高效液相色譜法測定血漿中霉酚酸及其代謝物分化葡萄糖醛麥草酰胺的濃度

楊春蘭，王琴，蘇涌，夏泉，廖貴益，許杜娟Δ

(1.安徽醫(yī)科大學(xué) 藥學(xué)院，安徽 合肥 230022；2.安徽醫(yī)科大學(xué)第一附屬醫(yī)院 藥劑科，國家中醫(yī)藥管理局中藥化學(xué)三級實驗室，安徽 合肥 230022；3.安徽醫(yī)科大學(xué)第一附屬醫(yī)院 泌尿外科，安徽 合肥 230022)

高效液相色譜法測定血漿中霉酚酸及其代謝物分化葡萄糖醛麥草酰胺的濃度

楊春蘭1,2，王琴1，蘇涌2，夏泉2，廖貴益3，許杜娟1Δ

(1.安徽醫(yī)科大學(xué) 藥學(xué)院，安徽 合肥 230022；2.安徽醫(yī)科大學(xué)第一附屬醫(yī)院 藥劑科，國家中醫(yī)藥管理局中藥化學(xué)三級實驗室，安徽 合肥 230022；3.安徽醫(yī)科大學(xué)第一附屬醫(yī)院 泌尿外科，安徽 合肥 230022)

目的 建立一種HPLC方法能夠同時快速測定血漿中霉酚酸(mycophenolic acid，MPA)及其代謝物分化葡萄糖醛麥草酰胺(mycophenolic acid glucuronide，MPAG)濃度。方法 血漿樣品加入卡馬西平內(nèi)標(biāo)，經(jīng)硫酸鋅甲醇沉淀蛋白前處理，以色譜柱ZORBAX XDB C18(4.6 mm×250 mm，5 μm)，流動相甲醇-乙腈-磷酸二氫鉀緩沖液梯度洗脫，流速1.0 mL/min，柱溫30 ℃，檢測波長254 nm，進(jìn)行HPLC檢測。測定32例腎移植受者術(shù)后7～14 d期間MPA、MPAG谷濃度。結(jié)果 MPA、MPAG分別在0.2～50 μg/mL，2.5～500 μg/mL范圍內(nèi)線性關(guān)系良好(r>0.999)，絕對回收率均>80%，方法回收率在90%～110%之間，日內(nèi)及日間RSD均小于10%。32例腎移植受者早期服用霉酚酸酯劑量為1～1.5 g/d，血漿中MPA范圍為0.32～6.19 μg/mL，MPAG范圍為9.52～149.25 μg/mL。結(jié)論 測定人血漿中MPA、MPAG的HPLC法具有準(zhǔn)確、方便、快速等優(yōu)點(diǎn)，可以用于腎移植受者血藥濃度監(jiān)測。

霉酚酸；分化葡萄糖醛麥草酰胺；腎移植受者；高效液相色譜法；血藥濃度

霉酚酸酯(mycophenolate mofetil ，MMF)作為免疫抑制劑霉酚酸(mycophenolic acid,MPA)的前體藥物，已廣泛應(yīng)用于臨床實體器官移植后的抗排斥反應(yīng)中。MPA重要的代謝產(chǎn)物分化葡萄糖醛麥草酰胺(mycophenolic acid glucuronide，MPAG )，可被分泌入膽汁并進(jìn)入小腸，在腸道中經(jīng)微生物的作用再次分解為MPA。約87%MPA以MPAG 的形式通過腎小管排泄[1]。目前臨床上應(yīng)用常規(guī)劑量(1～2 g/d)用于腎移植后的抗排斥反應(yīng)，但由于MPA的血藥濃度普遍存在個體差異，所以常規(guī)劑量可能會產(chǎn)生免疫抑制療效的差異，甚至導(dǎo)致不良反應(yīng)的發(fā)生。因此，臨床可通過監(jiān)測MPA 的血藥濃度，調(diào)整MMF給藥劑量，減少不良反應(yīng)的發(fā)生，達(dá)到最佳療效。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 儀器：Waters alliance高效液相色譜儀(美國Waters公司) ，配備Waters e2695 separation Module，Waters E10SMH614G柱溫箱、Waters2489UV/Visible檢測器；-80 ℃超低溫冰箱DW-HL328(中科美菱低溫科技有限責(zé)任公司)；TGL-185小型低溫離心機(jī)(長沙平凡儀器儀表有限公司)；pH計(梅特勒-托利多)；AB135-5電子天平(上海梅特勒多-托利多) ；XW-80A漩渦振蕩器(上海醫(yī)科大學(xué)儀器廠)。

