弓形蟲ROP18重組腺病毒載體的構建及其對神經干細胞C17.2凋亡的影響

張　賢，甘小鳳，程正陽，都　建，羅慶禮，沈繼龍，余　莉

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弓形蟲ROP18重組腺病毒載體的構建及其對神經干細胞C17.2凋亡的影響

張賢1,2，甘小鳳1,2，程正陽1,2，都建3，羅慶禮1,2，沈繼龍1,2，余莉1,2

1.安徽醫科大學病原生物學教研室，合肥230032；2.人獸共患病安徽省重點實驗室，合肥230032；3.安徽醫科大學生物化學教研室，合肥230032

摘要：目的構建弓形蟲棒狀體蛋白ROP18重組腺病毒載體，研究其對神經干細胞C17.2凋亡的影響。方法將弓形蟲ROP18從PEGFP-G2-ROP18重組質粒上亞克隆至腺病毒載體pHBAd-MCMV-GFP，重組腺病毒載體pHBAd-MCMV-GFP- ROP18經PCR、測序鑒定正確后，與骨架質粒pHBAd-BHG共轉染HEK293細胞進行包裝，收獲、擴增重組腺病毒并對其滴度進行測定。以MOI=70的重組腺病毒感染神經干細胞C17.2，轉染不同時間熒光顯微鏡觀察基因的表達情況。轉染48 h用CCK-8法檢測C17.2的增殖情況；轉染24 h采用Annexin V-APC/PI雙染流式細胞術檢測細胞凋亡情況；Western blot法檢測半胱天冬氨酸蛋白酶3(caspase-3)的蛋白水平。結果重組ROP18過表達腺病毒在C17.2神經干細胞內能有效表達。轉染48 h，與空載體對照組相比，C17.2細胞增殖活性明顯降低(P<0.05)；轉染24 h，流式細胞術檢測結果顯示，ROP18基因轉染組C17.2細胞凋亡率明顯增加(P<0.001)；Western blot檢測顯示caspase-3活性片段的表達明顯增加(P<0.05)。結論成功構建了弓形蟲ROP18重組腺病毒并在神經干細胞C17.2中表達，ROP18重組腺病毒能誘導C17.2神經干細胞凋亡。

關鍵詞：剛地弓形蟲；棒狀體蛋白18；神經干細胞C17.2；重組腺病毒；細胞凋亡

剛地弓形蟲(Toxoplasmagondii)簡稱弓形蟲，是頂復門的專性細胞內寄生原蟲，宿主范圍廣泛[1]，嚴重危害人類健康及畜牧業的發展。弓形蟲是人類重要的生物致畸因子之一，先天性感染可侵犯腦、眼、心、肺和肌肉等器官組織，引起嬰兒小頭畸形、腦積水和脈絡膜視網膜炎等嚴重癥狀[2]。在上述器官中，中樞神經系統是最易受侵犯的部位，先天性弓形蟲病的神經病理主要表現為大腦皮質發育不全[3-4]。神經干細胞(neural stem cells，NSCs)經過增殖和分化后，形成具有各種功能的神經細胞，在大腦皮質形成的過程中發揮重要作用，任何干擾NSCs正常增殖的因素均可阻礙大腦皮質的正常發育[5]。因此，研究弓形蟲對NSCs的影響對于揭示弓形蟲腦病的發病機制及制定相應的防治策略，具有重要意義。

棒狀體是頂復合門原蟲一種重要的分泌器，在入侵宿主細胞過程中分泌的棒狀體蛋白(rhoptry proteins，ROPs)[6]對感染至關重要。弓形蟲棒狀體蛋白18(ROP18)為ROP2蛋白家族成員，具有絲氨酸-蘇氨酸蛋白激酶活性，是弓形蟲重要的毒力決定因子，定位于宿主納蟲泡膜(parasitophorous vacuole membrane,PVM)上[7]，參與控制弓形蟲在細胞內的增殖。

我們在前期的研究中發現，弓形蟲與C17.2神經干細胞共培養或以弓形蟲排泄分泌抗原(excreted/secreted antigens，ESAs)[8-9]刺激C17.2神經干細胞，均能誘導C17.2細胞的凋亡。而弓形蟲ROP18作為蟲體的一個具有激酶活性的重要毒力分子，是否會對神經干細胞的增殖和凋亡產生影響尚不明確。鑒于此，我們構建了ROP18重組腺病毒，研究其對神經干細胞的影響。

