藥用地衣長松蘿和皮果衣提取物抗魚病真菌對比實驗研究

王炳哲

研究的目的和意義

水產養殖病害的種類比較多，相關的病害防治任務就非常艱巨。目前水霉（Saprolegnia）和綿霉（Achlya）兩個屬中的一些種類常引起水產動物得病，通常稱為水霉病。水霉病流行很廣泛。在魚類的繁殖過程當中，水霉病是最為嚴重的病害。

如果能通過地衣粗提液的抑菌作用，尋找出高效、天然的抗真菌藥物，將會創造出很好的經濟效益與社會效益。本實驗選擇長松蘿和皮果衣這兩種地衣的丙酮浸提液和松蘿酸不同溶劑的溶液對幾種常見魚害真菌進行抑制的對比研究，所得的結果可為進一步研究提供參考，并為研制新的抑制病原菌藥物提供信息。

實驗方法

松蘿酸母液及地衣粗提液的制備

松蘿酸母液的制備：稱取松蘿酸20mg，加20mL的丙酮，搖勻，置于4℃冰箱，保存備用。

地衣粗提液的制備：取實驗用地衣材料，除去雜草枯枝等雜質，分別稱取2g樣品剪碎或壓碎，置于帶磨口塞子的廣口玻璃瓶中，加入30mL的丙酮，密封，搖勻，室溫浸提約5h，過濾，蒸發得20mL的地衣浸提液。置于4C保溫環境中，保存備用。以乙醇、乙酸乙酯為溶劑制備的浸提液方法同上。

菌株的分離培養及鑒定

魚病相關真菌的來源：長期放養魚類的水體、水系（岔河水系）中病魚和觀賞魚。

魚體分離：在超凈工作臺無菌環境下，用75%酒精棉球擦拭患病魚體表2～3s，用無菌水沖洗干凈，用解剖刀切取魚背部、腹部、尾部肌肉（厚度3～4 mm），用鑷子取魚鱗片，放置于PDA培養基平板中央，每個部位做5個重復。置于25℃培養箱培養，逐日觀察，直至菌絲長出后，在超凈臺取菌絲進行鏡檢，菌絲接種到PDA培養基上，置于25℃霉菌培養箱中培養，培養數天后進行純化，純化后得純菌落，4℃保藏。

蓖麻籽富集法：挑選蓖麻籽10粒，煮10min，然后5粒脫皮，5粒劃破，接著再煮5min。將處理好的餌料分別放入培養皿中，每皿放1粒蓖麻籽，倒入岔河水樣及養魚水體水樣30mL浸沒餌料，置于25℃溫箱中培養，每例水樣5個重復。培養2天后，把培養皿洗凈，用清水換取水樣，以減少其他雜菌的污染。逐日觀察，發現蓖麻籽上有菌絲長出時，將長有菌落的蓖麻籽放入75%的酒精中3～5s，迅速取出，再用無菌水沖洗3次，放入培養皿中，加30mL含100mg/L鏈霉素的自來水，置于25℃培養箱中培養，逐日鏡檢，直至菌絲長出。菌絲長出后，鏡檢，在超凈臺將菌絲接種到PDA培養基上。接種好后，置于25℃霉菌培養箱中培養，培養數天后，進行純化，反復純化后得純菌落，4C保藏。

菌株的鑒定：通過菌落形態、菌絲顯微結構等初步鑒定菌株種類。

其他檢測

除前2項檢測外，還依據文獻，做了供試地衣中松蘿酸的檢測、抑菌活性的測定和最小抑菌濃度的檢測。

數據統計與分析

對所得數據用SPSS16.0進行ANOVA分析，用Duncan法進行多重比較。

結果與分析

供試地衣中松蘿酸的檢測

對供試地衣中松蘿酸進行定性研究，檢測結果表明：TLC結果樣點顯色比較清晰，與松蘿酸對照，發現長松蘿含有松蘿酸，而皮果衣不含有松蘿酸。用微量結晶法所得結果和薄層層析法測得結果一致。

菌株的鑒定

經河北師大微生物實驗室分離、鑒定，初步確定菌株種類為：鐮刀菌Fusariumsp（菌落形態及顯微結構見圖1）、兩性綿霉Achlyabisexualis、Pythiumsp和多枝橫梗霉Lichemiaramose。

松蘿酸對真菌的抑制作用

按照文獻提到的抑菌實驗方法，制備含藥培養基，測試用乙醇、丙酮、乙酸乙酯作溶劑的松蘿酸溶液對供試菌株的抑制作用。由實驗結果可知：接種48h后以乙醇、丙酮、乙酸乙酯為溶劑的松蘿酸溶液對4種供試真菌均有一定的抑制作用。從抑制初期觀察，松蘿酸的乙醇溶液對供試菌株的抑制效果低于松蘿酸丙酮、乙酸乙酯溶液。圖2給出了不同溶劑的松蘿酸溶液對鐮刀菌生長的抑菌率。

兩種地衣粗提液對真菌的抑制作用

實驗結果表明：接種48h的平均數據測量結果，2種地衣的丙酮浸提液對供試菌株的生長初步顯示出抑制作用，低濃度菌落的直徑大于高濃度菌落的直徑。對于同一菌株不同的地衣丙酮浸提液對其抑制活性不相同。

結論

以乙醇、丙酮、乙酸乙酯為溶劑的3種松蘿酸溶液的抑菌結果表明：不同溶劑的松蘿酸溶液對供試菌株均有不同的抑菌作用，丙酮、乙酸乙酯作溶劑的抑菌效果強于乙醇溶劑。

通過2種地衣的丙酮粗提液對7種供試菌株的生長進行抑制，結果顯示：2種地衣丙酮粗提液對供試菌株的抑制作用不同，長松蘿丙酮粗提液對供試菌株的抑菌效果好，皮果衣粗提液的抑菌效果差，說明長松蘿是因為其中含有松蘿酸導致抑菌作用良好。

對供試地衣中的松蘿酸進行定性研究，采用微量結晶法和薄層層析法，這兩種方法結果顯示一致，即長松蘿含有松蘿酸，而皮果衣中不含松蘿酸。

創新點

本實驗研究了松蘿酸及2種地衣粗提液對魚病真菌的抑制作用，證明了是地衣中的松蘿酸對魚病真菌有較強抑制作用。地衣和地衣粗提物可以作為真菌抑制劑，提供了解決化學農藥殘留、開展真菌的生物防治的新材料。

地衣長松蘿粗提物對來自漁業生產的幾種常見真菌生長具有抑制的作用，且抑制作用一般隨著濃度增加而增加，對農業、漁業的進一步研究推廣提供了參考數據。同時，本實驗還發現皮果衣粗提物對部分供試菌株的生長有一定的促進作用，具體原因有待進一步的研究。

松蘿酸乙醇溶液對鐮刀菌和多枝橫梗霉有抑制作用，而松蘿酸乙醇溶液對兩性綿霉、腐霉在200mg/L、400 mg/L濃度時有促進作用；松蘿酸乙酸乙酯溶液對多枝橫梗霉抑制效果最好。

該項目獲得第30屆全國青少年科技創新大賽創新成果競賽項目中學組植物學一等獎。

專家評語

該項目用不同方法從地衣長松蘿和皮果衣中提取有效成分，發現長松蘿的提取物對導致魚病的真菌生長有抑制作用，為魚病的天然產物防治提供了參考。學生在研究中得到了訓練，研究報告書寫規范，顯示出較強的創新能力，建議進一步開展魚病防治研究。