1.1.2 試劑：MPA對照品(南京澤朗醫(yī)藥科技有限公司，純度≥98.0%)；MPAG 對照品(TORONTO RESEARCH CHEMICAL INC，純度≥98.0%)；卡馬西平對照品(中國藥品生物制品檢定所，批號：0142-9503)；磷酸、磷酸二氫鉀、硫酸鋅(分析純)；甲醇、乙腈(色譜級，Tedia公司)；健康人空白血漿，重蒸餾水。

1.2 方法

1.2.1 色譜條件：色譜柱ZORBAX XDB C18(4.6 mm×250 mm，5 μm)；流動相為：乙腈-甲醇-磷酸氫二鉀緩沖溶液(pH3.0)，線性梯度洗脫24:20:56起始(0 min)→34:20:40(6.5 min)；流速：1.0 mL/min，檢測波長：254 nm；進(jìn)樣量:20 μL；柱溫：30 ℃。

1.2.2 試劑的配制：精密稱取MPA對照品1 mg，用甲醇稀釋成濃度為0.2～50 μg/mL的系列標(biāo)準(zhǔn)工作液。精密稱取 MPAG對照品5 mg，用甲醇稀釋成濃度為25～5000 μg/mL的系列標(biāo)準(zhǔn)工作液。兩者均放置于4 ℃冰箱避光保存。

1.2.3 血樣預(yù)處理：取患者血漿100 μL ，加入卡馬西平(10 mg/L)內(nèi)標(biāo)10 μL，渦旋30 s ，加入10%磷酸5 μL，混勻；加入100 μL蛋白沉淀劑(32 mg/L ZnSO4甲醇溶液)，渦旋混合2 min，14000 r/min離心5 min，取上清液加入5 μLNaOH(1 mol/L)溶液，混合30 s，14000 r/min離心5 min，取上清液20 μL進(jìn)樣。

1.2.4 系統(tǒng)適應(yīng)性及方法專屬性：血漿樣品按“1.2.3”項下的前處理方法，在“1.2.1”項色譜條件下檢測。

1.2.5 標(biāo)準(zhǔn)曲線：取空白血漿，加入MPA、MPAG 標(biāo)準(zhǔn)工作液適量，配置成MPA血漿濃度為0.2、1.0、10.0、20.0、40.0、50.0 μg/mL，MPAG血漿濃度為2.5、12.5、25.0、250.0、400.0、500.0 μg/mL，按“1.2.3”項下方法前處理后進(jìn)樣測定，以MPA、MPAG檢測峰面積與內(nèi)標(biāo)峰面積比值(y1,y2)分別對MPA、MPAG(x1,x2)進(jìn)行線性回歸。

1.2.6 精密度與回收率實驗：精密稱取對照品適量，用甲醇作為溶劑配制高、中、低3種濃度的MPA及MPAG 的溶液，使MPA、MPAG溶液濃度分別為5、20、40 μg/mL 和12.5、100、400 μg/mL，同時取空白血漿配制相同濃度的質(zhì)控血漿，質(zhì)控血漿按照“1.2.3”項下進(jìn)行前處理，以同濃度質(zhì)控血漿的峰面積與溶液相應(yīng)峰面積的比值表示絕對回收率，實驗操作平行3次。實驗于同一天內(nèi)平行操作測定3次，計算得日內(nèi)RSD，連續(xù)3天每天操作測定1次，計算得日間RSD。

