實(shí)時(shí)熒光PCR法快速檢測地中海實(shí)蠅的研究

李京，張祥林，羅明，李亞偉，王翀中， 張小菊

(1新疆農(nóng)業(yè)大學(xué)農(nóng)學(xué)院，烏魯木齊　830052；2新疆出入境檢驗(yàn)檢疫局，烏魯木齊　830063)

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實(shí)時(shí)熒光PCR法快速檢測地中海實(shí)蠅的研究

李京1,2，張祥林2，羅明1，李亞偉2，王翀中2， 張小菊2

(1新疆農(nóng)業(yè)大學(xué)農(nóng)學(xué)院，烏魯木齊830052；2新疆出入境檢驗(yàn)檢疫局，烏魯木齊830063)

摘要：【目的】設(shè)計(jì)用于擴(kuò)增地中海實(shí)蠅的特異性引物，建立快速、靈敏檢測地中海實(shí)蠅的實(shí)時(shí)熒光PCR方法。【方法】采用實(shí)蠅科昆蟲線粒體DNA COI基因的通用引物擴(kuò)增地中海實(shí)蠅以及其它三種供試實(shí)蠅的DNA片段，經(jīng)測序、比對分析，設(shè)計(jì)出擴(kuò)增地中海實(shí)蠅的特異性引物，用SYBR Green 實(shí)時(shí)熒光PCR方法驗(yàn)證該引物的特異性與靈敏度。【結(jié)果】設(shè)計(jì)的引物對DZH-F/DZH-R能特異性檢測出地中海實(shí)蠅，擴(kuò)增產(chǎn)物的溶解曲線峰值Tm為79.2。該對引物檢測地中海實(shí)蠅的靈敏度為10-3ng/μL。【結(jié)論】所建立的SYBR Green 實(shí)時(shí)熒光PCR方法檢測地中海實(shí)蠅特異性強(qiáng)、靈敏度高。

