大腸桿菌O157∶H7對氟苯尼考耐藥機制的初步研究

馮世文，李　軍，曾　蕓，楊　威，陳澤祥，潘艷，彭　昊

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大腸桿菌O157∶H7對氟苯尼考耐藥機制的初步研究

馮世文1,2,3，李軍2,3，曾蕓1，楊威2,3，陳澤祥2,3，潘艷2,3，彭昊2,3

1.廣西大學動物科學技術學院，南寧530005；2.廣西獸醫研究所，南寧530001；3.廣西畜禽疫苗新技術重點實驗室， 南寧530001

摘要：目的研究大腸桿菌O157∶H7(E. coli O157∶H7)對氟苯尼考耐藥性產生的機制。方法本研究采用亞抑菌濃度體外耐藥誘導的方法將E. coli O157∶H7誘導成為氟苯尼考高度耐藥菌株，采用無抗生素壓力下連續傳代培養或SDS方法將耐藥菌株的氟苯尼考耐藥性消除，使用PCR方法檢測氟苯尼考耐藥基因floR，通過外排泵抑制劑與氟苯尼考聯合使用，檢測E. coli O157∶H7是否存在對氟苯尼考的主動外排作用。結果經過36代的耐藥誘導，敏感菌株對氟苯尼考產生了高度耐藥(MIC為256 μg/mL)。質粒檢測結果顯示，耐藥誘導菌株出現2個質粒，大小分別約為3 500 bp和1 200 bp，floR基因位于質粒DNA中。經連續傳代培養或SDS法進行耐藥消除，耐藥誘導菌株對氟苯尼考的敏感性提高，但其質粒和floR基因均未丟失。結論E. coli O157∶H7氟苯尼考敏感菌和耐藥菌均存在對氟苯尼考的質子驅動型外排泵和ATP水解依賴型外排泵主動外排作用。

關鍵詞：大腸桿菌O157∶H7；氟苯尼考；耐藥性；floR基因

Supported by the Science and Technology Major Projects of Guangxi (No. 14121003-4-1), the Guangxi Natural Science Foundation (No. 2013GXNSFAA019093), and the Scientific Research Projects of Guangxi Aquatic Animal Husbandry and Veterinary Bureau (No. 201528005)

大腸桿菌O157∶H7(EscherichiacoliO157∶H7，E.coliO157∶H7)是一種人獸共患病原菌，致病力強，可以在畜禽中流行和傳播并通過食源性途徑感染人，引起腹瀉、出血性腸炎，極易繼發溶血性尿毒綜合癥和血栓性血小板減少性紫癜等并發癥[1-2]。氟苯尼考是獸醫臨床上治療細菌性疾病的新型動物專用抗菌藥物[3]，主要是通過與細菌70S核蛋白體的50S亞基上的A位點結合，抑制細菌肽酰基轉移酶的轉肽反應，使得肽鏈無法延伸從而抑制細菌蛋白質的合成，達到抗菌的效果[4]。氟苯尼考是獸醫臨床上治療E.coliO157∶H7的有效抗生素，但是氟苯尼考的長期廣泛和不科學使用，E.coliO157∶H7對氟苯尼考的耐藥性增強，對公共衛生防治E.coliO157∶H7帶來不利的影響。目前的研究表明，革蘭氏陰性菌主要通過floR基因編碼的外排泵蛋白特異性將體內的氟苯尼考泵出體外，降低細菌體內氟苯尼考的濃度，阻礙氟苯尼考發揮抑制細菌蛋白質合成的作用[5]。

為了解E.coliO157∶H7對氟苯尼考的耐藥機制，本研究通過亞抑菌濃度體外耐藥誘導法，將對氟苯尼考高度敏感的E.coliO157∶H7誘導成高度耐藥菌株，以氟苯尼考敏感株和耐藥株為受試菌，進行耐藥質粒和耐藥floR基因檢測分析、外排泵作用、耐藥消除等方面研究，為合理使用抗菌藥物，減緩耐藥菌產生，以及更好的改進抗菌藥物活性提供參考。

