熱榨花生粕蛋白生物酶法制備工藝的研究

馬治良，徐曉倩，戴明濤，徐同成，高冠勇，陳寧，陶海騰，*

（1.山東省農(nóng)業(yè)科學(xué)院農(nóng)產(chǎn)品研究所，山東濟(jì)南250100；2.山東金勝糧油集團(tuán)，山東臨沂276600；3.莒南縣農(nóng)業(yè)綜合開發(fā)辦公室，山東臨沂276600；4.莒南縣農(nóng)業(yè)局，山東臨沂276600）

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熱榨花生粕蛋白生物酶法制備工藝的研究

馬治良1，2，徐曉倩3，戴明濤4，徐同成1，高冠勇2，陳寧2，陶海騰1，*

（1.山東省農(nóng)業(yè)科學(xué)院農(nóng)產(chǎn)品研究所，山東濟(jì)南250100；2.山東金勝糧油集團(tuán)，山東臨沂276600；3.莒南縣農(nóng)業(yè)綜合開發(fā)辦公室，山東臨沂276600；4.莒南縣農(nóng)業(yè)局，山東臨沂276600）

摘要：通過生物排雜法將花生粕中的淀粉酶解水溶，建立熱榨花生粕蛋白生物酶法的制備工藝。以淀粉去除率為考察指標(biāo)，進(jìn)行酶解工藝的單因素試驗(yàn)。根據(jù)單因素試驗(yàn)結(jié)果，選取料液比、時(shí)間、酶用量進(jìn)行三因素三水平的響應(yīng)面優(yōu)化，最佳條件為：加酶量0.55%，料液比為1∶8（g/mL），pH 6.0，溫度60℃，酶解時(shí)間為1.0 h；制備的花生蛋白純度為81.38%，達(dá)到了分離蛋白水平。

關(guān)鍵詞：熱榨花生粕；蛋白；酶法制備；淀粉

花生是我國主要的油料作物，2013年產(chǎn)量達(dá)1 600多萬t，約占油料總產(chǎn)的50%，其中約60%花生用于榨油，而90%企業(yè)采用熱榨工藝生產(chǎn)花生油，因此熱榨花生粕是花生加工的主要副產(chǎn)物，年產(chǎn)量約為500萬t，資源豐富，大多用作飼料，附加值很低［1］。熱榨花生粕營養(yǎng)豐富，尤其蛋白含量很高，一般在50%左右，花生蛋白的氨基酸組成合理，其中38.29%為必需氨基酸，接近營養(yǎng)科學(xué)比值40%，屬于優(yōu)質(zhì)的植物蛋白［2-3］。花生蛋白經(jīng)過一定的加工處理后，具有獨(dú)特的抗氧化、降血壓等功能活性，以及獨(dú)特的乳化性、保濕性、成膜性等加工特性，具有很高的食品開發(fā)潛力［4-7］。

目前，花生蛋白制備主要采用堿溶酸沉法，雖然可以獲得高純度的蛋白，但在提取過程中由于采用了較高濃度的堿溶液，對(duì)氨基酸有較強(qiáng)的破壞作用，造成蛋白一定程度上變性，甚至可能產(chǎn)生賴丙氨酸等有毒化合物［8］。此外，高堿會(huì)加速美拉德反應(yīng)，產(chǎn)生黑褐色物質(zhì)，使提取物中非蛋白質(zhì)含量增加，分離效果降低［9］，并且等電點(diǎn)沉淀要消耗大量酸，脫鹽純化難度大，工藝復(fù)雜。同時(shí)提取時(shí)需要消耗大量的堿和水，廢水處理負(fù)擔(dān)大，對(duì)環(huán)境有隱患，因而難于用于工業(yè)化生產(chǎn)。

生物酶排雜法是通過把各種非蛋白成分酶解除去，最終獲得高純度蛋白的方法，由于反應(yīng)條件溫和，對(duì)蛋白結(jié)構(gòu)影響小，具有安全、高效、綠色等優(yōu)點(diǎn)，尤其適用于低溶解度低的蛋白提取，在淀粉糖生產(chǎn)副產(chǎn)物米渣中低溶解度蛋白提取得到一定的成功。Shih利用淀粉酶在90℃處理米渣，使蛋白的含量達(dá)到65%，其后進(jìn)一步應(yīng)用葡萄糖淀粉酶、纖維素酶、半纖維素酶處理可使蛋白質(zhì)含量提高到76%，而且蛋白仍保持其完整狀態(tài)［10］。Morita以大米粉為原料用高溫液化淀粉酶在97℃下反應(yīng)2.0 h后過濾除去糖類物質(zhì)得到了蛋白質(zhì)含量達(dá)90%以上的大米分離蛋白后又以同一種原料分別用傳統(tǒng)的堿溶酸沉法和α-淀粉酶液化法獲得了較高純度的大米蛋白并比較了功能活性，指出α-淀粉酶法所得蛋白質(zhì)回收率高，而且在促進(jìn)試驗(yàn)動(dòng)物膽汁酸、甾醇物的分泌和排泄方面具有更為顯著的效果［11-12］。

