGRP加入濃度的增加，NLRP3 mRNA相對表達量逐漸降低，各組與A組的差異均有統計學意義（P＜0.05）；與B組相比，C組和D組的表達下降明顯，具有統計學差異（P＜0.05）；D組的表達明顯低于C組，具有統計學差異（P＜0.05）。2）IL-1β mRNA的表達隨著CGRP加入濃度的增加，也呈逐漸降低的趨勢。C組和D組降低明顯，與A組有統計學差異（P＜0.05），B組與A組相比無統計學差異（P＞0.05）；與B組相比，C組和D組的表達下降明顯，具有統計學差異（P＜0.05）；D組的表達明顯低于C組，具有統計學差異（P＜0.05）。

圖 1 成骨細胞的鑒定Fig 1 The identification of osteoblast

表 1 NLRP3、IL-1β mRNA的表達Tab 1 The mRNA expressions of NLRP3 and IL-1β

2.3 NLRP3的蛋白表達

各組成骨細胞中NLRP3的蛋白表達見圖2。隨著CGRP加入濃度的增加，NLRP3的蛋白表達降低，在100 ng·mL-1時其降低最為明顯。

圖 2 各組成骨細胞中NLRP3的蛋白表達Fig 2 The protein expression of NLRP3 in osteoblasts of each group

2.4 IL-1β的蛋白表達

ELISA檢測A、B、C、D組IL-1β的蛋白表達分別為（629.36±11.20）、（381.90±7.12）、（287.22± 6.38）、（187.41±9.37）pg·mL-1。與A組相比，隨著CGRP加入濃度的增加，IL-1 β蛋白表達呈降低趨勢，差異具有統計學意義（P＜0.01）；B、C、D組之間的IL-1 β蛋白表達差異亦有統計學意義（P＜0.01）。

2.5 細胞內ROS的水平

A、B、C、D組的熒光強度分別為33.47±2.58、20.67±0.47、18.13±0.60、14.83±1.89。B、C、D組與A組比較，熒光強度明顯降低，具有統計學差異（P＜0.05）；D組與B、C組比較，熒光強度均明顯降低，具有統計學差異（P＜0.05）。說明隨著CGRP加入濃度增加，細胞內ROS濃度呈下降趨勢。

2.6 成骨細胞的分化

與對照組相比，實驗組成骨細胞經誘導后，其礦化結節明顯增多（圖3）。說明實驗組較對照組顯著促進了成骨細胞分化。

圖 3 成骨細胞的礦化誘導 茜素紅染色 × 40Fig 3 The mineralization induction of osteoblasts alizarin red stain × 40

3 討論

骨折的愈合是一個復雜的病理和生理過程，包括局部炎癥反應、細胞遷移、血管生成和骨痂改建等。在骨折發生時，骨髓中的間充質干細胞遷移至損傷部位，并在細胞外基質和各種細胞因子的刺激下發育分化成為成骨細胞，繼而分化成熟形成骨細胞。在血腫形成36 h后，IL-10、轉化生長因子β （transforming growth factor-β，TGF-β）等抗炎細胞因子起主導作用，控制和消除組織炎性反應，并促進炎性反應期向細胞增殖期的轉變［9］。如果此時期內IL-1β、腫瘤壞死因子-α（tumor necrosis factor-α，TNF-α）等促炎性細胞因子過表達或者促炎性細胞因子/抗炎性細胞因子表達失衡，將導致炎性反應期延長，最終導致骨折愈合延遲甚至骨不連［10］。與無骨折人群相比，骨折后患者24 h血漿內CGRP水平明顯升高，提示外傷后CGRP參與了骨折早期的炎癥過程［11］。研究表明，CGRP與IL-1β之間存在密切聯系，作為先天性免疫的負調節因子，CGRP可以抑制單核吞噬細胞和樹突細胞產生TNF-α和IL-1β［12］。本實驗通過測定CGRP作用下IL-1β、NLRP3基因與蛋白的表達，來確定CGRP對于成骨細胞是否具有抑制其分泌IL-1β的作用。

炎性復合體參與IL-1β的生成。NLRP3是一個感官病原體和危險信號的多蛋白復合物，其為一種存在于細胞內相對分子質量約為700 000的多蛋白復合體，主要由接頭蛋白（凋亡相關點樣蛋白）、caspase-1、NAIP3和Cardinal蛋白構成。NLRP3是目前研究最廣泛的NLR家族成員，其被過度激活時，可通過活化的caspase-1持續地將pro-IL-1β和pro-IL-18剪切為成熟的IL-1β和IL-18，進而激活下游信號轉導通路，產生大量炎性介質，引起機體發生嚴重的炎癥反應。ROS作為NLRP3的關鍵活化因子，可促進Ca2+的流動，并上調IL-1β［13］。線粒體可以通過自噬來下調ROS濃度，而Ca2+的流動又是線粒體功能失調和NLRP3活性下降的原因［14-15］。

