RACK1對肺腺癌A549細胞生物學行為及相關蛋白表達的影響

杜凱麗 梁 鋼 康繼輝 米小芳 王宏坤 肖 虹 梁建芳 鄭繪霞

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RACK1對肺腺癌A549細胞生物學行為及相關蛋白表達的影響

杜凱麗 梁 鋼 康繼輝 米小芳 王宏坤 肖 虹 梁建芳 鄭繪霞

【摘要】目的 研究RACK1基因沉默對A549細胞生物學行為的影響，探究其對VEGF、Bcl-2表達的影響。方法 轉染RACK1 shRNA至A549細胞，分別設穩(wěn)定轉染的實驗組、陰性對照組和空白對照組。Western blot檢測各組細胞RACK1、VEGF、Bcl-2的表達，平板克隆實驗檢測各組細胞的增殖情況，劃痕愈合實驗觀察細胞運動遷移的改變，流式細胞術分析細胞凋亡率的變化。結果 實驗組細胞增殖能力下降，遷移能力減弱，凋亡率增高，VEGF、Bcl-2表達下調（P＜0．05）。結論 RACK1基因沉默能抑制A549細胞的增殖和遷移，誘導其凋亡，下調VEGF、Bcl-2的表達。

【關鍵詞】RACK1；shRNA干擾；流式細胞術

Objective To investigate the effect of silencing RACK1 on A549 cell proliferation and VEGF，Bcl-2 expression． Methods The shRNA was transfected into A549 cells as the experiment group． The expression level of RACK1，VEGF，Bcl-2 were measured by western blot，cell proliferation was detected by plate colony forming assay． scratch healing experiment was used to detet migration capacity． Cell apoptosis was measured by flow cytometry． Results The ability of proliferation and the migration ability of the cells in the experimental group was weakened． The apoptotic rate was increased． The expression level of VEGF and Bcl-2 were decreased． Conclusion Targeting to inhibit RACK1 expression in A549 cells could inhibit proliferation and induce apoptosis，specifically decreased the expression level of VEGF and Bcl-2．

【Key words】 RACK1，ShRNA interference，F(xiàn)low cytometry

肺腺癌發(fā)病隱匿，多數(shù)患者常以轉移灶為首發(fā)癥狀，生存率極低［1］。RACK1在肺腺癌中表達增高，與患者的病理分期、腫瘤大小、淋巴結轉移狀況有相關性［2］。本研究通過沉默肺腺癌A549細胞中RACK1的表達，觀察干擾前后細胞的生長、遷移、細胞周期及凋亡狀況，探討RACK1在肺腺癌細胞中發(fā)揮的作用及其與VEGF和Bcl-2之間可能存在的關系。

1 實驗方法

1.1 細胞的轉染

待細胞達到60%～70%融合時，轉染RACK1 shRNA至A549細胞，以轉染空載質粒作為陰性對照組，以未轉染的細胞作為空白對照組。

1.2 Western blot檢測各組細胞RACK1、VEGF、Bcl-2的表達

取轉染48 h后的各組細胞蛋白樣品經1電泳分離后轉膜，封閉后一抗、二抗4℃孵育，發(fā)光顯影。目的蛋白與內參GAPDH灰度值標比后的比值為其相對蛋白表達量。

1.3 平板克隆形成實驗

將各組細胞在6 cm培養(yǎng)皿中連續(xù)靜置培養(yǎng)14 d。4%多聚甲醛固定，姬姆薩染液染色，自來水沖洗、晾干，顯微鏡下記錄克隆數(shù)。

1.4 體外遷移實驗

待細胞生長達到90%左右融合時進行劃痕處理，于劃痕后0 h、24 h、48 h觀察拍照，劃痕愈合率（%）=（1-各時間點劃痕面積/開始的劃痕面積）×100%，愈合率反應各組細胞的體外遷移能力。

1.5 細胞凋亡率檢測

將各組細胞用PBS液洗滌后200目篩網過濾，按照Annexin-V說明書滴加試劑，30 min內用流式細胞儀檢測。

1.6 統(tǒng)計學分析

2 結果

經比較，實驗組細胞RACK1蛋白相對表達量降低（P＜0.05），增殖、遷移能力減弱，凋亡率增高，VEGF、Bcl-2表達下調（P＜0.05），見表1。

表1 RACK1對A549細胞增殖、遷移、凋亡及相關蛋白表達的影響

3 討論

有學者認為RACK1是肺腺癌特異的分子生物學標記物［2］，其表達水平的改變可能直接影響到肺腺癌的進展情況。我們前期研究通過分析RACKl和VEGF在肺腺癌組織中的表達情況，發(fā)現(xiàn)這兩種蛋白在肺腺癌的浸潤轉移過程中可能以相互協(xié)同促進的方式發(fā)揮作用［3］。本次研究發(fā)現(xiàn)，沉默RACK1基因后A549細胞的增殖能力和遷移能力均下降，同時VEGF的表達也降低，這說明RACK1可能通過某種途徑發(fā)揮了對VEGF的調控，從而調控了肺腺癌細胞的增殖和遷移能力。同時沉默RACK1基因后A549細胞的凋亡率增加，Bcl-2的表達降低，因此我們推測RACK1可能在Bcl-2上游發(fā)揮了一定的調控作用，通過上調Bcl-2而抑制細胞凋亡。有學者證實RACK1參與了SHH和STAT3信號通路的激活［4］，從而導致細胞異常增殖和惡性轉化，而VEGF、Bcl-2均為STAT3和SHH信號通路下游的靶基因，有學者發(fā)現(xiàn)STAT3的激活可以誘導VEGF的表達和活性增強［5］，在肺腺癌中STAT3的活化能增強Bcl-2的表達，從而顯示出其抗凋亡效應［6］，有文獻報道SHH信號通路與VEGF的表達存在相關性［7］，Yang等［8］學者發(fā)現(xiàn)SHH過表達的肺腺癌細胞增殖能力增強且凋亡水平降低，且Bcl-2的表達水平也上調。由此我們猜測在肺腺癌中RACK1可能通過對SHH和STAT3信號通路的調控而影響了VEGF、Bcl-2的表達，但具體分子機制如何，尚待進一步研究說明。

參考文獻

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［2］ Naqashio R，Sato Y，Matsumoto T，et al． Expression of RACK1 is a novel biomarker in pulmonary adenocarcinomas［J］． Lung Cancer，2010，69（1）: 54-59．

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［7］ 馬曉麗，孫海基，汪運山，等． 胃癌組織中Sonic Hedgehog和vegf表達及臨床意義的研究［J］． 中華腫瘤防治雜志，2007，14（24）: 1879-1881．

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The Effect of RACK1 on the Biological Behavior of Lung Adenocarcinoma Cells A549 and VEGF，Bcl-2 Expression

DU Kaili LIANG Gang KANG Jihui MI Xiaofang WANG Hongkun XIAO Hong LIANG Jianfang ZHENG Huixia Basic Medical College of Shanxi Medical University，Taiyuan 030001，China

【Abstract】

作者單位：030001 太原，山西醫(yī)科大學基礎醫(yī)學院 基金項目：山西省科技攻關項目（項目編號：20140313011-13）

通訊作者：鄭繪霞，E-mail：huixiazheng62@126．com

【中圖分類號】R361

【文獻標識碼】A

【文章編號】1674-9316（2016）05-0178-03

doi:10．3969/j．issn．1674-9316．2016．05．130