中緬邊境惡性瘧原蟲對青蒿素類藥體外敏感性檢測和K-13基因突變的相關性研究

張艷梅，吳艷瑞，胡　月，王麗瓊，阮永華，馬　寧，李思熳，王穎娜，賈丹丹，向　征，楊照青

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中緬邊境惡性瘧原蟲對青蒿素類藥體外敏感性檢測和K-13基因突變的相關性研究

張艷梅1,2,3，吳艷瑞4，胡月5，王麗瓊1，阮永華5，馬寧1，李思熳6，王穎娜1，賈丹丹1，向征1，楊照青1

1.昆明醫科大學病原微生物系與免疫學系，昆明650500；2.昆明醫科大學第一附屬醫院感染內科，昆明650500；3.云南公共衛生與疾病防控協同創新中心,昆明650031；4.昆明醫科大學基礎醫學院細胞生物學與醫學遺傳學系，昆明650500；5.昆明醫科大學病理與病理生理學系，昆明650500；6.昆明醫科大學基礎醫學院生物化學與分子生物學系, 昆明650500

摘要：目的研究中緬邊境惡性瘧原蟲對青蒿素類藥物抗藥機制。方法收集分離自2008—2010年中緬邊境確診為惡性瘧病人體內的瘧原蟲，共34株，進行體外培養；提取原蟲血DNA，采用聚合酶鏈式反應(PCR)方法，擴增PF3D7-1343700(K-13)基因，對目標基因進行全基因測序，檢測K-13基因變異情況；依據基因有無變異分為兩組，對比兩個組別瘧原蟲對3種抗瘧藥青蒿琥酯(Artesunate，AS)、雙氫青蒿素(Dihydroartemisinine，DHA)和青蒿素(artemisinin，ART)的半效抑蟲濃度(IC50值)，并與野生株3D7做對比；隨后將這些瘧原蟲在環狀體時期暴露于大劑量的DHA下，6 h后洗盡藥物，再經過66 h培養后涂片，計算生存率(RSA)，比較變異株和非變異株之間有無差異。結果檢測發現瘧原蟲K13基因存在137-142位點NN插入(占82.4%)，另有E252Q 、F446I、C469Y、R539T、P553L、P574L 、H719N位點突變，均伴有NN插入，其中F446I(占44.1%)。病人株的IC50值和野生株無統計學差異(P>0.05)，但病人株的RSA高于野生株(P<0.05)；有K13基因變異組和無變異組對AS、DHA、ART的IC50值無統計學差異(P>0.05)，但有基因變異組的RSA高于無基因變異組(P<0.05)。結論本研究結果發現K-13基因變異與惡性瘧原蟲對青蒿素類藥物抗藥性可能相關。

關鍵詞：惡性瘧原蟲；青蒿素類藥物；耐藥機制;PF3D7_1343700

Supported by the National Natural Science Foundation of China (Nos.U1202226,81161120421,31260508),the joint project from Science and Technology Department of Yunnan Province and Kunming Medical University(Nos.2015FB034,2014FB005), the Innovation Foundation of Kunming Medical University(No.2014-D2), the project of Yunnan Provincial Collaborative Innovation Center of Public Health and Disease Prevention and Control(No.2014YNPHXT05) and the National Natural Science Foundation of Yunnan Province(No.2012FB153)

瘧疾是嚴重危害人類健康的寄生蟲病，青蒿素類藥物是我國自主研發的抗瘧藥，在瘧疾的防治工作中取得了舉世矚目的成果。但隨著青蒿素類藥物的廣泛應用，瘧原蟲對青蒿素類藥物敏感性下降的報道不斷出現[1-2]。到目前為止，惡性瘧原蟲對青蒿素類藥物耐藥的機理尚不明確，有研究報道提示惡性瘧原蟲對青蒿素的耐藥可能和瘧原蟲的K-13基因變異有關。本次研究調查中緬邊境惡性瘧病人體內的瘧原蟲，進行體外藥敏測定，并對這些瘧原蟲的K-13基因進行測序分析，了解K-13基因變異在中緬邊境惡性瘧原蟲中多態性及與青蒿素類藥物耐藥的關系。

1材料與方法

1.1蟲株來源本次試驗所用蟲株從2008—2010年中緬邊境瘧疾流行區確診為惡性瘧的病人體內分離(簡稱病人株)，共34株，病人在治療前留外周血2～3 mL,凍存，備用。對照組為野生株3D7 ,來自Malaria Research and Reference Reagent Resource Center(MR4)。標本經過體外復蘇培養成活，鑒定為單一感染株，進行試驗研究。