1.2.7 重復(fù)性實驗：取空白血漿，加入適量MPA、MPAG標(biāo)準(zhǔn)工作液，分別配制成濃度為10、25 μg/mL的質(zhì)控樣品，按“1.2.3”項下前處理進(jìn)樣，計算濃度，連續(xù)測定 5次。

1.2.8 臨床應(yīng)用：收集在安徽醫(yī)科大學(xué)第一附屬醫(yī)院2015年8月～2016年2月份期間進(jìn)行同種異體腎移植的患者32例，其中男27例、女5例，年齡(34.28±8.18)歲，體重指數(shù)為(21.76±2.89)kg/m2。患者均采用MMF聯(lián)合他克莫司、糖皮質(zhì)激素的免疫方案以抗免疫排斥反應(yīng)。患者于手術(shù)前晚開始服用MMF，MMF日劑量為1～1.5 g，于術(shù)后第7～14天期間患者早晨服藥前使用EDTA抗凝管采集外周靜脈血2 mL，采血后于2 h內(nèi)用低速離心機(jī)3000 r/min離心10 min，取上清血漿，按照“1.2.3”項下處理樣品進(jìn)行HPLC測定，測得結(jié)果采用Graphpad prism軟件繪制散點(diǎn)圖。

2 結(jié)果

2.1 系統(tǒng)適應(yīng)性及方法專屬性 MPA，MPAG及內(nèi)標(biāo)與血漿中內(nèi)源性物質(zhì)分離充分，峰型良好，保留時間分別為(4.0±0.2)、(11.2±0.1)、(7.8±0.1)min，色譜圖見圖1。

圖1 MPA和MPAG色譜圖 A.空白血漿；B.空白血漿+MPAG+MPA；C.血漿樣品1：MPAG；2：內(nèi)標(biāo)；3：MPAFig.1 The chromatogram of MPA and MPAG A.blank plasma; B.blank plasma+MPAG+MPA; C.plasma sample1：MPAG；2：internal standard substance；3：MPA

2.2 標(biāo)準(zhǔn)曲線 MPA標(biāo)準(zhǔn)曲線為y1=0.09855x1+0.03511(r=0.9998)，MPAG標(biāo)準(zhǔn)曲線為y2=0.09707x2-0.03043(r=0.9997)。結(jié)果表明，MPA、MPAG血漿濃度在0.2～50 μg/mL、2.5～500 μg/mL時線性良好。見圖2。

圖2 血漿中MPA、MPAG標(biāo)準(zhǔn)曲線Fig.2 The standard curve of MPA and MPAG in plasma

2.3 精密度與回收率實驗：MPA、MPAG及內(nèi)標(biāo)的絕對回收率在80%以上。用標(biāo)準(zhǔn)曲線測得MPA及MPAG的濃度與配制濃度的比值表示方法回收率。MPA、MPAG的方法回收率均在90%～110%之間，日內(nèi)及日間RSD均<10%。見表1。

表1 血漿中MPA、MPAG含量測定的回收率和精密度Tab.1 The recovery and precision of plasma MPA and MPAG determination

2.4 重復(fù)性實驗：MPA平均濃度為10.19 μg/mL，RSD為2.26%，MPAG平均濃度為25.28 μg/mL，RSD為1.88%，表明本方法重復(fù)性良好。

2.5 臨床應(yīng)用 32例同種異體腎移植患者血漿樣品檢測結(jié)果，見圖3。32例腎移植受者早期服用霉酚酸酯劑量為1～1.5 g/d，7～14 d MPA谷濃度范圍為0.32～6.19 μg/mL，MPAG谷濃度范圍為9.52～149.25 μg/mL，個體差異較大。MPA谷濃度95%置信區(qū)間為1.12～1.99 μg/mL。

圖3 腎移植受者血漿MPA、MPAG濃度分布Fig.3 The concentration distribution of plasma MPA and MPAG of renal transplant recipients