1材料和方法

1.1試驗菌株豬源E.coliO157：H7 RS2和FC1菌株由廣西獸醫研究所細菌研究室分離、鑒定、保存，菌株攜帶志賀樣毒素2(Stx2A)和緊密黏附素基因(EaeA)，對小白鼠有較強致病力[6]。質控菌株大腸桿菌ATCC25922購自中國獸醫藥品監察所。

1.2主要試劑MHA和MHB培養基購自北京陸橋技術有限責任公司；氟苯尼考原粉(含量99.9%)，由廣西大學動物科學技術學院獸醫藥理與毒理學實驗室提供；二甲基亞砜(DMSO)購自國藥集團化學試劑有限公司。細菌基因組DNA提取試劑盒、高純度質粒小提試劑盒、2×TaqPCR Master Mix購自北京康為世紀生物科技有限公司；supercoiled DNA ladder Marker購自寶生物(大連)生物工程有限公司；DNA標準Marker購自廣州東盛生物科技有限公司；十二烷基磺酸鈉(SDS)購自北京索萊寶生物科技有限公司；羥基氰氯苯腙(CCCP)購自SIGMA公司；注射用奧美拉唑鈉購自海南中化聯合制藥工業有限公司；利血平注射液購自廣東邦民制藥廠有限公司。

1.3最小抑菌濃度(MIC)測定以大腸桿菌ATCC25922為質控菌，按照NCCLS (2009)[7]推薦的標準微量肉湯稀釋法測定氟苯尼考對E.coliO157∶H7 RS2和FC1菌株的MIC。

1.4體外耐藥誘導參照文獻[8]的方法，通過亞抑菌濃度的含氟苯尼考MHA培養基體外將E.coliO157∶H7 RS2和FC1菌株誘導成氟苯尼考耐藥菌株。

1.5質粒檢測提取E.coliO157：H7耐藥誘導前后菌株的質粒，采用瓊脂糖凝膠電泳方法檢測菌株是否攜帶質粒。

1.6floR基因檢測參照文獻[9]合成氟苯尼考耐藥floR基因檢測引物，以提取的E.coliO157∶H7的質粒DNA和純化的基因組DNA為模板，PCR方法檢測floR基因。

1.7耐藥消除試驗將體外耐藥誘導獲得的E.coliO157∶H7氟苯尼考耐藥菌株在無氟苯尼考壓力的MHA培養基上連續傳代培養至200代，測定氟苯尼考對傳代培養的菌株MIC，觀察耐藥菌株是否恢復對氟苯尼考敏感以及質粒DNA和floR基因是否丟失。

參照文獻[10]使用質粒消除劑SDS對高度耐藥的E.coliO157∶H7進行質粒消除，分析質粒丟失與E.coliO157∶H7對氟苯尼考敏感性是否相關。

1.8氟苯尼考外排泵的表型檢測通過測定CCCP、奧美拉唑鈉和利血平3種外排泵抑制劑分別存在的情況下，氟苯尼考對E.coliO157∶H7氟苯尼考耐藥誘導前后的菌株MIC是否發生改變，來判定E.coliO157∶H7對氟苯尼考是否存在主動外排作用。參照李軍[8]報道的方法進行試驗。

2結果

2.1氟苯尼考對E.coliO157∶H7的MIC采用微量肉湯稀釋法測定了氟苯尼考對E.coliO157∶H7 RS2和FC1菌株的MIC，都為4 μg/mL，兩菌株對氟苯尼考敏感。

2.2E.coliO157∶H7的耐藥誘導經體外耐藥誘導16代后，E.coliO157∶H7 RS2和FC1菌株對氟苯尼考由敏感(MIC為4 μg/mL)變為耐藥(MIC≥32 μg/mL)，繼續誘導之后，兩個菌株對氟苯尼考產生了高度耐藥(MIC為256 μg/mL)，為方便使用，將高度耐藥菌株分別標記為RS2-256和FC1-256。

將RS2-256和FC1-256菌株在MHA培養基連續傳代培養至30代，氟苯尼考對各傳代菌株的MIC沒有改變，表明人工體外誘導獲得的E.coliO157∶H7在連續傳30代內，其對氟苯尼考的耐藥性穩定。