熱榨花生粕蛋白由于受高溫高壓的作用，導(dǎo)致變性嚴(yán)重，溶解度很低，因此可以通過生物酶排雜法獲得高純度的蛋白，淀粉是熱榨花生粕的主要非蛋白成分，含量約為15%～18%，本文利用淀粉酶酶解去除熱榨花生粕中的淀粉，從而制備高純度的花生蛋白，為熱榨花生粕的高值化利用提供技術(shù)支撐。

1　材料與方法

1.1材料與試劑

熱榨花生粕由山東金勝糧油集團(tuán)提供，粉碎處理并過篩至60目。

硫酸、鹽酸、氫氧化鈉、無水乙醇、苯酚：天津市科密歐化學(xué)試劑有限公司；脂肪酶、纖維素酶、中溫α-淀粉酶：山東泰安信得利生物工程有限公司。

1.2儀器與設(shè)備

SHA-B恒溫水浴振蕩器、HJ-6A多頭磁力加熱攪拌器：常州國華儀器有限公司；UV1750紫外可見分光光度計(jì)：島津儀器（蘇州）有限公司；CXC-06粗纖維測定儀：浙江托普儀器有限公司；MS104S分析天平：梅特勒-托利多國際股份有限公司；CR22GⅢ高速冷凍離心機(jī)：日立（中國）有限公司。

1.3方法

1.3.1熱榨花生粕的預(yù)處理

1.3.1.1水洗去雜

熱榨花生粕于水中浸泡24 h，濾紙過濾，于105℃烘干，初步水洗后測得脂肪含量為1.34%，蛋白質(zhì)含量60.20%，纖維素含量為10.02%。

1.3.1.2酶解去脂肪

采取溫度30℃，pH 7.0，料液比為1∶8（g/mL），時(shí)間為1h，加酶量為0.20%，酶解后脂肪含量為0.18%。

1.3.1.3酶解去纖維

采取加酶量為1%，料液比為1∶4（g/mL），pH 4.8，溫度50℃，酶解時(shí)間為10 h，酶解后纖維素含量為6.25%。

1.3.2酶解去淀粉單因素試驗(yàn)

稱取5 g預(yù)處理過的熱榨花生粕，以淀粉去除率為指標(biāo)，研究時(shí)間、酶用量、料液比對(duì)淀粉酶水解淀粉效果的影響，試驗(yàn)重復(fù)3次。

1.3.3酶解去淀粉響應(yīng)面優(yōu)化試驗(yàn)

根據(jù)單因素試驗(yàn)及單因子試驗(yàn)篩選出對(duì)淀粉去除率影響顯著的因素。多因素試驗(yàn)采用Box-Behnken設(shè)計(jì)，利用響應(yīng)面進(jìn)行分析優(yōu)化。

1.3.4淀粉去除率的測定

中溫淀粉酶是一種內(nèi)切淀粉酶，可由于中溫淀粉酶可將淀粉鏈水解成不同聚合度的寡聚糖和分支低聚糖的水溶性混合物，所以采用測定上清液中的總糖含量來體現(xiàn)淀粉去除率，本試驗(yàn)采用硫酸苯酚法來測定總糖含量。

2　結(jié)果與討論

2.1淀粉酶酶解單因素試驗(yàn)分析

2.1.1酶解時(shí)間對(duì)淀粉去除率的影響

酶解時(shí)間對(duì)淀粉酶酶解去除的影響見圖1。

圖1　酶解時(shí)間對(duì)淀粉酶酶解去除的影響Fig.1　Effect of time on the removal rate of amylase hydrolysis