1.2瘧原蟲培養瘧原蟲經復蘇成活后參照改良的Trager-Jensen法[3]進行用完全培養液包含 HEPES(Gibco)、次黃嘌呤(Sigma)、Albumax II (Gibco)、RPMI 1640 (Gibco)、慶大霉素、NaHCO3(sigma)及O+RBC(來自云南省中心血站)培養，充入混合氣體(3%O2，5%CO2，92%N2，購自昆明氧氣廠)，擰緊瓶蓋，放入37 ℃培養箱中培養，成活后保種，留取原蟲血以備提取瘧原蟲的DNA。

1.3瘧原蟲DNA的提取及K-13基因的擴增。

1.3.1瘧原蟲DNA的提取將原蟲血參照百泰克DNA提取試劑盒(購自北京百泰克生物技術有限公司)操作步驟提取原蟲的DNA。-20 ℃保存備用。

1.3.2瘧原蟲K-13基因PCR擴增及測序K-13基因全基因測序，分為1片段、A片段及B片段3個片段，用PrimerPrimer5.0軟件設計擴增引物，由上海生工生物公司合成。K-13基因擴增引物見表1。

表1　K-13基因3個片段引物

各個片段的反應條件均按以下操作：第一輪的反應體系為15 μL,即2XTag Master Mix 7.5 μL,引物(5 μmol/L)各0.5 μL,DNA 模板2 μL,去離子水4.5 μL。PCR反應條件：預變性95 ℃，5 min；變性95 ℃，30 s；退火56 ℃，30 s；延伸68 ℃，60 s；40個循環。最后延伸68 ℃，5 min。PCR產物4 ℃保存。

第二輪的反應體系為40 μL,即2XTag Master Mix 24 μL,引物(5 μmol/L)各1 μL,DNA 模板2 μL,去離子水24 μL。PCR反應條件：預變性95 ℃，5 min；變性95 ℃，30 s；退火56 ℃，30 s；延伸68 ℃，60 s；40個循環。最后延伸68 ℃；5 min。PCR產物經2%瓊脂糖凝膠電泳。

1.3.3DNA測序及結果分析將PCR產物送生工公司進行測序用DNAStar軟件分析測序數據。依據測序結果將標本分為有變異組和未變異組。

1.4測定惡性瘧原蟲對3種青蒿素類抗瘧藥體外IC50值3種青蒿素類抗瘧藥AS、DHA和ART(購自昆明制藥集團有限公司)。待瘧原蟲密度達到1%以上時，進行青蒿琥酯(AS)、雙氫青蒿素(DHA)、青蒿素(ART)3個藥物的半效抑蟲濃度IC50值的測定。將原蟲密度稀釋到0.5%，紅細胞壓積稀釋到2%，加入配制好的藥板中(藥物為AS、DHA、ART,濃度為0.5、0.15、0.05、0.015、0.005、0.001 5、0.000 5、0.000 15 pmol/L)形成終濃度為：(100、30、10、3、1、0.3、0.1、0.03)nmol/L,依照WHO藥板測定方法加入藥板中，在5%的CO2培養箱中培養72 h后放到在-80 ℃凍30 min，然后移到37 ℃溫箱中解凍，加入裂解液讓細胞破裂，加SYBR Green I體外熒光法測量在藥板中惡性瘧原蟲DNA含量的方法，測量惡性瘧原蟲在不同藥物濃度下生長產生的DNA含量的光密度值，利用PRISM5.0 計算出半效抑制率(IC50)。

1.5惡性瘧原蟲在DHA壓力下環狀體時期生存率的測定惡性瘧原蟲在DHA壓力下環狀體時期的生存率(ring-stage survival assay即RSA)是一種新的體外測定惡性瘧原蟲對青蒿素類藥物抗藥性的檢測方法。具體的方法為：待瘧原蟲的密度大于1% 時，將瘧原蟲密度稀釋為1%，紅細胞壓積調整到2% 的，原蟲血分為實驗組及對照組各10 mL，加入培養瓶中。實驗組加入200 nmol/L的DHA，對照組加入相同體積的0.1%二甲亞砜液(Sigma公司)。充入混合氣(3%O2，5%CO2，92%N2，購自昆明氧氣廠)，置于37 ℃二氧化碳培養箱中培養6 h后取出，充分洗去藥物DHA，具體方法：抽吸上清液，將沉淀完全吸出，加入12 mL的1640液充分混勻后3 500 r/min離心5 min，去上清，再次加入1640液12 mL ,重復上述步驟1次，去上清后將沉淀轉入新的培養瓶中加入新的完全培養液至總體積10 mL,充入混合氣后放入培養箱培養66 h，然后取出培養瓶，去上清，沉淀涂薄片，用瑞-姬染色后兩人分別顯微鏡鏡檢，計數玻片中20 000個紅細胞中的環狀體和滋養體的數量，如結果相差大于10%，重新鏡檢。生存率=實驗組的環狀體、滋養體總和與對照組的環和滋養體的總和比例再乘以100。