1材料與方法

1.1實驗動物、蟲株、細胞株與質粒清潔級5周齡昆明小鼠，雌雄不限，由安徽醫科大學實驗動物中心提供；弓形蟲RH株速殖子由本室液氮保種，復蘇后腹腔接種昆明小鼠傳代；C17.2神經干細胞系由Dr. Evan Y. Snyder饋贈(The Burnham Institute for Medical Research; La Jolla, CA, USA)；293A人胚腎細胞由本室保存；PEGFP-G2-ROP18質粒由安徽醫科大學都建教授饋贈。

1.2主要試劑和儀器載體pHBAd-MCMV-GFP(Hanbio公司)；DMEM培養基(美國Hyclone公司)；胎牛血清(杭州四季青生物工程有限公司)；馬血清(美國Gibco 公司)；轉染試劑Lipofiter2000(美國life公司)；CCK-8細胞增殖及細胞毒性檢測試劑盒(上海貝博bestbio公司)；Annexin V-APC/PI細胞凋亡檢測試劑盒(凱基KeyGEN BioTECH公司)；兔抗人半胱天冬氨酸蛋白酶3(cysteine aspartate specific protease3,Caspase-3)抗體(美國Cell Signaling Technology公司)；小鼠抗人β-actin 抗體(美國Cell Signaling Technology公司)；BCA蛋白定量試劑盒、Western一抗稀釋液(江蘇碧云天公司)；流式細胞儀(美國BD公司)；化學發光成像系統(上海歐翔科學儀器有限公司)。

1.3ROP18重組腺病毒的構建

1.3.1ROP18基因擴增設計1對針對ROP18基因的特異性引物并加入酶切位點(pHBAd-MCMV-GFP載體用NotI和NsiI雙酶切)，以PEGFP-G2-ROP18質粒作為擴增模板擴增ROP18全長。引物序列：上游引物：5′-ATTAGCGGCCGCATGTTTTCGGTACAGCGGCCA-3′，下游引物：5′-ACACATGCATTTATTCTGTGTGGAGATG-3′，反應參數為：94 ℃預變性5 min，94 ℃變性30 s，55 ℃退火30 s，72 ℃延伸90 s，3步組成25個循環，最后72℃延伸10 min。PCR產物用1.5%瓊脂糖凝膠電泳鑒定，而后用Axygen公司回收試劑盒回收，紫外測定濃度。

1.3.2產物定向連接到pHBAd-MCMV-GFP載體的鑒定pHBAd-MCMV-GFP載體和ROP18-PCR產物分別用NotI和NsiI雙酶切，切膠回收后，以載體100-200 ng、目的片段20 μL的比例在16 ℃連接過夜，然后轉化DH5a感受態細胞，涂布于氨芐青霉素抗性的LB平板，挑可疑菌落先行PCR鑒定，再送上海桑尼生物技術有限公司測序。

1.3.3ROP18重組腺病毒的包裝、擴增和純化將293A細胞接種于60 mm培養皿，置37 ℃含5% CO2的培養箱中培養過夜。待細胞生長至底面積的70%～80%時，將pHBAd-MCMV-GFP-ROP18重組腺病毒載體質粒與骨架質粒pHBAd-BHG共轉染至293A細胞。轉染6 h,更換新鮮的細胞培養液,待細胞大部分病變后(約2～3 d)并從底部脫落進行收毒。將60 mm培養皿中所有細胞及培養液收于15 mL離心管中。打開恒溫水浴鍋至37 ℃，將15 mL離心管在液氮及37 ℃水浴反復凍融3次。于離心機離心3 000 r/min 5 min，收集含病毒的上清液，棄沉淀。該上清即為ROP18重組腺病毒，放于-80 ℃保存備用。

1.3.4ROP18重組腺病毒的滴度測定采用改良的TCID50進行測定：在96孔細胞培養板中以1×105/mL的濃度接種293A細胞，100 μL每孔，12孔為一組，共8組，重復一次。待24 h細胞貼壁以后，將病毒稀釋液從1×106加到1×1013，共8個稀釋度，每個稀釋度加10孔，其余2孔為陰性對照， 37 ℃ CO2培養箱中培養10 d，逐日觀察細胞狀況，并在第10 d用顯微鏡觀察每孔CPE情況，記錄每排樣品的陽性孔數。對于100 μL樣品，滴度T=101+d(s-0.5)，其中d=log10稀釋度，s=陽性比率之和(即從第一個10倍稀釋度算起有CPE出現的陽性孔數)。再將TCID50/mL轉換成PFU/mL：TCID50/mL=0.7PFU/mL，兩次重復實驗得到的滴度值應相差≤100.7。