3 討論

MMF是前體藥物，其在體內(nèi)活性成分為MPA。MPA的作用靶點(diǎn)是次黃嘌呤脫氫酶(inosine 5’-monophosphate dehydrogenase，IMPDH)，抑制T、B淋巴細(xì)胞內(nèi)鳥嘌呤的合成，從而達(dá)到抑制淋巴細(xì)胞增殖的作用[2]。在器官移植患者中的研究表明，由于患者移植后的階段、腎功能的恢復(fù)情況，藥物代謝酶的遺傳因素，合并用藥等多種復(fù)雜因素影響，MPA藥動學(xué)在患者個體間存在極大變異性，進(jìn)而引起免疫抑制程度的變化，因此需要進(jìn)行治療藥物濃度監(jiān)測，實施個體化給藥[3]。MPAG是MPA主要的代謝物，雖然MPAG在藥理學(xué)上是非活性的，但接近82%的MPAG與白蛋白結(jié)合[4]，而MPA 97%與血漿白蛋白結(jié)合，因此MPA、MPAG之間存在競爭蛋白結(jié)合，血漿中MPAG的波動，可影響游離MPA濃度，進(jìn)而影響MPA的免疫抑制效應(yīng)。 MPAG大部分經(jīng)過肝腸循環(huán)再次水解為 MPA，平均約占MPA時間-濃度曲線下面積(AUC6-12 h)的37%(10%～60%)左右，患者間肝腸循環(huán)的差異是引起 MPA血藥濃度差異性的重要因素[5]。 而且，MPAG經(jīng)腎小球濾過及腎小管分泌排泄，腎功能不全的患者使其排泄減少，導(dǎo)致血中 MPAG濃度的升高[6]，體內(nèi)蓄積的MPAG經(jīng)過肝腸循環(huán)，進(jìn)一步引起 MPA的濃度增加。監(jiān)測MPA的同時檢測MPAG水平可能會給預(yù)測MPA暴露量提供一定的依據(jù)。

研究中曾嘗試用甲醇、乙腈沉淀蛋白，發(fā)現(xiàn)沉淀不完全或存在雜質(zhì)干擾的情況，也曾嘗試用有機(jī)溶劑反復(fù)萃取再用氮?dú)獯蹈桑嬖诓荒軐PA、MPAG萃取完全，回收率低的問題。

最終發(fā)現(xiàn)采用硫酸鋅蛋白沉淀劑去除血漿蛋白后直接進(jìn)樣，樣品預(yù)處理方法簡便、快速，可避免長時間、復(fù)雜樣品過程中的藥物降解。 MPA和MPAG極性相差較大, 給較短時間內(nèi)對兩者完成測定帶來困難。文獻(xiàn)報道中有的采用兩套色譜系統(tǒng)[7]測定的辦法, 也有采用離子對色譜法[8]，這些方法存在分析效率低、對儀器設(shè)備要求高或日常耗費(fèi)高等缺點(diǎn)。本實驗考察了不同色譜柱對MPAG和MPA 分離特性的影響，最終發(fā)現(xiàn)ZORBAX XDB C18色譜柱滿足對MPA及MPAG的分離度，同時采用梯度洗脫的方法，使得MPA、MPAG能夠在15 min內(nèi)分離完全，滿足短時間內(nèi)同時測定兩者濃度的要求。

本研究測定了32例腎移植患者術(shù)后給予1～1.5 g/dMMF后7～14 d MPA、MPAG的血漿谷濃度，MPA濃度范圍為0.32～6.19 μg/mL，MPAG濃度范圍為9.52～149.25 μg/mL，個體差異較大，與文獻(xiàn)報道[9-10]相似。在本研究中MPA谷濃度95%置信區(qū)間為1.12～1.99 μg/mL，與文獻(xiàn)報道[11]的MPA谷濃度的安全范圍1.40～2.80 μg/mL相類似。MPA、MPAG藥物濃度波動在本研究所建立的檢測范圍內(nèi)，方法滿足臨床檢測需要，檢測結(jié)果與文獻(xiàn)報道相近，該方法可以用于臨床腎移植患者的霉酚酸濃度監(jiān)測。

[1] Lamba V, Sangkuhl K, Sanghavi K,et al. PharmGKB summary: mycophenolic acid pathway[J].Pharmacogenet Genomics,2014,24(1):73-79.

