響應面分析法優選桑寄生總黃酮的提取工藝

陳 睿，楊范莉，張 琳

(1.陜西省寶雞市中醫醫院，寶雞　721001；2.西安交通大學藥學院，西安　710061；3.陜西中醫藥大學，咸陽　712046)

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響應面分析法優選桑寄生總黃酮的提取工藝

陳 睿1，楊范莉2，張 琳3

(1.陜西省寶雞市中醫醫院，寶雞721001；2.西安交通大學藥學院，西安710061；3.陜西中醫藥大學，咸陽712046)

摘要：目的 利用響應面法優化桑寄生總黃酮的提取工藝條件。方法 采用中心組合設計方法，分別研究乙醇體積分數、溶媒用量、提取時間及提取次數對總黃酮提取率的最佳提取工藝條件。結果 最佳提取工藝條件為：體積分數為40%的乙醇，液固比為40∶1，回流提取2次，每次1 h。結論在最佳工藝條件下，桑寄生總黃酮的提取率為1.15%，高于其他條件下的提取率，該工藝條件可為桑寄生總黃酮的工業生產提供依據。

關鍵詞：桑寄生；總黃酮；提取工藝;響應面分析法

桑寄生(Taxillusherba)為桑寄生科植物桑寄生Taxilluschinensis(DC.)，常入藥為干燥葉及莖枝，常寄生于桑、桃、李等多種植物上[1]，分布在我國的西南、中南、華南等地區[2]；具有補腎益肝、祛風除濕、通經安胎等功效，常用于治療腰膝酸軟、筋骨無力、風濕疼痛及胎動等[3-4]。文獻報道，桑寄生中主要含有黃酮和甾體皂苷類化學成分[5-6]，有研究表明，桑寄生提取物有黃酮類化合物、甾體化合物、有機酸、胺類化合物、生物堿和氨基酸等[7-8]，其中黃酮類物質存在于多種植物藥材中，為一類黃色素、次級代謝產物[9]，具有廣泛的藥用價值[10]。但目前對其主要化學成分總黃酮的提取工藝研究未見報道。響應面分析法可以找到最佳點，并靈敏考察各因素之間的交互作用[11]。本實驗運用響應面分析法優化桑寄生總黃酮的提取工藝，以期高產、高效、節能地制備桑寄生總黃酮，為桑寄生總黃酮的工業化生產提供依據。

1儀器與試藥

1.1儀器UV-1102紫外分光光度計(上海天美責任有限公司)；R200D電子分析天平(精度0.1 mg，德國Satorius公司)。

1.2試藥桑寄生藥材，購自咸陽百姓樂大藥房，經陜西中醫藥大學生藥教研室王繼濤高級實驗師鑒定為桑寄生科植物桑寄生的干燥帶葉莖枝；對照品：蘆丁，批號為MUST-14101410；實驗所用試劑均為分析純。

2實驗方法2.1最大吸收波長掃描和蘆丁標準曲線制作稱取蘆丁對照品5.0 mg，用體積分數為60%的乙醇溶解，搖勻，定容至10 mL，即得0.5 mg·mL-1的蘆丁對照品溶液。

吸取0.3 mL蘆丁對照品溶液，采用UV-1102型雙光束紫外-可見分光光度計在400～700 nm范圍內掃描，最終確定其最大吸收波長。

分別吸取蘆丁對照品溶液0.3 mL，置于10 mL試管中，采用硝酸鋁-亞硝酸鈉(Al(NO)3-NaNO2)顯色法進行顯色，在最大吸收波長處測定吸光度，以吸光度A和濃度C進行線性回歸，并繪制蘆丁標準曲線。2.2桑寄生總黃酮得率的計算稱取1.0 g桑寄生，按照常規方法提取后，采用Al(NO)3-NaNO2顯色法進行顯色，根據蘆丁標準曲線，吸光度A計算出黃酮質量的濃度C，即桑寄生總黃酮得率Y，公式為：Y=C×N×V×10-6/m。C：黃酮的質量濃度/g·mL-1；V：濾液的體積/mL；m：樣品的質量/g；N：稀釋倍數。