2結果

2.1K-13基因1、A、B片段二次擴增產物在1.5%瓊脂糖凝膠電泳結果

2.1.1K-13基因1片段二次擴增產物1 000 bp左右目的片段結果見下圖。

圖1K-13基因1片段Nested-PCR二次擴增產物1.5%瓊脂糖凝膠電泳圖

Fig.1Agarose gel electrophoresis for PCR amplification of part1 in K-13 gene

2.1.2K13基因A片段Nested-PCR產物電泳結果見下圖，擴增860 bp左右目的片段結果。

圖2　K13基因A片段Nested-PCR產物電泳結果圖

Fig.2Agarose gel electrophoresis for PCR amplification of partA in K-13

2.1.3K-13基因 B片段 Nested-PCR產物電泳結果，擴增960 bp左右目的片段結果，見下圖。

圖3　K-13基因 B片段 Nested-PCR產物電泳圖

Fig.3Agarose gel electrophoresis for PCR amplification of partB in K-13 gene

2.2病人株K-13基因變異結果本次實驗檢測了病人株的K-13基因，和野生株3D7的序列做對比，病人株K-13 基因有82.4%(28/34)存在137-142位點NN插入，6株(6/34占17.6%)無NN插入。另外有點突變：F446I(15/34占44.1%)、C469Y(1/34占2.9%)、 R539T (1/34占2.9%)、P553L(1/34占2.9% )、P574L(1/34占2.9% )、H719N( 1/34占2.9%)、E252Q(1/34占2.9%)均為單個的基因位點變異；有點突變株均有NN插入。

表2病人株對AS、DHA、ART的IC50值和RSA與野生株3D7對比表

Tab.2Comparision ofP.falciparumclinical isolates and standard strain(3D7) for drug susceptibilities in AS DHA ART and RSA exposed to high-dose of dihydroartemisinin

IsolateN(株)IC50值AS(C±Q)DHA(NM)ARTRSA(%)病人株clinicalisolates344.53±0.812.89±0.825.72±0.235.3野生株(3D7)Standardstrain14.20±0.912.19±0.284.6±0.41.0P值△0.020△0.010△0.001※0.001

注：△P>0.05，差異無統計學意義，※P<0.05，差異有統計學意義。

Note:△P>0.05，which is no significant difference in IC50s in P. falciparum clinical isolates and 3D7.※P<0.05，which is significant difference in RSA in two groups.

表3有變異組和無變異組對三種抗瘧藥的IC50值和RSA對比表

Tab.3Comparision of K13 gene mutations and no mutations for drug susceptibilities in three antimalaria drugs and RSA in 34 clinical isolates

IC50值N(C±Q)AS(NM)DHAARTRSAMean無變異組genemutations63.37±0.392.48±0.405.80±0.472.69變異組Nomutations283.54±0.152.90±0.145.77±0.167.73P值△0.67△0.28△0.94※0.01

注：△P>0.05，提示變異組和無變異組IC50 值無統計學差異，※P<0.05，提示兩組間RSA值存在統計學差異。

Note:△P>0.05，which is no significant difference in IC50s of three antimalaria drugs in gene mutations and no mutations.※P<0.05，which is significant difference in RSA in two groups.