關(guān)鍵詞：地中海實(shí)蠅；COI基因；實(shí)時(shí)熒光PCR；快速檢測

0引 言

【研究意義】實(shí)蠅科(Tephritidae)是雙翅目(Diptera)昆蟲中的重要類群，全球有40余種實(shí)蠅是為害農(nóng)作物的檢疫性害蟲，其中果實(shí)蠅屬(Ceratitis)是最具經(jīng)濟(jì)重要性的實(shí)蠅類群[1]。許多實(shí)蠅種類對多種果實(shí)造成巨大危害，如橘小實(shí)蠅 (B.dorsalis)能夠危害芒果、番石榴、楊桃等250余種水果，果實(shí)受蟲害后，可造成落果或果實(shí)失去經(jīng)濟(jì)價(jià)值；瓜實(shí)蠅(B.cucurbitae)對果蔬的危害范圍也達(dá)到80余種，并且主要對葫蘆科植物危害較嚴(yán)重；棗實(shí)蠅(C.vesuviana)雖然寄主較為單一，但其對棗果危害十分嚴(yán)重，該蟲2007年在我國新疆地區(qū)首次發(fā)現(xiàn)，對當(dāng)?shù)貤棶a(chǎn)業(yè)造成了巨大的經(jīng)濟(jì)損失。地中海實(shí)蠅(C.capitata)是世界性果蔬害蟲，在全世界 80 多個(gè)國家和地區(qū)有分布，由于地中海實(shí)蠅經(jīng)濟(jì)意義十分巨大，被各國公認(rèn)為“果蔬頭號殺手”[2-5]。1929年，美國佛羅里達(dá)州首次發(fā)現(xiàn)了地中海實(shí)蠅，此次造成了700多萬美元的經(jīng)濟(jì)損失，此后在該州陸續(xù)發(fā)生了多次，所造成的經(jīng)濟(jì)損失難以估計(jì)[6]。近年來，新疆檢驗(yàn)檢疫局在新疆多個(gè)地區(qū)分別監(jiān)測到棗實(shí)蠅、瓜實(shí)蠅和橘小實(shí)蠅，但尚未發(fā)現(xiàn)地中海實(shí)蠅傳入我區(qū)。隨著絲綢之路經(jīng)濟(jì)帶核心區(qū)的建設(shè)與發(fā)展，新疆同周邊國家的農(nóng)產(chǎn)品貿(mào)易量逐年增加，地中海實(shí)蠅的傳入風(fēng)險(xiǎn)也相對增加，同時(shí)由于地中海實(shí)蠅具有寄主多且繁殖能力超強(qiáng)的特點(diǎn)，其在新疆的傳播概率也因此相對增大。新疆是我國的水果、蔬菜種植大省，一旦地中海實(shí)蠅傳入造成的經(jīng)濟(jì)損失將難以估計(jì)。因此研究建立能夠快速檢測出地中海實(shí)蠅的分子生物學(xué)方法意義重大。【前人進(jìn)展】吳佳教等[7](2005)從實(shí)蠅線粒體DNA(mtDNA)COII基因序列中篩選出特異性引物，并用PCR-RFLP法和限制性內(nèi)切酶MSEI、DRAI成功將9種檢疫性實(shí)蠅區(qū)分開[6]；朱振華等[8](2005)研究表明mtDNA Cytb基因也可以作為鑒別實(shí)蠅的方法[7]；余道堅(jiān)[9](2005)應(yīng)用SS-PCR、TaqMan MGB探針實(shí)時(shí)熒光PCR等方法將10種檢疫性實(shí)蠅(地中海實(shí)蠅、桔小實(shí)蠅、瓜實(shí)蠅、南瓜實(shí)蠅、番石榴實(shí)蠅、木瓜實(shí)蠅、菲律賓實(shí)蠅、芒果實(shí)蠅、楊桃實(shí)蠅、辣椒實(shí)蠅)區(qū)分開；程曉甜等[10](2013)對于線粒體DNA(mtDNA)COI基因，采用SS-PCR、SYBR Green實(shí)時(shí)熒光PCR等方法從設(shè)計(jì)的一對引物中篩選出檢測棗實(shí)蠅的特異性引物，成功將棗實(shí)蠅與其他5種實(shí)蠅區(qū)分開(桔小實(shí)蠅、瓜實(shí)蠅、南瓜實(shí)蠅、番石榴實(shí)蠅、桃果實(shí)蠅)[10]；姜帆等[11](2015)用SS-PCR、TaqMan MGB探針實(shí)時(shí)熒光PCR方法對27種檢疫性實(shí)蠅線粒體DNA(mtDNA)COI基因的比對設(shè)計(jì)出了27對特異性引物并篩選出TaqMan MGB探針，成功將27種實(shí)蠅一一區(qū)分開。【本研究切入點(diǎn)】由于mtDNA被看作檢測物種進(jìn)化的較為重要的分子標(biāo)記方法[12-13]，因此研究以四種實(shí)蠅的DNA為模板、運(yùn)用COI引物擴(kuò)增出目的片段，經(jīng)測序后運(yùn)用生物信息學(xué)分析四種實(shí)蠅COI序列，設(shè)計(jì)出一對特異性引物，用SYBR Green實(shí)時(shí)熒光PCR方法特異性檢測地中海實(shí)蠅。【擬解決的關(guān)鍵問題】指導(dǎo)口岸檢驗(yàn)檢疫局從口岸疫情截獲或在出口注冊果園監(jiān)測點(diǎn)，誘捕到的實(shí)蠅樣品中快速檢測，并確定有無地中海實(shí)蠅。

1材料與方法

1.1 材 料

地中海實(shí)蠅成蟲樣品由廣東出入境檢驗(yàn)檢疫局和中國檢驗(yàn)檢疫科學(xué)研究院提供，橘小實(shí)蠅、瓜實(shí)蠅和棗實(shí)蠅的成蟲樣品來源于新疆出入境檢驗(yàn)檢疫局近幾年在當(dāng)?shù)卣T捕到的樣品。供試實(shí)蠅標(biāo)本均用100%酒精浸泡。表1