2.3方法學考察按照 2.2項下提取方法，采用Al(NO)3-NaNO2顯色法分別進行精密度實驗、穩定性實驗、回收率實驗及重復性實驗，對桑寄生總黃酮進行方法學考察研究。2.4單因素實驗按照 2.2項下提取方法，在其他條件不變的情況下，分別進行乙醇體積分數、溶媒用量、提取時間及提取次數對桑寄生總黃酮得率的實驗研究。

2.5響應面法優化實驗以方法學及單因素實驗為基礎，分別考察3個因素(考察因子)，即乙醇體積分數、溶媒量及提取時間，響應值即總黃酮得率Y，采用Design-expert軟件設計即3因素3水平的響應面實驗，由結果最終確定桑寄生總黃酮提取的最佳工藝。

3結果

3.1蘆丁對照品的最大吸收波長與標準曲線采用UV-1102型雙光束紫外-可見分光光度計在400～700 nm 處進行波長掃描，最終確定最大吸收波長為506 nm。故在506 nm波長處測得蘆丁線性回歸方程：Y=10.086X+0.038 4(r=0.999 4)，且蘆丁標準曲線線性關系良好。

3.2方法學考察

3.2.1精密度實驗 稱取桑寄生1.0 g，按照2.2項下提取方法，吸取6份續濾液，分別測定每份的吸光度，并計算RSD，RSD為0.099 6%，結果說明精密度良好。3.2.2穩定性實驗 稱取桑寄生1.0 g，按照2.2項下提取方法，分別在0.5，1，1.5，2，2.5和3 h測定其吸光度。桑寄生顯色后，2 h內吸光度變化不大，表明桑寄生總黃酮顯色后穩定性良好。

3.2.3加樣回收率實驗 稱取桑寄生1.0 g，6份。按照2.2項下方法提取，分別吸取1 mL濾液，依次測定其吸光度，在另外6份濾液中分別加入5 mL蘆丁對照品溶液，再分別測定其吸光度，計算回收率。由表1可知，平均回收率為98.87%，Al(NO)3- NaNO2顯色法測定桑寄生中黃酮的準確度較高。

表1 加樣回收率實驗結果

Tab.1 The results of recovery experiment

取樣量/g原有量/mg蘆丁加入量/mg測得量/mg回收率/%平均回收率/%1.000370.660.0571.6296.198.871.000176.610.0577.61100.298.871.000566.860.0567.89103.298.870.999570.000.0571.01101.298.871.000271.490.0572.4394.598.870.999874.460.0575.4498.098.87

3.2.4重復性提取黃酮實驗結果 稱取桑寄生1.0 g，6份。按照2.2項下提取方法，分別測定其吸光度，并計算RSD。RSD為0.438%，說明桑寄生總黃酮重復性較好。

3.3單因素實驗結果

3.3.1乙醇對桑寄生總黃酮得率的影響 設定條件液固比為40∶1，提取時間為2 h，當乙醇體積分數小于40%時，桑寄生總黃酮得率隨著乙醇體積分數的增加而增大；乙醇體積分數為40%時，桑寄生總黃酮得率達到最大值；乙醇體積分數大于40%時，桑寄生總黃酮得率下降。

3.3.2液固比對桑寄生總黃酮得率的影響 設定條件乙醇體積分數為40%，提取時間為2 h，桑寄生總黃酮得率隨著液固比的增加而升高，當液固比為30∶1時，桑寄生總黃酮的得率達到了最大值，但繼續增加液固比時，總黃酮得率開始下降。3.3.3提取時間對黃酮得率的影響 設定條件乙醇體積分數為40%，液固比為30∶1，當提取時間在0.5～1.5 h時，桑寄生總黃酮得率呈上升趨勢，隨著提取時間的延長，總黃酮得率開始下降。

3.4采用響應面法對桑寄生總黃酮提取工藝的優化

3.4.1合理選取響應面分析因素與水平3因素分別為乙醇體積分數A、液固比B及提取時間C，3因素及3水平設計見表2。

表2 實驗因素水平表

Tab.2 Factors and levels of the designed experiment

水平A,乙醇體積分數/%B,液固比/mL·g-1C,提取時間/h-13030∶10.504040∶11.015050∶11.5

3.4.2響應面分析方案及結果采用Design-Expert軟件對數據擬合并進而建立數學模型，見表3。

表3 響應面分析實驗方案與結果

Tab.3 Experiment program and test results of RSM

實驗號ABCY/%10110.9902-1-100.81031-100.84040001.12051011.1456-10-11.0307-1100.9258-1011.100910-11.0751001-10.830110001.125120001.115130001.130140001.090150-110.895161100.950170-1-10.870