3討論

青蒿素類藥物是全球公認治療瘧疾的首選藥，目前對瘧疾的治療仍有很好的療效。但現全球已不斷有青蒿素類藥物療效出現下降的報道，尤其在緬甸等東南亞國家，主要表現在瘧原蟲清除時間延長及復發[1-2]。青蒿素類藥物的耐藥問題不容忽視，目前瘧原蟲對青蒿素類藥物耐藥的機制尚不明確，有學者[4]提出瘧原蟲對青蒿素類藥敏感性下降主要是原蟲對藥物產生了抗藥性，他們觀察到Pfmdr1基因變異在耐藥株中表達高于非耐藥株，耐藥的瘧原蟲抗氧化防御系統更為完備，抗氧化的能力明顯提高，足以對抗青蒿素類藥物的作用。我們將來自中緬邊境惡性瘧病人體內的瘧原蟲進行AS、DHA及ART，IC50的測定，發現瘧原蟲的IC50值和野生株3D7對比，無統計學差異，體外試驗提示來自病人體內的惡性瘧原蟲尚不需提高抗瘧藥的濃度來殺滅，這些原蟲尚未出現真正的抗藥性。

現在惡性瘧原蟲對青蒿素類藥不敏感的機制主要集中在休眠學說[5]，K-13基因是近年來研究最多的與惡性瘧原蟲對青蒿素類藥物耐藥有關的基因，認為是由于該基因的變異，導致瘧原蟲休眠，即在紅細胞內的環狀體期延長，是原蟲在不利于生長的條件下出現發育遲滯的現象。青蒿素類藥物是短效藥，惡性瘧原蟲通過休眠現象可躲過藥物的作用，待藥效高峰過后再繼續發育，國外有很多研究提示瘧原蟲的休眠現象和K-13 基因基因變異有關,k-13基因變異與原蟲在青蒿素類藥物下生存率提高有關[6]。本次實驗發現中緬邊境的瘧原蟲在K-13基因有82.4%(28/34)存在137-142位點NN插入，另有點突變為E252Q 、F446I、C469Y、 R539T、P553L、 P574L、H719N，有基因點突變的蟲株均有137-142位點NN插入，與Feng J等[7]報道的中緬邊境惡性瘧原蟲K-13基因變異基本一致，變異主要集中在F446I；而有些報道[8-10]提示東南亞地區K-13 變異主要為C580Y變異。本次實驗未發現A676D，N458Y，P441L等點突變[7，11]，有待于擴大樣本量進一步研究。本試驗發現有K-13基因變異組和無變異組的三種青蒿素類抗瘧藥的IC50值無明顯差異，但 K-13基因變異組的RSA高于未變異組，表明K-13基因變異的瘧原蟲在DHA的壓力下有更高的生存率，提示K-13基因的變異可能與瘧原蟲對青蒿素類藥物的耐藥有關。該研究同時提醒我們，RSA實驗是理想的檢測青蒿素類藥物抗性的方法。

參考文獻：

[1]Kyaw MP, Nyunt MH, Chit K, et al. Reduced susceptibility ofPlasmodiumfalciparumto artesunate in Southern Myanmar[J]. Plos One,2013,8(3): e57689. DOI: 10.1371/journal. Pone. 0057689

[2]Denis MB, Tsuyuoka R, Poravuth Y, et al. Surveillance of the efficacy of artesunate and mefloquine combination for the treatment of uncomplicated falciparum malaria in Cambodia[J]. Trop Med Int Health,2006, 11(9): 1360-1366. DOI: 10.1111/j.1365-3156.2006.01690.x

[3]Trager W，Jensen JB．Human malaria parasites in continous culture[J]．Science，1976，193(4254)：673-675. DOI:10.1645/0022-3395(2005)091[0484:HMPICC]2.0.CO;2

[4]Cui L, Wang Z, Miao J,et al. Mechanisms ofinvitroresistance to dihydroartemisinin inPlasmodiumfalciparum[J]. Mol Microbiol, 2012,86(1): 111-128. DOI:10.1111/j.1365-2958.2012.08180.X

[5]Codd A,Teuscher F,Kyle DE, et al.Artemisinin-induced parasite dormancy: a plausible mechanism for treatment failure[J].Malaria J, 2011, 10(1): 56. DOI: 10. 1186 / 1475-2875-10-56

[6]Shannon TH, Christopher G, Joana C,et al. Independent emergence of artemisinin resistance mutations amonPlasmodiumfalciparumin southeast asia[J]. J Infect Dis, 2014, 211(5):680-688. DOI: 10.1093/infdis/jiu491

[7]Feng J, Zhou D, Lin Y, et al . Amplification of pfmdr1, pfcrt,pvmdr1 and K13-propeller polymorphism associated withPlasmodiumfalciparumandPlasmodiumvivaxat the China-Myanmar border [J]. Antimicrob Agents Chemother 2015,59(5):2554-2559. DOI : 10 .1128/ AAC .04843-14

[8]Ashley EA, Dhorda M, Fairhurst RM,et al.Spread of Artemisinin resistance inPlasmodiumfalciparummalaria[J]. N Engl J Med, 2014,371(5):1099-1104. DOI: 10.1056/NEJMoa1314981

