沙利度胺聯合甲氨蝶呤對類風濕性關節炎患者外周血調節性T細胞及細胞因子IL-6表達的調節作用

吳素葉, 薛阿利, 趙樸, 劉凌云, 蔣蕾, 朱小春

(1.溫州醫科大學附屬第三醫院 血液科，浙江 瑞安 325200；2.溫州醫科大學附屬第一醫院 風濕免疫科，浙江 溫州 325000)

沙利度胺聯合甲氨蝶呤對類風濕性關節炎患者外周血調節性T細胞及細胞因子IL-6表達的調節作用

吳素葉1, 薛阿利1, 趙樸1, 劉凌云1, 蔣蕾1, 朱小春2Δ

(1.溫州醫科大學附屬第三醫院 血液科，浙江 瑞安 325200；2.溫州醫科大學附屬第一醫院 風濕免疫科，浙江 溫州 325000)

目的 分析沙利度胺聯合甲氨蝶呤(thalidomide+methotrexate, T+M)治療類風濕性關節炎(rheumatoid arthritis，RA)前后調節性T細胞比例及細胞因子白介素-6(interleukin- 6，IL-6)表達情況，揭示T+M治療RA作用機制。 方法 選取2014年8月～2016年8月溫州醫科大學附屬第三醫院血液科就診治療的類風濕性關節炎58例患者，沙利度胺聯合甲氨蝶呤治療前后流式細胞術檢測外周血調節性T細胞比例，對比分析T+M治療前后調節性T細胞比例變化；酶聯免疫吸附測定(enzyme linked immunosorbent assay，ELISA)檢測外周血中淋巴細胞分泌細胞因子IL-6表達情況。結果 T+M治療后組RA患者外周血調節性T細胞(CD25+Foxp3/CD4+)比例較治療前組明顯增加；然而，T+M治療后組IL-6表達水平同治療前組相比明顯下降。 結論 T+M治療RA可能是通過增加調節性T細胞以及減少細胞因子IL-6而調控T細胞穩態而起作用。

沙利度胺；甲氨蝶呤；類風濕性關節炎；調節性T細胞；IL-6

類風濕性關節炎(rheumatoid arthritis，RA)是一類以滑膜炎為主的慢性炎癥性疾病，可累積機體多器官嚴重危害人體健康的全身性自身免疫疾病。類風濕性關節炎在南半球發病率為0.5%～1%，且從南至北、從城市到農村，發病率呈現降低趨勢。類風濕性關節炎造成個人及社會承受重大負擔。對于個人來說，類風濕性關節炎引起骨骼肌肉病變，嚴重者可出現物理功能障礙。同時，RA導致患者生活質量下降及累積共病風險(如心血管系統疾病)。對于社會而言，醫療支出、個體工作能力減弱及社會活動參與度下降都將帶來巨大的社會經濟負擔[1]。

目前，類風濕性關節炎治療以生物抑制劑為主，生物抑制劑可有效控制疾病活動，且可有效控制心血管風險事件發生。但是，生物抑制劑一些重要的臨床實踐及臨床研究報道了某些生物抑制劑(特別是TNF單克隆抗體等)可引發心律失常[2]。繼而，抗類風濕性關節炎滑膜血管新生治療為RA治療提供了新的方向。沙利度胺是因其抗血管新生和免疫調節作用受到了廣泛關注。臨床研究發現無論沙利度胺單獨或聯合甲氨蝶呤用藥均有效，沙利度胺同甲氨蝶呤具有相互調節，互相促進作用[3]。

本研究著重臨床尋究，本著沙利度胺聯合甲氨蝶呤的臨床療效，借以通過調節性T細胞及細胞因子IL-6表達情況，尋找沙利度胺聯合甲氨蝶呤治療RA的可能機制。既往綜述報道了T細胞與RA之間的關聯性，表明調節性T細胞在RA的發生發展過程中具有重要的意義[4]。淋巴細胞分泌的IL-6同類風濕關節炎的關鍵細胞因子，也是沙利度胺和甲氨蝶呤免疫調節的作用點。故本研究期待找到沙利度胺聯合甲氨蝶呤應用于RA治療的依據。