3.4.3方差分析 經Design-Expert 8.05軟件對實驗數據進行方差分析，見表4。從表4可以看出，模擬失擬項(P=0.066 1)不顯著，由此可知影響回歸方程失擬平方和的主要原因是實驗誤差的產生。方程的模型值達極顯著水平(P<0.000 1)，說明該模型用于評價實驗結果的可信度較高。方程的二次項系數均為負值，表明方程有最大值。由P值可知，3個因素對桑寄生總黃酮提取率的影響排序為：提取時間>液固比>乙醇體積分數。

3.4.4響應曲面結果分析見圖1～3。從圖1可以看出，固定乙醇體積分數，隨著液固比的升高，提取率增加，當液固比達40∶1時，提取率增加不明顯；固定液固比，乙醇體積分數增加時提取率增大，當乙醇體積分數接近40%時，提取率達到最大值。由此可知，乙醇體積分數接近40%，液固比接近40∶1的區域有最大提取率。從圖2可以看出，固定乙醇體積分數，隨著提取時間的增加，提取率增加，當提取時間接近1 h時，提取率最大；固定提取時間，乙醇體積分數增加時提取率增大，當乙醇體積分數接近40%時，提取率最大。由此可知，乙醇體積分數接近40%，提取時間接近1 h的區域有最大提取率。從圖3可以看出，固定液固比，隨著提取時間的增加，提取率呈上升趨勢，當提取時間接近1 h時，提取率最大；而當固定提取時間，隨著液固比的增加，提取率增大，液固比接近40∶1時，提取率增加不明顯。由此可知，提取時間接近1 h，液固比接近40∶1的區域有最大提取率。

表4 方差分析結果

Tab.4 Results of analysis of variance

方差來源平方和自由度均方F值P值模型0.2390.02535.46<0.0001A2.63×10-312.63×10-33.690.0963B9.80×10-319.80×10-313.750.0076C0.01310.01318.530.0035AB6.25×10-616.25×10-68.77×10-30.9280AC01001.000BC4.56×10-314.56×10-36.390.0393A21.99×10-311.99×10-32.790.1385B20.1910.19268.04<0.0001C21.92×10-411.92×10-40.270.6199殘差4.99×10-377.13×10-4失擬性4.02×10-331.34×10-35.520.0661誤差9.70×10-442.43×10-4總離差0.2316

圖1 乙醇體積分數和液固比對桑寄生總黃酮提取率的影響

Fig.1 Effect of total flavonoids of ethanol volume fraction and liquid-solid ratio on the extraction rate

圖2 提取時間和乙醇體積分數對桑寄生總黃酮提取率的影響

Fig.2 Effect of total flavonoids of extraction time and ethanol volume fraction on the extraction rate

圖3 提取時間和液固比對桑寄生總黃酮提取率的影響

Fig.3 Effect of total flavonoids of extraction time and liquid-solid ratio on the extraction rate

3.4.5提取工藝條件的確定 通過對數據進行處理，得到最大提取率為1.147%，此時的最佳提取條件為：乙醇體積分數為43.11%，液固比為41.33∶1，提取時間為1.32 h。考慮到實際生產情況，確定桑寄生總黃酮提取工藝條件為：乙醇體積分數為40%，液固比為40∶1，提取時間為1 h。

3.4.6驗證實驗 3組平行驗證實驗，提取條件設定為體積分數為40%的乙醇，液固比為40∶1，提取時間為1.32 h，最終計算出桑寄生總黃酮的平均得率為1.147%。采用上述確定的工藝條件進行3次驗證實驗，結果3次驗證實驗提取率分別為1.148%,1.146%和1.146%，平均為1.146%。