1.2方 法

1.2.1基因組DNA提取

無菌操作條件下，用磁珠法基因組提取試劑盒(天根DP329)提取供試實(shí)蠅樣品DNA，-20℃保存?zhèn)溆谩?/p>

表1　供試實(shí)蠅及來源

1.2.2目的片段DNA擴(kuò)增

用mtDNA COI基因通用引物COI-F/ COI-R擴(kuò)增4種供試實(shí)蠅，該引物序列為：COI-F：5'-GGTCAACAAATCATAAAGATATTGG-3'，COI-R：5'-TAAACT TCAGGGTGACCAAAAAATCA-3’ 。PCR反應(yīng)體系：DNA模板1 μL，2×Mix預(yù)混液12.5 μL，上游引物COI-F 0.5 μL，下游引物COI-R 0.5 μL，加水至25 μL。PCR反應(yīng)程序：94℃/3 min；94℃/30s，53℃/30s，72℃/1 min，共36 個(gè)循環(huán)；最后 72℃延伸 7 min。取 PCR 產(chǎn)物 5 μL在1.5%瓊脂糖凝膠上電泳 30 min(90V)，置于凝膠成像分析系統(tǒng)進(jìn)行觀察照相，取20 μL PCR產(chǎn)物送生物技術(shù)公司測序。

1.2.3設(shè)計(jì)特異性引物

用DNAMAN8.0及GENEDOC法將該實(shí)驗(yàn)測序得到的地中海實(shí)蠅的mtDNA COI基因序列(已在Genbank獲得序列號：KU096056)為靶序列，與本實(shí)驗(yàn)測序得到的桔小實(shí)蠅(已獲得Genbank序列號：KU131575)、瓜實(shí)蠅(已獲得Genbank 序列號：KU096057)和棗實(shí)蠅(已獲得Genbank 序列號：KU131576)，以及在Genbank中下載的南瓜實(shí)蠅Bactroceratau(序列號：AY398753)、油欖實(shí)蠅Bactroceraoleae(序列號：AY210702)、辣椒實(shí)蠅Bactroceralatifrons(序列號：AF423103)等COI基因序列進(jìn)行比對分析。根據(jù)分析結(jié)果，采用Primer Permier 5.0軟件設(shè)計(jì)檢測地中海實(shí)蠅的特異性引物對DZH-F/DZH-R，送至生物技術(shù)公司合成。

1.2.4SYBR Green 實(shí)時(shí)熒光PCR檢測

1.2.4.1DZH-F/DZH-R引物的特異性驗(yàn)證

用實(shí)時(shí)熒光PCR儀(ABI QuantStudioTM7 Flex Real-Time PCR system)進(jìn)行SYBR Green PCR擴(kuò)增。反應(yīng)條件：SYBRPremixExTaqTM(2×)10 μL，上下游引物(10 μM)各0.4 μL，ROX Reference Dye(50×)0.4 μL，DNA模板2 μL，dH2O補(bǔ)至20 μL。反應(yīng)程序：第一步：95℃/30s；第二步(擴(kuò)增曲線)：95℃/5s，60℃/30s,共40個(gè)循環(huán)；第三步(溶解曲線)：95℃/15s，60℃/1 min，95℃/15s。用桔小實(shí)蠅、瓜實(shí)蠅、棗實(shí)蠅來驗(yàn)證引物DZH-F/DZH-R的特異性。

1.2.4.2引物DZH-F/DZH-R的靈敏度檢測

將模板的DNA進(jìn)行倍比稀釋，共設(shè)置7個(gè)濃度梯度，分別為：20、10、1、10-1、10-2、10-3和、10-4ng/μL，用以檢測該引物的靈敏度，PCR反應(yīng)條件及反應(yīng)程序同上。

2結(jié)果與分析

2.1通用引物COI-F/ COI-R擴(kuò)增結(jié)果

用通用引物COI-F/ COI-R擴(kuò)增供試地中海實(shí)蠅、桔小實(shí)蠅、瓜實(shí)蠅和棗實(shí)蠅，擴(kuò)增產(chǎn)物電泳結(jié)果表明：4種實(shí)蠅均有泳帶，大小均為670 bp。圖1

2.2引物DZH-F/DZH-R特異性驗(yàn)證結(jié)果

用所設(shè)計(jì)的特異性引物DZH-F/DZH-R對4種供試實(shí)蠅進(jìn)行SYBR Green 實(shí)時(shí)熒光PCR擴(kuò)增，結(jié)果表明，僅地中海實(shí)蠅有擴(kuò)增曲線，其Ct值為15.2，其它3種實(shí)蠅未出現(xiàn)擴(kuò)增曲線。圖2