1 資料與方法

1.1 一般資料 選取2014年8月～2016年8月溫州醫科大學附屬第三醫院血液科就診治療的類風濕性關節炎(rheumatoid arthritis,RA)患者58例，征得RA患者參與研究的知情同意，其中男20例，女38例，年齡19～62歲，平均年齡(44.6±8.2)歲，病程0.5～6年，平均病程(3.2±1.1)年。所有患者均符合美國風濕病學會的診斷標準[5]，排除心腦血管疾病共病存在。本研究經過本院倫理委員會批準，患者知情同意并簽署知情同意書。

1.2 方法

1.2.1 治療方法：沙利度胺(常州制藥廠有限公司，國藥準字H32026129)用藥劑量根據患者耐受程度依次遞加，第1周口服沙利度胺50 mg/d，第2周服用沙利度胺75 mg/d，第3周服用沙利度胺100 mg/d，聯合甲氨蝶呤(上海信誼藥廠有限公司，國藥準字H31020644)10 mg，口服，1次/周，治療持續時間3個月。

1.2.2 檢測方法：調節性T細胞檢測：取類風濕性關節炎患者T+M治療前后外周血2 mL置于肝素鈉抗凝EDTA管，應用流式細胞儀(美國BD FACSCalibur全自動多色分析流式細胞儀系統)檢測外周血中調節性T細胞占有百分比。

細胞因子白介素-6(interleukin- 6，IL-6)檢測：同樣取RA患者T+M治療前后外周血2 mL置于肝素鈉抗凝管中，5 min后加入Hank’s液，手動輕輕搖勻，用毛細血管吸取抗凝血，沿管壁緩慢加入另一含淋巴細胞分離液的試管中，平衡后置于水平離心機中2000 r/min離心10 min，毛細血管吸取血漿與分層液界面處淋巴細胞層于一刻度管中，加入Hank’s液于5 mL處，混勻，平衡后2000 r/min離心10 min，棄上清獲淋巴細胞。淋巴細胞梯度稀釋后分別應用酶標儀(美國Thermo賽默飛Maltikan FC酶標儀)檢測，人源CD4、CD25抗體均購自美國BD，人源IL-6 ELISA檢測試劑盒購自英國Abcam。

2 結果

2.1 T+M治療RA前后2組調節性T細胞檢測結果 T+M治療RA前后2組調節性T細胞檢測結果如下：T+M治療后RA患者外周血調節性T細胞(CD25+Foxp3/CD4+)比例為[(16.04±0.86)%]，而T+M治療前RA患者外周血調節性T細胞比例為[(8.56±0.45)%]。T+M治療后較治療前明顯升高，經統計學分析，差異具有統計學意義(P<0.05)。見圖1。

圖1 治療前后某患者的調節性T細胞檢測結果Fig.1 The results of regulatory T cells in patients before and after treatment

2.2 T+M治療RA前后2組淋巴細胞IL-6表達結果 T+M治療后RA患者外周血分離淋巴細胞中IL-6濃度為[(28±15)pg/mL]，而T+M治療前RA患者外周血分離淋巴細胞中IL-6濃度為[(45±21)pg/mL]。同T+M治療前組相比，T+M治療后RA患者外周血分離淋巴細胞中IL-6濃度顯著下降，且差異具有統計學意義(P<0.05)。

3 討論

類風濕性關節炎是風濕科常見疾病之一，同時也是一類至今發病機制尚未明確的全身自身免疫疾病之一。近年來多種治療方案被嘗試應用于類風濕性關節炎，包括沙利度胺聯合甲氨蝶呤用藥都被證實具有一定療效，但未見治療作用機理報道。且近年來調節性T細胞和細胞因子IL-6等在RA的發病機制中的作用被眾多學者關注[4]。

本研究發現沙利度胺聯合甲氨蝶呤治療類風濕性關節炎后外周血中調節性T細胞明顯升高，反之，外周血分離淋巴細胞分泌細胞因子IL-6顯著下降。究其緣由，本研究認為T+M治療RA作用機制包含通過調控調節性T細胞及部分細胞因子分泌進行免疫調節。