圖1　氟苯尼考對大腸桿菌O157∶H7耐藥誘導菌株的MIC

Fig.1The MIC of florfenicol against E. coli O157∶H7 after in vitro induced resistance

2.3質粒檢測 以提取的E.coliO157∶H7氟苯尼考耐藥誘導前后菌株的質粒DNA進行瓊脂糖凝膠電泳，結果顯示，E.coliO157∶H7耐藥誘導前的RS2和FC1菌株(MIC為4 μg/mL)沒有檢測到質粒(圖2)，而經耐藥誘導后的菌株(MIC≥8 μg/mL)均檢測到兩個質粒帶，大質粒約為3 500 bp，小質粒約為1 200 bp(圖2)。

M：超螺旋 DNA ladder Marker；M3：DNA Marker3；1：耐藥誘導前菌株質粒；2-10為耐藥誘導后氟苯尼考MIC為8 μg/mL、8 μg/mL、16 μg/mL、32 μg/mL、64 μg/mL、64 μg/mL、128 μg/mL、128 μg/mL、256 μg/mL、256 μg/mL的菌株的質粒。

M: supercoiled DNA ladder Marker; M3: DNA Marker3; 1: plasmid of sensitive strain RS2; 2-10: plasmid of strains whichinvitroresistance induced.

圖2大腸桿菌O157∶H7氟苯尼考耐藥誘導前后菌株的質粒電泳圖

Fig.2Gel electrophoresis of plasmid of E. coli O157∶H7 before and after resistance induced

2.4floR基因檢測分析以E.coliO157∶H7 RS2和FC1菌株，及其耐藥誘導菌株的質粒和純化的基因組DNA為模板，進行floR基因的PCR檢測。結果顯示，用于RS2和FC1菌株的質粒和基因組DNA均未檢測到floR基因，而在耐藥誘導后菌株的質粒中檢測到floR基因，基因組DNA中未檢測到floR基因，表明E.coliO157∶H7攜帶的floR基因位于耐藥菌的質粒中。

2.5大腸桿菌O157∶H7氟苯尼考耐藥菌株耐藥消除試驗

2.5.1連續傳代培養消除耐藥對氟苯尼考高度耐藥的E.coliO157∶H7 RS2-256和FC1-256菌株在去除氟苯尼考壓力的MHA培養基上連續傳代培養至185代，氟苯尼考對傳代菌株的MIC從256 μg/mL降至8 μg/mL，菌株恢復對氟苯尼考敏感，之后從第185代至第200代，MIC維持在8 μg/mL(圖4)。然而，傳代培養菌株的質粒DNA和floR基因未缺失。

圖3腸桿菌O157∶H7高度耐藥菌株連續傳代培養后MIC的變化

Fig.3Change of MIC of florfenicol against E. coli O157∶H7 which continuously subculture in MHA without florfenicol

2.5.2SDS-溫度交替法消除質粒以亞抑菌濃度SDS(1 500 μg/mL)-溫度交替法進行RS2-256和FC1-256菌株的質粒消除試驗，循環培養8代后，氟苯尼考對耐藥菌株的MIC從256 μg/mL降低至64 μg/mL，但菌株未恢復對氟苯尼考敏感，菌株的質粒和floR基因未缺失，但是相同菌量提取的質粒DNA濃度隨菌株MIC的下降而降低。

2.6氟苯尼考外排泵表型檢測

2.6.1外排泵抑制劑對E.coliO157∶H7 RS2和FC1菌株的MICCCCP、奧美拉唑鈉和利血平對受試菌的MIC分別為32 μg/mL、4 000 μg/mL和2 000 μg/mL。

2.6.2外排泵表型檢測結果在1/2 MIC CCCP、奧美拉唑鈉和利血平作用下，氟苯尼考對E.coliO157∶H7氟苯尼考敏感株和耐藥株的MIC均明顯下降(表1)，其中，在1/2 MIC奧美拉唑鈉的作用下，RS2-256菌株對氟苯尼考由耐藥變為敏感，FC1-256菌株對氟苯尼考由耐藥變為中介。試驗結果初步證明了E.coliO157∶H7氟苯尼考敏感株和耐藥株均對氟苯尼考有主動外排作用。