1.4C17.2神經干細胞的培養C17.2神經干細胞的培養參照Evan Y. Snyder教授實驗室所用標準操作流程[10]。用含10%胎牛血清，5%馬血清，100 U/mL青/鏈霉素的DMEM完全培養液(培養液使用一周后補加1%谷氨酰胺)培養，細胞融合至90%左右傳代。PBS洗兩遍后，胰酶細胞消化液消化2 min，含血清的完全培養液3 mL終止消化，吹打使分散均勻，最多1∶10傳代。

1.5ROP18重組腺病毒轉染C17.2神經干細胞將對數生長期的C17.2神經干細胞制成1×105/mL單細胞懸液接種于6孔板，每孔2 mL，培養24 h待細胞貼壁后，PBS洗兩遍。按照感染復數為1∶70轉染含有ROP18重組腺病毒、腺病毒空載體(對照)至C17.2中，培養24、48、72、96 h后觀察病毒的轉染效率。

1.6CCK-8法檢測細胞增殖將1×105/mL的C17.2神經干細胞加入96孔細胞培養板，每孔100 μL，分為4組，每組5個復孔，37 ℃、5%CO2培養箱中培養24 h，棄去培養液，PBS洗兩遍。前兩組分別加入ROP18重組腺病毒、腺病毒空載體對照(MOI為70)，后兩組為細胞對照組和空白對照組。腺病毒轉染48 h，各孔棄一半液體，加CCK-8 溶液10 μL，在溫箱中孵育2 h至肉眼顏色改變后，用酶標儀測定每孔450 nm波長光密度(optical density, OD)值，各組重復實驗3次。

1.7Annexin V-APC/PI雙染檢測細胞凋亡將對數生長期的C17.2神經干細胞制成1×105/mL單細胞懸液接種于6孔板，每孔2 mL，培養24 h待細胞貼壁后，PBS洗兩遍，加入MOI為70的ROP18重組腺病毒及腺病毒空載體，培養液換成5%胎牛血清，2.5%馬血清的DMEM完全培養液。轉染24 h用細胞刮收集貼壁細胞至10 mL離心管。用冷PBS洗滌細胞2次，離心800 r/min，4 ℃，10 min，棄培養液，收集細胞，加入500 μL的Binding Buffer 懸浮細胞，再加入5 μL Annexin V-APC混勻后，4 ℃避光，反應15 min。用PBS洗滌細胞一次，離心2 000 r/min，5 min后，用PBS重懸細胞，上流式儀前5 min加入5 μL PI染液混勻后室溫避光孵育5 min。1 h內上流式細胞儀檢測，每組實驗重復3次。FCS express 4軟件分析細胞凋亡率。

1.8 Western blot法檢測蛋白表達收集重組腺病毒ROP18、腺病毒空載體及細胞對照組的貼壁細胞，用PBS洗2次，離心800 r/min，10 min，棄上清，每管加100 μL細胞總蛋白裂解液(99.5 μL強裂解液RIPA+0.5 μL蛋白酶抑制劑PMSF)，冰上孵育20 min后離心12 000 r/min，4 ℃，10 min，取上清液，此即為細胞總蛋白。每次各組取30 μL蛋白上樣緩沖液在SDS-PAGE凝膠中電泳，200 mA恒流轉膜90 min，PVDF膜放入含5%脫脂奶粉的PBST封閉2 h，棄封閉液，PBST洗滌3次，加入按1∶1 000稀釋的caspase-3一抗，4℃孵育過夜，PBST洗3次后加HRP標記的山羊抗兔IgG二抗，室溫孵育2 h，PBST洗滌3次，ECL法顯色，照相并分析結果。每組實驗重復3次。

1.9統計學分析文中處理的數據結果均以均數±標準差形式表示。用t檢驗分析兩組數據間的統計學差異，用方差分析分析兩組以上數據間的統計學差異。t檢驗P<0.05表示差異具有統計學意義，方差分析P<0.05表示差異具有統計學意義。

2結果

2.1pHBAd-MCMV-GFP- ROP18重組腺病毒載體的鑒定重組子的鑒定結果見圖1。7個克隆經PCR鑒定均檢測到約1.6 kb的條帶，與目的DNA的長度符合。陽性克隆經上海桑尼生物技術有限公司測序與PEGFP-G2-ROP18載體序列100%吻合。

泳道1: DNA Marker；泳道2-8：不同重組子PCR鑒定結果

Lane 1: DNA Marker;Lane2-8: PCR products of different recombinants monoclonal identification.