[9]Nyunt MH, Hlaing T, Oo HW,et al. Molecularassessment of artemisinin-resistance markers, polymorphisms in the K13propeller and a multidrug-resistance gene, in eastern and western borderareas of Myanmar [J]. Clin Infect Dis, 2015,60(8):1208-1215. doi: 10.1093/cid/ciu1160

[10]Takala-Harrison S, Jacob CG, Arze C, et al. Independent emergence of artemisinin resistance mutations amongPlasmodiumfalciparumin Southeast Asia [J]. J Infect Dis,2015,211(5):670-679. DOI:10.1093/infdis/jiu491

[11]Tun KM, Imwong M, Lwin KM,et al. Spread ofartemisinin-resistantPlasmodiumfalciparumin Myanmar: a cross-sectional survey of the K13 molecular marker [J]. Lancet Infect Dis, 2015：15(5):415-421.DOI:10.1016/S1473-3099(15)70032-0

DOI:10.3969/j.issn.1002-2694.2016.03.002

通訊作者：楊照青， Email:zhaoqingy92@hotmail.com

中圖分類號：R382.3

文獻標識碼：A

文章編號：1002-2694(2016)03-0219-05

Corresponding author:Yang Zhao-qing ,Email: zhaoqingy92@hotmail.com

收稿日期：2015-10-08；修回日期:2016-01-15

In vitro susceptibility of Plasmodium falciparum to artemisinin drugs and K13-propeller polymorphisms at the China-Myanmar border

ZHANG Yan-mei1,2,3,WU Yan-rui4,HU Yue5,WANG Li-qiong1,RUAN Yong-hua5,MA Ning1,LI Si-man6,WANG Ying-na1,JIA Dan-dan1,XIANG Zheng1，YANG Zhao-qing1

(1.DepartmentofParasitology,KunmingMedicalUniversity,Kunming650500,China;2.DepartmentofInfectiousDiseases,theFirstAffiliatedHospitalofKunmingMedicalUniversity,Kunming650032,China;3.YunnanProvincialCollaborativeInnovationCenterofPublicHealthandDiseasePreventionandControl,Kunming650031,China;4.TheDepartmentofcellBiologyandMedicalGenetics,KunmingMedicalUniversity,Kunming650500,China;5.TheDepartmentofPathologyandPathophsiology,KunmingMedicalUniversity,Kunming650500,China;6.TheDepartmentofBiochemistryandMolecularBiology,KunmingMedicalUniversity,Kunming650500,China)

Abstract:This study aims to evaluate drug resistance mechanism to artemisinin derivatives in Plasmodium falciparum. The parasites of patients collected from the China-Myanmar border from 2008 to 2010 were cultured in vitro，and DNAs were extracted. The full-length of K13 gene was sequenced in all samples using polymerase chain reaction and direct sequencing methods. To measure drug susceptibilities in artesunate (AS), dihydroartemisinin (DHA) and artemisinin (ART) , we calculated the 50% inhibitory concentrations (IC50s). Parasites were exposed to high-dose of dihydroartemisinin in ring stage for 6 hours, and the survival rates of the ring stage (RSA) was calculated after 66 hours. We found that there were no difference in IC50s in patient isolates and Standard strain-3D7, and RSA in parasite isolates was significantly higher than 3D7. Sever point mutations(E252Q F446I C469Y R539T P553L P574L H719N)were identified in 58.8% of the parasite isolates, and F446I mutation predominated in 44.1% of the parasite isolates. NN-insert mutation predominated in 82.4%,the total point mutations were accompanied by NN-insert. All sample were divided into two groups:gene mutation and no-mutation.We found that there were no difference in IC50in gene mutation and no-mutation in K-13, and RSA in parasite isolates with K13 mutations was significantly higher than that in wild-type isolates. This result suggest that K13 mutations were possible correlated with artemisinin resistance.

Keywords:Plasmodium falciparum; artemisinin derivatives; drug resistance; PF3D7_1343700

國家自然科學基金(No.U1202226,81161120421,31260508)和云南省科技廳—昆明醫科大學應用基礎研究聯合專項(No.2015FB034, 2014FB005),昆明醫科大學創新基金(2014-D2)聯合資助；云南公共衛生與疾病防控協同創新中心項目(No.2014YNPHXT05)；云南省自然科學基金(No.2012FB153)，張艷梅,吳艷瑞同等貢獻