表1　外排泵抑制劑作用下，氟苯尼考對大腸桿菌O157∶H7的MIC

3討論

通過在亞抑菌濃度的抗生素培養基上連續傳代培養誘導細菌產生耐藥是體外誘導細菌耐藥最成熟和最常用的方法[11]。本試驗通過在含1/2 MIC氟苯尼考濃度的MHA培養基上連續傳代培養，原本對氟苯尼考高度敏感的E.coliO157∶H7，對氟苯尼考產生高度耐藥。在1/2 MIC氟苯尼考濃度持續存在下，E.coliO157∶H7敏感菌能適應生長環境，其中的部分菌體發生耐藥突變，可能通過耐藥基因發生位點突變，或者可能是耐藥基因表達量增加，或者可能改變了氟苯尼考作用位點的結構，使得氟苯尼考的抑菌作用失效，當提高培養環境中抗菌藥物的濃度時，這部分耐藥突變菌被選擇性富集，篩選出耐藥菌。E.coliO157∶H7對氟苯尼考的耐藥水平也有一定的局限性，當達到一定水平后，就很難產生更高的耐藥水平，在本實驗中，在達到高耐藥水平(MIC≥128 μg/mL)前，氟苯尼考對菌株RS2、FC1的MIC按照 2倍梯度逐級遞增，之后就很難再增長，需要更多的誘導培養代數，與田淑琴[12]報道的實驗結果相似。

研究證實，氟苯尼考耐藥基因floR編碼的FloR蛋白位于細菌外膜上，是一種氟苯尼考特異性外排泵[13]。本試驗結果顯示，E.coliO157∶H7氟苯尼考敏感菌RS2和FC1菌株均未檢測到質粒以及基因floR，而經耐藥誘導后，MIC ≥8 μg /mL的菌株檢測到分子量大小相似的質粒條帶，并且檢測到基因floR位于該質粒中。此外，而通過去除氟苯尼考壓力連續傳代培養的方法消除氟苯尼考耐藥后，恢復對氟苯尼考敏感的菌株的質粒和floR基因均未丟失。試驗結果提示，攜帶基因floR的質粒有可能就存在于E.coliO157∶H7氟苯尼考敏感菌RS2和FC1菌株中，可能由于PCR敏感性檢測的局限性，未能檢測到floR基因，但是經耐藥誘導后，攜帶質粒表達量增加，基因floR表達量增加，菌株對氟苯尼考產生耐藥，而在去除氟苯尼考壓力下連續傳代培養，其表達量降低，菌株又恢復對氟苯尼考敏感。

細菌對抗菌藥物的主動外排作用是細菌產生耐藥性的一個重要機制[14]。本研究將質子能驅動型外排泵抑制劑CCCP以及 ATP水解依賴型外排泵抑制劑(奧美拉唑鈉和利血平)與氟苯尼考聯合使用，測定E.coliO157∶H7對氟苯尼考的外排表型。試驗結果表明，E.coliO157∶H7氟苯尼考耐藥菌和敏感菌都存在介導對氟苯尼考主動外排的質子能驅動型外排泵和ATP水解依賴型外排泵。除了floR編碼的特異性外排泵，E.coliO157∶H7是否存在能主動外排氟苯尼考的其它特異性外排泵以及(或)多藥物外排泵，后續實驗中將進行檢測證實。

本研究初步證實，E.coliO157∶H7攜帶的氟苯尼考耐藥基因floR位于菌株的質粒中，在氟苯尼考的存在下，floR基因表達量增加，同時可能在其它外排泵的作用下，菌株對氟苯尼考產生耐藥。

細菌耐藥機制是復雜的，除了耐藥基因的突變、表達量改變、藥物作用靶位點改變等方式，生物轉化作用、細胞膜通透性改變、生物膜形成等方式也可導致細菌產生耐藥性[5]。E.coliO157∶H7對氟苯尼考耐藥性的產生是否也通過這些方式實現，需要試驗證實。