實(shí)時(shí)熒光PCR擴(kuò)增產(chǎn)物的溶解曲線結(jié)果顯示，4種供試實(shí)蠅中僅地中海實(shí)蠅有產(chǎn)物峰出現(xiàn)，其Tm=79.2。圖3

M:DL2000 Marker；1～2：地中海實(shí)蠅；3：桔小實(shí)蠅；4：瓜實(shí)蠅；5：棗實(shí)蠅；6：空白

2.3引物DZH-F/DZH-R靈敏度檢測結(jié)果

將提取的地中海實(shí)蠅DNA倍比稀釋成7個(gè)濃度梯度：20、10、1、10-1、10-2、10-3和L、10-4ng/μL，進(jìn)行SYBR Green 實(shí)時(shí)熒光PCR擴(kuò)增。結(jié)果顯示，當(dāng)?shù)刂泻?shí)蠅DNA濃度為10-3ng/μL 時(shí)，該引物仍能檢測到(Ct>35時(shí)，其擴(kuò)增視為陰性)，不同濃度的DNA平均Ct值分別是：18.8(20 ng/μL)、22.7(10 ng/μL)、26.2(1 ng/μL)、29.4(10-1ng/μL)、32.6(10-2ng/μL)、35.0(10-3ng/μL)、38.2(10-4ng/μL)。圖4

此外，不同濃度的DNA所擴(kuò)增產(chǎn)物的溶解曲線峰值相同(Tm=79.2)。圖5

1～2: 地中海實(shí)蠅的擴(kuò)增曲線；3～5: 其它實(shí)蠅的擴(kuò)增曲線

1: 地中海實(shí)蠅的PCR產(chǎn)物溶解曲線；2～4: 其它實(shí)蠅的PCR產(chǎn)物溶解曲線

A-G：不同濃度的地中海實(shí)蠅DNA實(shí)時(shí)熒光PCR擴(kuò)增曲線，A:20 ng/μL; B:10 ng/μL; C:1 ng/μL; D:10-1 ng/μL;

A-C：不同濃度的地中海實(shí)蠅模板DNA SYBR Green 實(shí)時(shí)熒光PCR產(chǎn)物溶解曲線；D：空白對照

3討 論

由于新疆截獲橘小實(shí)蠅、瓜實(shí)蠅、棗實(shí)蠅的頻率較高，因此研究用該三種實(shí)蠅檢測設(shè)計(jì)的地中海實(shí)蠅的引物的特異性。盡管余道堅(jiān)[9]2005年建立了地中海實(shí)蠅快速鑒定方法，但該方法設(shè)計(jì)的引物并不能證明擴(kuò)增不出幾種常見的檢疫性實(shí)蠅，如：橘小實(shí)蠅、瓜實(shí)蠅、棗實(shí)蠅。針對四種常見的檢疫性實(shí)蠅(地中海實(shí)蠅、橘小實(shí)蠅、瓜實(shí)蠅、棗實(shí)蠅)設(shè)計(jì)出特異性檢測地中海實(shí)蠅的引物。同時(shí)，相對于2015年姜帆等[11]建立的用SS-PCR、TaqMan MGB探針實(shí)時(shí)熒光PCR方法檢測27種檢疫性實(shí)蠅線粒體DNA(mtDNA)COI基因的方法，此項(xiàng)研究依然具有一些優(yōu)勢：對于建立的SS-PCR技術(shù)，該技術(shù)的靈敏度更高，更具有可信度；相對于建立的TaqMan MGB探針技術(shù)該項(xiàng)技術(shù)更為經(jīng)濟(jì)，更為適用于大量的實(shí)蠅檢測。但相對于前兩項(xiàng)的研究，設(shè)置的對照組較少。