[2] Kawanishi M, Yano I, Yoshimura K,et al. Sensitive and validated LC-MS/MS methods to evaluate mycophenolic acid pharmacokinetics and pharmacodynamics in hematopoietic stem cell transplant patients[J].Biomed Chromatogr,2015,29(9):1309-1316.

[3] Sam WJ, Akhlaghi F, Rosenbaum SE. Population pharmacokinetics of mycophenolic acid and its 2 glucuronidated metabolites in kidney transplant recipients[J].J Clin Pharmacol,2009,49(2):185-195.

[4] 趙本慧，陳丁丁，朱余兵.霉酚酸酯及其代謝產(chǎn)物的研究進(jìn)展[J].中國醫(yī)院藥學(xué)雜志，2014，34(22)：1957-1961.

[5] de Jonge H,Naesens M, Kuypers DR.New Insights Into the Pharmacokinetics and Pharmacodynamics of the Calcineurin Inhibitors and Mycophenolic Acid: Possible Consequences for Therapeutic Drug Monitoring in Solid Organ Transplantation[J].Ther Drug Monit,2009,31(4):416-435.

[6] Merkel U, Lindner S, Vollandt R,et al. Trough levels of mycophenolic acid and its glucuronidated metabolite in renal transplant recipients[J].Int J Clin Pharmacol Ther,2005,43(8):379-388.

[7] Atcheson B, Taylor PJ, Mudge DW,et al.Quantification of free mycophenolic acid and its glucuronide metabolite in human plasma by liquid-chromatography using mass spectrometrie and ultraviolet absorbance detection[J].J Chromatogr B Analyt Technol Biomed Life Sci,2004,799(1):157-163.

[8] 仲艷，高寧舟，焦正，等.HPLC法同時測定人尿液中霉酚酸及其代謝物葡糖昔酸結(jié)合物的濃度[J].中國臨床藥學(xué)雜志,2006,15(3):164-167.

[9] Figurski MJ, Pawiński T, Goldberg LR,et al.Pharmacokinetic monitoring of mycophenolic acid inheart transplant patients: Correlation the side-effects and rejections with pharmacokinetic parameters[J].Ann Transplant,2012,17(1):68-78.

[10] Mino Y, Naito T, Otsuka A, et al. Inosine monophosphate dehydrogenase activity depends on plasma concentrations of mycophenolic acid and its glucuronides in kidney transplant recipients[J].Clin Chim Acta,2009,409(1-2):56-61.

[11] 于立新，周敏捷，羅敏.腎移植受者應(yīng)用霉酚酸酯的合理治療窗[J].南方醫(yī)科大學(xué)學(xué)報，2014， 34(12): 1842-1845.

(編校：王儼儼)

作 者 簡 介

許杜娟，主任藥師、副教授，1985年蚌埠醫(yī)學(xué)院醫(yī)療系畢業(yè)，1991年安徽醫(yī)科大學(xué)臨床藥理學(xué)碩士畢業(yè)，2003年安徽醫(yī)科大學(xué)臨床藥理學(xué)博士畢業(yè)。1985年7月～1988年在宿縣地區(qū)衛(wèi)校工作，1991年7月～2004年10月在合肥市第二人民醫(yī)院工作，2004年10月至今在安徽醫(yī)科大學(xué)第一附屬醫(yī)院工作。現(xiàn)任安徽醫(yī)科大學(xué)藥學(xué)院副院長，第一附屬醫(yī)院藥學(xué)教研室主任，藥劑科副主任。安徽省第十、十一屆政協(xié)委員。