圖1單克隆PCR鑒定結果

Fig.1Identification of recombinants using PCR

2.2ROP18重組腺病毒在293A細胞中的擴增及滴定將ROP18重組腺病毒轉染至293A細胞中,每天觀察細胞病變情況，約2～3 d，光鏡下可見細胞變圓、變大，呈葡萄狀，并在72 h左右漂起。改進的TCID50法測定重組腺病毒的滴度為1×106PFU/mL。ROP18重組腺病毒在293A細胞中的表達情況見圖2。

A:熒光顯微鏡照片；B:明場對照

A: fluorescence expression; B: field control

圖2ROP18重組腺病毒在293A細胞內的表達情況

Fig.2The 293A cell transfected by ROP18 recombinant adenovirus

2.3ROP18重組腺病毒在神經干細胞C17.2上的表達將ROP18重組腺病毒轉染至C17.2神經干細胞，用熒光顯微鏡觀察分別在轉染24、48、72、96 h檢測目的基因的表達情況。通過觀察可見C17.2細胞在轉染24、48 h時大約50%～70%表達綠色熒光蛋白，且細胞形態正常。

2.4ROP18重組腺病毒對C17.2細胞的增殖抑制作用CCK-8法檢測結果顯示(圖4)：ROP18重組腺病毒組細胞增殖活力為(58.13±7.373)%，較腺病毒對照組(85.34±6.092)%及細胞對照組(81.51±3.415)%均有明顯的下降(P<0.05)。

2.5ROP18重組腺病毒誘導C17.2神經干細胞的凋亡流式細胞術檢測結果顯示：ROP18重組腺病毒組細胞凋亡率為(31.07±10.05)%，較腺病毒對照組(2.707±0.050 44)%及細胞對照組(0.777 5±0.052 50)%均有明顯的下降(P<0.000 1)。

A:轉染24 h、B:轉染48 h、C:轉染72 h、D:轉染96 h熒光表達與明場細胞的合圖情況

A: within 24 h; B: 48 h; C: 72 h; D: 96 h.

圖3ROP18重組腺病毒在C17.2神經干細胞內的表達情況

Fig.3C17.2 neural stem cells cell transfected by ROP18 recombinant adenovirus

注:*P<0.05

Western blot檢測結果顯示：ROP18重組腺病毒轉染組，C17.2神經干細胞內的caspase-3蛋白的表達量(0.519 7±0.064 81)較腺病毒空載體對照(0.177 7±0.093 08)和細胞對照組(0.034 0±0.013 53)均有明顯升高。

3討論

弓形蟲作為人獸共患病的病原體，可以入侵所有的有核細胞，孕婦感染弓形蟲后會造成胎兒的畸形、流產或死胎。國內外的文獻資料[11-13]顯示弓形蟲感染有嗜中樞性，對于中樞神經系統修復來說神經干細胞是一個有力的工具，而在成年哺乳動物腦特定區域內多功能干細胞的數量是有限的[14]。鑒于此，我們選擇了C17.2神經干細胞系作為研究對象，此細胞是小鼠小腦祖細胞內所形成的永生化細胞系，具有神經干細胞的所有特征，是目前研究移植治療神經系統疾病的神經干細胞較好的細胞系[15-16]。有研究表明弓形蟲的排泄分泌抗原ESAs[17]對神經干細胞C17.2有促凋亡的作用，而ROP18蛋白作為ESAs中重要的蛋白分子，是否對神經干細胞C17.2有直接的誘導凋亡的作用尚不明確。