用SYBR Green 實(shí)時(shí)熒光PCR方法驗(yàn)證引物特異性時(shí)，雖然PCR產(chǎn)物的溶解曲線除地中海實(shí)蠅外其他兩種實(shí)蠅出現(xiàn)了微弱的峰，但SYBR Green 實(shí)時(shí)熒光PCR擴(kuò)增僅地中海實(shí)蠅有擴(kuò)增曲線出現(xiàn)，因此認(rèn)為該引物能特異性鑒定地中海實(shí)蠅。在驗(yàn)證引物的靈敏度實(shí)驗(yàn)中，當(dāng)?shù)刂泻?shí)蠅濃度為10-4ng/μL時(shí)，其擴(kuò)增曲線的Ct值為38.2，有相關(guān)文獻(xiàn)表示當(dāng)擴(kuò)增曲線的Ct值大于35時(shí)可認(rèn)為該樣品或該濃度不被擴(kuò)增[14]，因此認(rèn)為引物DZH-F/DZH-R擴(kuò)增為陰性即檢測不到10-4ng/μL濃度的地中海實(shí)蠅。

4結(jié) 論

研究比對、分析地中海實(shí)蠅、橘小實(shí)蠅、瓜實(shí)蠅、棗實(shí)蠅四種常見的檢疫性實(shí)蠅的線粒體COI基因序列，建立了一種特異性鑒定地中海實(shí)蠅的SYBR Green 實(shí)時(shí)熒光PCR方法，成功將地中海實(shí)蠅與其他三種實(shí)蠅區(qū)分開，該方法為后人的相關(guān)研究提供了可靠的依據(jù)與參考。

近年來，新疆地區(qū)已經(jīng)有橘小實(shí)蠅實(shí)蠅、瓜實(shí)蠅、棗實(shí)蠅的相關(guān)報(bào)道，但地中海實(shí)蠅還未發(fā)現(xiàn)。但隨著新疆與周邊的中亞地區(qū)的國家貿(mào)易的頻繁，比如，從哈薩克斯坦進(jìn)口芒果，在當(dāng)?shù)孛⒐幸呀?jīng)發(fā)現(xiàn)了地中海實(shí)蠅，建立地中海實(shí)蠅快速檢測方法，為口岸檢疫性害蟲的監(jiān)測與預(yù)防提供了技術(shù)支持。

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doi:10.6048/j.issn.1001-4330.2016.06.018

收稿日期(Received)：2016-01-14

基金項(xiàng)目:國家質(zhì)檢公益性行業(yè)科研項(xiàng)目(201310091)；新疆農(nóng)業(yè)大學(xué)產(chǎn)學(xué)研聯(lián)合培養(yǎng)研究生項(xiàng)目(xjaucxy-yjs-20131023)

作者簡介:李京(1990-)，女，山東人，碩士研究生，研究方向?yàn)橹参餀z疫病害，(E-mail)13579981032@163.com 通訊作者(Cotresponding author):張祥林(1964-)，男，新疆人，研究員，研究方向?yàn)榉肿又参锊±韺W(xué)，(E-mail)XL6479@163.com

中圖分類號：S412

文獻(xiàn)標(biāo)識(shí)碼：A

文章編號：1001-4330(2016)06-1107-07

Study on Rapid Detection Method of Mediterranean Fruit Fly by Real-Time PCR Assay

LI Jing1,2，ZHANG Xiang-lin2，LUO Ming1，WANG Chong2，LI Ya-wei2，ZHANG Xiao-ju2

(1.CollegeofAgronomy,XinjiangAgriculturalUniversity,Urumqi830052,China2.XinjiangEntryandExitInspectionandQuarantineBureau,Urumqi830063,China)

Abstract：【Objective】 Fruit flies (Tephritidae) described all over the world are more than 450 insect species and 4，300 kinds, there were more than 70 kinds including the Mediterranean fruit fly (Ceratitis capitate) in Xinjiang, which endanger agriculture greatly. It is of significance in plant quarantine to set up quarantine fruit fly, especially immature worm state fast and reliable identification method.【Method】Using the fruit flies general primer amplification of mitochondrial DNA COI gene to amplify targeted fragments, sequence, blast, then design specific primers which verified its specificity and sensitivity using SYBR Green real-time PCR.【Result】The primers DZH-F/DZH-R could specific amplify ceratitis capitate. The production peaks was 79.2. This primer could detect 10-3ng/μL of ceratitis capitate template DNA.【Conclusion】A assay of SYBR green real-time PCR has been established to detect the Mediterranean fruit fly, which has strong specificity and high sensitivity.

Key words:Mediterranean fruit fly; mtDNA; SYBR Green real-time PCR; rapid detection