CD4+CD25+調節性T細胞是一類主動免疫調節T細胞，具有控制自身免疫反應及維持外周免疫耐受作用，且CD4+CD25+調節性T細胞可通過細胞因子分泌水平調控CD8+T細胞分化[6]。研究表明調節性T細胞數量及功能異?？赡苁穷愶L濕性關節炎發生發展的重要原因，RA患者外周CD4+T細胞所包含的T細胞受體重排切除環大量減少，受體重排切除環陽性T細胞缺失是RA患者外周T細胞穩態失衡的主要原因[7]。沙利度胺作為一種免疫調節劑被廣泛應用于抗腫瘤和抗風濕疾病的治療，既往研究主要集中報道了沙利度胺抗血管新生活性與抗風濕治療之間的關聯性[8]。本研究發現免疫調節劑沙利度胺聯合抗葉酸類藥物甲氨蝶呤可顯著提升RA患者外周調節性T細胞的數量，從而調節RA患者失衡的外周T細胞。

細胞因子IL-6是一類重要物質參與免疫反應及動態平衡維持，細胞因子平衡網絡被打破，將會引起炎癥或自身免疫疾病，例如類風濕性關節炎[9]。既往研究發現IL-6和TNF-β共同作用于CD4+T細胞，使之分化為Th17細胞，且只有IL-6存在下，CD4+CD25+Foxp3+調節性T細胞仍可自我分化為Th17細胞[10-11]。IL-6是調節性T細胞向Th17轉化的關鍵因子[12]。本研究發現T+M聯合治療可顯著升高外周淋巴細胞IL-6表達，抑制調節性T細胞想Th17轉化，進一步調控失衡的T細胞穩態。

受本單位條件所限，本研究檢測的細胞因子表達情況是指外周血分離所獲淋巴細胞分泌情況，而不是T淋巴細胞直接的表達情況，故可能會存在B淋巴細胞的作用。期待各位研究者后續能夠進一步分離T淋巴細胞，檢測RA患者T淋巴細胞細胞因子受沙利度胺聯合甲氨蝶呤治療的影響。

綜述，沙利度胺聯合甲氨蝶呤可通過調節性T細胞以及細胞因子IL-6調控外周T細胞穩態，此作用可能是沙利度胺聯合甲氨蝶呤治療類風濕性關節炎的作用機制之一。

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(編校：薛雪)

Effect of thalidomide combined with methotrexate on expression of regulatory T cells and IL-6 in rheumatoid arthritis

WU Su-ye1, XUE A-li1, ZHAO Pu1, LIU Ling-yun1, JIANG Lei1, ZHU Xiao-chun2Δ

(1.Department of Hematology, The Third Affiliated Hospital of Wenzhou Medical University, Ruian 325200, China; 2 Department of Rheumatology, The First Affiliated Hospital of Wenzhou Medical University, Wenzhou 325000, China)

ObjectiveTo investigate the effect of before and after combination therapy of thalidomide and methotrexate (T+M) on regulatory T cells and IL-6 expression profile,and to reveal the mechanism of therapeutic effect of T+M on rheumatoid arthritis.MethodsA total of 58 patients with rheumatoid arthritis from August 2014 to August 2016 in the Third Affiliated Hospital of Wenzhou Medical University.The flow cytometry assay and enzyme-linked immunosorbent assay (ELISA) were used to estimate the ratio of peripheral blood regulatory T cells and expression profile of IL-6 in peripheral blood lymphocyte before and after combination therapy of thalidomide and methotrexate.ResultsAfter combination therapy of T+M,the ratio of peripheral blood CD25+Foxp3/CD4+T cells had a marked increase compared with before combination of therapy of T+M;but the expression of IL-6 had a significant decrease in the group of after combination therapy of T+M compared with before combination therapy.ConclusionThe effect of combination therapy of T+M on rheumatoid arthritis is associated with increasing the ratio of regulatory T cells and decreasing the secretion of IL-6 that could regulate T cells to homeostasis.

thalidomide; methotrexate; rheumatoid arthritis; regulatory T cells; IL-6

10.3969/j.issn.1005-1678.2016.11.012

吳素葉，女，本科，主治醫師，研究方向：風濕病學，E-mail:wfswusuye@yahoo.com；朱小春，通信作者，男，本科，主任醫師，研究方向：風濕免疫性疾病、疑難風濕病癥，E-mail:wfyzhuxiaochun@163.com。

R593.22

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