在NLRP3與腫瘤發生的研究中發現，NLRP3可操縱細胞自主水平來消除惡性前體細胞，實現腫瘤細胞程序性死亡，NLRP3被激活后引起炎癥級聯反應，IL-1β、IL-18、IL-22和TNF-α等細胞因子大量釋放，激活下游的NF-κB信號通路，促進腫瘤細胞生長和紅細胞營養物質生成，導致組織損傷及腫瘤發生［16］。此研究結果啟示，對同樣處于創傷早期的炎性環境中的成骨細胞，NLRP3的激活和抑制對成骨細胞的分化將會有什么樣的影響？是否可通過調控NLRP3的表達從而有利于骨創傷的愈合呢？筆者按此思路設計了本實驗，結果表明成骨細胞中NLRP3表達受到抑制后其分化能力是增強的。嚴重的骨丟失和骨折延遲愈合被認為與局部環境中長期分泌IL-1β有關。IL-1β能顯著減少成骨細胞向趨化因子血小板源性生長因子-BB和胰島素樣生長因子1的定向與非定向遷移。IL-1β的存在可能會影響骨折愈合早期階段招募成骨細胞［17］。本研究結果表明，在CGRP作用下，成骨細胞內ROS水平降低，NLRP3和IL-1β的表達減少，而成骨細胞分化增強。這表明CGRP可能是通過抑制細胞內炎癥因子的表達進而促進成骨細胞的分化。

本實驗表明，CGRP在成骨細胞分化為骨細胞中具有抑制炎癥因子表達的作用，為今后進一步研究該神經遞質在骨創傷中的作用開辟了新的思路，但尚需要研究CGRP通過NLRP3調控其他炎癥因子以及成骨細胞分化的機制。

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（本文編輯 李彩）

［中圖分類號］Q 254

［文獻標志碼］A ［doi］ 10.7518/hxkq.2016.01.003

［收稿日期］2015-08-25； ［修回日期］ 2015-11-18

［基金項目］國家自然科學基金（81277098）

［作者簡介］蔡俊，住院醫師，碩士，E-mail：66977045@qq.com

［通信作者］張綱，副教授，博士，E-mail：xqyykqk@163.com

Calcitonin gene-related peptide inhibits the expression of Nod-like receptor protein 3 to promote osteoblast differen-tiation in mouse osteoblasts in vitro

Cai Jun， Lü Jun， Li Shiting， Gao Qiangguo， Zhang Gang.
（Dept. of Oral and Maxillofacial Surgery， Xinqiao Hospital， The Third Military Medical University， Chongqing 400037， China）

Supported by: The National Natural Science Foundation of China （81277098）. Correspondence: Zhang Gang， E-mail: xqyykqk @163.com.

［Abstract］Objective This study aims to investigate the regulatory effects of calcitonin gene-related peptide （CGRP） on Nod-like receptor protein 3 （NLRP3） and interleukin-1β （IL-1β） to promote osteoblast differentiation. Methods Different concentrations of CGRP （0， 10， 30， 100 ng·mL-1） were added to mouse osteoblasts in vitro. The mRNA and protein expression levels of both NLRP3 and IL-1β were examined using Real-time polymerase chain reaction and Western blot， respectively. Moreover， the concentrations of IL-1β protein and intracellular reactive oxygen species （ROS） were detected using enzyme-linked immunosorbent assay and flow cytometry， respectively. The osteogenic differentiation of mouse osteoblasts was identified through alizarin red staining. Results The protein and mRNA expression levels of both NLRP3 and IL-1β significantly decreased （P＜0.05） with increasing CGRP concentration. Moreover， the contents of intracellular ROS gradually decreased （P＜0.05）. The osteogenic differentiation of the osteoblasts was more enhanced in the group treated with 100 ng·mL-1CGRP than in the empty group （0 ng·mL-1CGRP）. Conclusion CGRP promotes osteoblast differentiation by inhibiting the expression of inflammatory factors.

［Key words］calcitonin gene-related peptide； Nod-like receptor protein 3； interleukin-1β； reactive oxygen species；osteoblast