注:***P<0.01

注:*P<0.05,**P<0.01

本實驗選擇MOI=70的ROP18重組腺病毒轉染C17.2神經干細胞。CCK-8法檢測轉染48h的細胞增殖能力，結果顯示，ROP18重組腺病毒組相對于細胞對照組、腺病毒空載體組能夠明顯的抑制神經干細胞C17.2的增殖活力。同時，用流式細胞術檢測轉染24 h細胞凋亡的情況，結果顯示，ROP18重組腺病毒組C17.2神經干細胞的早期細胞凋亡率有明顯升高。Caspase-3是凋亡信號通路中一個重要的蛋白酶，也是凋亡的關鍵執行分子，在凋亡的早期階段，它被激活[18]。本研究采取定量的WB測定ROP18重組腺病毒刺激細胞24 h的細胞凋亡蛋白caspsae-3的表達量，結果顯示ROP18重組腺病毒caspase-3被激活并且表達量明顯高于其他兩組。上述結果表明ROP18重組腺病毒可以誘導神經干細胞C17.2的凋亡。

Wang等人[8]研究發現ESAs可以通過內質網應激信號通路(endoplasmic reticulum stress, ERS)來介導細胞的凋亡，在此次實驗中選用的是感染弓形蟲速殖子小鼠的原代神經干細胞。Zhou等人[9]將前期實驗進一步優化，研究對象轉為神經干細胞系C17.2，發現同樣通過ERS途徑來介導細胞的凋亡。在本實驗中我們發現ROP18重組腺病毒可以介導C17.2的凋亡，但是否同樣通過ERS信號通路來發揮促凋亡的作用有待于進一步的研究和驗證。

綜上所述，本研究成功構建了ROP18重組腺病毒并轉染神經干細胞C17.2，結果表明ROP18蛋白對神經干細胞C17.2有促凋亡的作用。該研究對于明確弓形蟲致中樞神經系統的損傷機制有著重要的意義。

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DOI:10.3969/j.issn.1002-2694.2016.03.005

通訊作者：余莉，Email:lilyyu33@126.com

中圖分類號：R382.5

文獻標識碼：A

文章編號：1002-2694(2016)03-0234-06

Corresponding author:Yu Li, Email:lilyyu33@126.com

收稿日期：2015-07-15；修回日期:2015-12-08

Construction of Toxoplasma ROP18 recombinant adenovirus vector and its effect on the apoptosis of C17.2 stem cells

ZHANG Xian1,2,GAN Xiao-feng1,2,CHENG Zheng-yang1,2,DU Jian3,LUO Qing-li1,2,SHEN Ji-long1,2,YU Li1,2

(1.DepartmentofMicrobiologyandParasitology,AuhuiMedicalUniversity,Hefei230032，China;2.AnhuiKeyLaboratoryofZoonoses,AuhuiMedicalUniversity,Hefei230032,China;3.DepartmentofBiochemistry,AuhuiMedicalUniversity,Hefei230032,China)

Abstract:To study the effect of Toxoplasma rhoptry kinase 18 (ROP18) on the apoptosis of C17.2 neural stem cells, Toxoplasma gondii ROP18 was subcloned from PEGFP-G2-ROP18 into pHBAd-MCMV-GFP. The recombinant adenovirus vector pHBAd-MCMV-GFP-ROP18 was comfirmed by PCR and sequencing, and the identified recombinant adenovirus vector was transfected into 293 cells for packaging with skeleton plasmid. After amplification, ROP18 recombinant adenovirus (MOI=70) was transfected into C17.2 neural stem cell. The proliferation of C17.2 cells at 48 horus Post-treatment was detected using CCK-8 kit and the apoptosis of C17.2 cells at 24 hours Post-treatment was detected by flow cytometer. Western blot was used to determine the expression levels of caspase-3. ROP18 recombinant adenovirus was expressed effectively in C17.2 neural stem. Compared with the control group, proliferation of C17.2 cells was significantly decreased (P<0.05) in the ROP18 recombinant adenovirus group at 48 hours while the apoptosis of C17.2 cells was significantly increased in the ROP18 recombinant adenovirus (P<0.001) at 24 hours Post treatment and the caspases-3 expression levels was significantly increased (P<0.05). ROP18 recombinant adenovirus was successfully constructed and was highly expressed in C17.2 neural stem cells. ROP18 recombinant adenovirus induced the apoptosis of C17.2 neural stem cells.

Keywords:Toxoplasma gondii; rhoptry protein 18; neural stem cells C17.2; Toxoplasma ROP18 recombinant adenovirus; cell apoptosis Supported by the National Natural Science Foundation of People’s Republic of China (No.81572022) and the program for Excellent Talents in Anhui Medical University (No.0113014104)

國家自然科學基金(No. 81572022)資助;安徽醫科大學青年拔尖人才支持計劃項目(No.0113014104)資助