許杜娟教授主要從事腫瘤耐藥機(jī)制研究和逆轉(zhuǎn)腫瘤耐藥藥物研發(fā)，以及基因多態(tài)性與藥物療效相關(guān)性研究。主持省自然科學(xué)基金面上項目2項、省級科技攻關(guān)項目1項，安徽省高等學(xué)校自然科學(xué)基金3項、安徽省教學(xué)研究重點(diǎn)項目2項。擔(dān)任中國醫(yī)藥教育協(xié)會合理用藥專委會副主任委員，中國藥理學(xué)會臨床藥理學(xué)專委會常委，中國藥學(xué)會醫(yī)院藥學(xué)專委會委員；安徽省藥學(xué)會副理事長，安徽省藥學(xué)會藥事管理專委會主任委員，安徽康復(fù)醫(yī)學(xué)會藥物與保健康復(fù)專委會主任委員。《安徽醫(yī)藥》常務(wù)編委，《安徽醫(yī)科大學(xué)學(xué)報》《中國生化藥物雜志》《中國藥房》《中國藥業(yè)》編委。全國高等教育醫(yī)學(xué)數(shù)字化規(guī)劃教材國家醫(yī)學(xué)電子書包《臨床藥理學(xué)》、衛(wèi)計委臨床藥學(xué)“十二五”規(guī)劃教材《藥學(xué)服務(wù)與溝通技巧》編委；中國醫(yī)藥科技出版社“十三五”規(guī)劃教材《藥學(xué)服務(wù)實務(wù)》主編；人民衛(wèi)生出版社“十三五”規(guī)劃教材《藥學(xué)服務(wù)概論》副主編；主編《醫(yī)療機(jī)構(gòu)藥事管理實用手冊》，參編《現(xiàn)代醫(yī)院診療技術(shù)》等多部學(xué)術(shù)著作；發(fā)表學(xué)術(shù)論文90余篇(SCI收錄論文10余篇)。獲發(fā)明專利3項，獲安徽省教學(xué)成果獎二等獎1項。

Determination of plasma concentration of mycophenolic acid and mycophenolic acid glucuronide by HPLC

YANG Chun-lan1,2, WANG Qin1, SU Yong2, XIA Quan2, LIAO Gui-yi3, XU Du-juan1Δ

(1.College of Pharmacy, Anhui Medical University, Hefei 230022, China; 2.Department of Pharmacy, The First Affiliated Hospital of Anhui Medical University, Third-grade Pharmaceutical Chemistry Laboratory of State Administration of Traditional Chinese Medicine,Hefei 230022, China; 3.Department of Urology, The First Affiliated Hospital of Anhui Medical University, Hefei 230022, China)

ObjectiveTo develop an HPLC method for the determination of mycophenolic acid(MPA), mycophenolic acid glucuronide(MPAG) in plasma.MethodsThe samples were precipitated with zinc sulphate-methanol solution before injection. Carbamazepine was selected as internal standard,ZORBAX XDB C18(4.6 mm×250 mm，5 μm)column was used and the flow rate was 1 mL/min. The mobile phase consisted of methanol-acetonitrile-potassium dihydrogen phosphate buffer solution(gradient elution) .The column temperature was 30 ℃ and the detective wave length was 254 nm. And then the MPA,MPAG concentration of 32 patients in 7-14 days after renal transplantion were determined.ResultsThe assay was linear within 0.2-50 μg/mL for MPA, 2.5-500 μg/mL for MPAG(r>0.999).Absolute recovery rates of MPA,MPAG were more than 80%, the recoveries were between 90%-110%.The intra-day and inter-day RSDs were both lower than 10%.Totally 32 cases of renal transplantion patiens were with mycophenolate mofetil at the dose of 1-1.5 g/d,and MPA in plasma was within the range of 0.32-6.19 μg/mL,MPAG in plasma was within the range of 9.52-149.25 μg/mL.ConclusionThe method is accurate,convenient and rapid,which could be used in the quantitative determination of plasma concentration of MPA,MPAG in renal transplantion patients.

mycophelic acid; mycophenolic acid glucuronide; renal transplant recipients; HPLC; plasma concentration

10.3969/j.issn.1005-1678.2016.11.004

楊春蘭，女，碩士，研究方向：臨床藥學(xué)，E-mail:yangchunlan0928@126.com；許杜娟，通信作者，女，博士，主任藥師，副教授，研究方向：臨床藥學(xué)、腫瘤藥理學(xué)，E-mail:xudujuan6365@163.com。

R917

A