4討論

本實驗通過Al(NO)3-NaNO2顯色法對桑寄生總黃酮含量進行方法學考察。精密度實驗RSD為0.099 6%，精密度較高；加樣回收率實驗結果為98.87%；顯色在2 h內較為穩定。另外，對6份桑寄生總黃酮進行重復性實驗，RSD為0.438%，重復性較好。

另外，單因素實驗結果表明，當乙醇體積分數小于40%時，桑寄生總黃酮得率隨著乙醇體積分數的增大而增加，當乙醇體積分數接近40%時，得率達到最大值，但是當乙醇體積分數大于40%時，總黃酮得率逐漸減小。響應曲面結果表明，乙醇體積分數在一定范圍內，隨著提取時間的延長，黃酮得率增加，但時間過長，黃酮得率會下降。

本實驗采用響應面分析法優化提取條件是一種新型有效的設計方法，能準確、快速地得出提取工藝參數。本實驗通過響應面圖客觀全面地分析了因素水平對桑寄生總黃酮提取率的影響，最終得出最佳的提取工藝為：體積分數為40%的乙醇，液固比為40∶1，提取時間為1 h。

參考文獻：

[1]李永華，阮金蘭，陳士林，等.中國桑寄生科Loranthaceae藥用植物資源學研究進展[J]. 世界科學技術-中醫藥現代化，2009，11(5):665-669.

[2]龔祝南，王崢濤，徐洛珊，等.桑寄生的本草考證研究[J].時珍國醫國藥，1997， 8(2) :99-101.

[3]陳瑞生，陳相銀，賈王俊.益腎又安胎的桑寄生[J].首都醫藥，2014，(17):40.

[4]劉麗娟.桑寄生現代臨床應用研究進展[J].檢驗醫學與臨床，2009，6(12) :1001-1002.

[5]楊再波，楊勝巒，龍成梅，等.桑寄生中總黃酮的含量測定及抗氧化活性研究[J].食品研究與開發，2012，33(3):120-122.

[6]張志東，林少珠，吳曉松.正交實驗優化桑寄生黃酮的提取工藝[J].中藥材，2012，35(5):810-812.

[7]朱曉薇，劉一兵.桑寄生科植物的化學成分與抗腫瘤作用[J].國外醫藥·植物藥分冊，2001，16(4): 142-145.

[8]廖彭瑩，韋東曉，楊省，等.兩種不同寄主桑寄生的化學成分預實驗[J].亞太傳統醫藥， 2010，6(11):25-26.

[9]李利華.魚腥草中總黃酮的含量測定及抗氧化性研究[J].西北藥學雜志，2009，24(3):177- 180.

[10]李三華，何志全，陳全利，等.杜仲總黃酮對成骨細胞增殖及Ⅰ型膠原蛋白表達的影響[J].西北藥學雜志，2011，26(4):272-274.

[11]侯學敏，李林霞，張直峰，等.響應面法優化薄荷葉總黃酮提取工藝及抗氧化活性[J].食品科學，2013，34(6):124-127.

doi:10.3969/j.issn.1004-2407.2016.04.012

中圖分類號：R284

文獻標志碼：A

文章編號：1004-2407(2016)04-0367-04

(收稿日期：2015-09-09)

Optimization of extraction technology of total flavonoids from Taxilli herba by design-response surface method

CHEN Rui1，YANG Fanli2，ZHANG Lin3

(1.Baoji City Chinese Medicine Hospital of Shaanxi， Baoji 721001，China；2. School of Pharmacy，Xi′an Jiaotong University，Xi′an 710061，China；3.Shaanxi University of Chinese Medicine，Xianyang 712046，China)

Abstract:ObjectiveTo optimize the extracting process of the total flavonoids of Taxilli herba.MethodsAccording to the center combination method，the effets of ethanol volume fraction， the ratio of solid to liquid，and the extraction time， and the extraction times were studied by central composite design.ResultsThe optimal conditions of extraction were as follows: the ethanol volume fraction was 40%，the ratio of solid to liquid was 40∶1， the extraction was 2 times，the extraction time was 1 h.ConclusionThe actual extraction yield was 1.15%.The method of extraction has higher extraction efficiency compared with other methods. And the method can provide a basis for the industrial production of the total flavonoids from Taxilli herba.

Key words:Taxilli herba；total flavonoids； extraction technique; response surface analysis