E.coliO157∶H7對氟苯尼考的體外耐藥誘導試驗結果和耐藥消除實驗結果提示，獸醫臨床上應避免長期使用同一種或者同一類型抗菌藥物，并注意輪換使用不同作用機制的抗菌藥物，能有效減緩細菌耐藥性的產生。在外排泵表型檢測試驗中，外排泵抑制劑奧美拉唑鈉和利血平都是臨床藥物來源，且試驗中所使用的終濃度都在臨床用藥劑量范圍內，對E.coliO157∶H7外排泵有明顯的抑制作用，試驗結果提示對機體無副作用的外排泵抑制劑和抗菌藥物的聯合應用，不僅為耐藥菌的臨床用藥治療提供了新思路，還能減緩細菌耐藥性的產生，外排泵抑制劑在臨床上具有廣闊的應用前景。

耐藥質粒可以通過轉化、接合轉移方式在同種或不同種細菌中傳播耐藥基因，使得新宿主獲得耐藥性，將耐藥菌株的耐藥質粒消除對于阻止細菌耐藥性傳播和指導臨床用藥治療耐藥菌有重大意義[15]。目前的研究證實，物理方法(紫外線、高溫等)、化學方法(EB、SDS等)、抗生素(如氟喹諾酮類)、中藥等方法都有消除耐藥質粒的作用[16]。本試驗利用化學試劑SDS對氟苯尼考耐藥菌株RS2-256和FC1-256進行耐藥性消除，結果顯示菌株的質粒帶未缺失，對氟苯尼考的敏感性仍很低，即消除效果不理想。盡管通過無氟苯尼考壓力下連續傳代培養，E.coliO157∶H7耐藥菌恢復對氟苯尼考敏感，然而卻需要很長的時間。而質粒消除劑具有快速消除以及可以和抗菌藥物聯合使用的特點，后續將嘗試使用多種質粒消除劑進行質粒消除試驗，以期找到效果理想的質粒消除劑，為獸醫臨床治療對氟苯尼考高度耐藥細菌引起的疾病提供參考。

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DOI:10.3969/j.issn.1002-2694.2016.03.012

通訊作者：曾蕓，Email：yzeng323@163.com

中圖分類號：R378.2

文獻標識碼：A

文章編號：1002-2694(2016)03-0271-05

Corresponding authors: Zeng Yun, Email: yzeng323@163.com; Li Jun, Email: yzeng323@163.com

收稿日期：2015-07-23；修回日期:2016-02-02

Antibiotic resistance mechanism of Escherichia coli O157∶H7 against florfenicol

FENG Shi-wen1,2,3,LI Jun2,3,ZENG Yun1,YANG Wei2,3,CHEN Ze-xiang2,3,PAN-yan2,3,PENG Hao2, 3

(1.CollegeofAnimalScienceandTechnology,GuangxiUniversity,Nanning530005,China;2.GuangxiVeterinaryInstitute,Nanning530001,China;3.GuangxiKeyLaboratoryofAnimalVaccinesandNewTechnology,Nanning530001,China)

Abstract:We investigated the antibiotic resistance mechanism of E. coli O157∶H7 against florfenicol. Two strains of E. coli O157∶H7 which were sensitive to florfenicol were induced to be drug resistant strains by subinhibitory concentration, and the florfenicol resistance was eliminated by continuous subcultured without antibiotic pressure or with SDS. The florfenicol resistance gene floR was detected by PCR, and the efflux pump which efflux florfenicol of E. coli O157∶H7 was detected by combination efflux pump inhibitors with florfenicol. Two strains of E. coli O157∶H7 were obtained antibiotic resistance after 36 times passage culture induced with florfenicol. Results of plasmids detection showed that 2 plasmids with 3 500 bp and 1 200 bp were emerging. The floR was located in the plasmid. The plasmid and the floR of the resistant strains had not been lost after continuous subculture without antibiotic pressure or with SDS, and both florfenicol sensitive strain and resistant strain of E. coli O157∶H7 could efflux florfenicol. This study preliminarily confirmed that the floR and the function of the efflux pump of E. coli O157∶H7 contribute to the florfenicol resistance.

Keywords:E. coli O157∶H7; florfenicol; antibiotic resistance; floR

廣西科技重大專項(桂科重14121003-4-1)；廣西自然科學基金(桂科自2013GXNSFAA019093)；廣西水產畜牧獸醫局科研專項(桂漁牧科201528005)