固定料液比為1∶8（g/mL）、加酶量0.5%、酶解溫度60℃、酶解pH6.0，在不同的時(shí)間點(diǎn)取樣。由圖1可知，時(shí)間對(duì)淀粉酶酶解去除率影響較大，在1.0 h內(nèi)，隨著時(shí)間的延長，去除明顯呈上升趨勢(shì)，1.0 h以后，淀粉的去除率呈明顯的下降趨勢(shì)。同時(shí)1.0 h與其他水平之間存在顯著性差異（P＜0.05）。因此，后續(xù)試驗(yàn)中將酶解時(shí)間確定為1.0 h。

2.1.2加酶量對(duì)淀粉去除率的影響

加酶量對(duì)淀粉酶去除效果的影響見圖2。

圖2　加酶量對(duì)淀粉酶去除效果的影響Fig.2　Effect of enzyme amount on the removal rate of amylase hydrolysis

固定料液比為1∶8（g/mL）、酶解時(shí)間為1.0 h、酶解溫度為60℃、酶解pH值6.0，分別加入不同用量的酶，在同等條件下進(jìn)行反應(yīng)。由圖2可知，加酶量對(duì)多糖去除率影響較小，加酶量在0.50%以內(nèi)，隨著加酶量的增加，多糖去除率呈上升趨勢(shì)，而在0.5%以后，去除率有下降趨勢(shì)并趨于恒定。同時(shí)0.50%與其他水平之間存在顯著性差異（P＜0.05）。因此，確定加酶量為0.50%。

2.1.3料液比對(duì)淀粉去除率的影響

料液比對(duì)淀粉酶酶解去除率的影響見圖3。

圖3　料液比對(duì)淀粉酶酶解去除率的影響Fig.3　Effect of solid-liquid ratio on the removal rate of amylase hydrolysis

固定加酶量為0.50%、酶解時(shí)間為1.0 h、酶解溫度為60℃、酶解pH6.0，加入不同體積的反應(yīng)溶液，在同等條件下進(jìn)行反應(yīng)。由圖3可知，隨著料液比的升高，在1∶8（g/mL）以內(nèi)呈上升趨勢(shì)，在1∶8（g/mL）之后下降并趨于平穩(wěn)。同時(shí)1∶8（g/mL）與其他水平之間存在顯著性差異（P＜0.05），因此，確定料液比為1∶8（g/mL）。

2.2淀粉酶酶解的響應(yīng)面優(yōu)化

在單因素試驗(yàn)結(jié)果的基礎(chǔ)上，選取加酶量（X1）、酶解時(shí)間（X2）和液料比（X3）為考察因素，各因素水平設(shè)置見表1，以多糖去除率（Y）為評(píng)價(jià)指標(biāo)，試驗(yàn)方案及結(jié)果見表2。

2.2.1不同因素對(duì)去除率的影響

由表2試驗(yàn)結(jié)果得到去除率（Y）與加酶量（X1）、時(shí)間（X2）、料液比（X3）之間的二次多元回歸模型：

表1　響應(yīng)面因素水平表Table 1　Factors of response surface level

表2　中心組合試驗(yàn)設(shè)計(jì)方案與結(jié)果Table 2　Central composite experimental design and results

Y=10.75+0.5X1+0.19X2-0.026X3-0.21X1X2-0.27X1X3-0.022X2X3-1.53X12-0.74X22-1.64X32

利用統(tǒng)計(jì)分析軟件Design expert對(duì)試驗(yàn)結(jié)果進(jìn)行方差分析。回歸方程的方程分析見表3。

表3　 回歸方程的方差分析Table 3　Analysis of variance of the regression equation

由表3可知，加酶量、加酶量的平方、料液比的平方對(duì)去除率的影響極其顯著（P＜0.01）；而時(shí)間的平方對(duì)去除率的影響顯著（P＜0.05）；影響因素主要順序?yàn)榧用噶浚玖弦罕龋緯r(shí)間。模型的P值＜0.01，表明該回歸方程線性顯著，失擬值為0.35（P＞0.05），失擬不顯著。該模型R2=0.97，Adj R2=0.92，以上均表明該回歸方程擬合度達(dá)到理想狀態(tài)。

2.2.2各因素間的交互作用對(duì)去除率響應(yīng)面的分析

利用Design expert軟件對(duì)試驗(yàn)數(shù)據(jù)進(jìn)行多項(xiàng)回歸擬合分析。建立了各因素間交互作用的二次響應(yīng)面的分析。

將建立的回歸模型中的任意一個(gè)因素固定在零水平軸上，得到另外兩個(gè)因素的交互結(jié)果：二次回歸方程的響應(yīng)面及其等高線見圖4～圖6。等高線表示在同一個(gè)橢圓形區(qū)域里，去除率是相同的，在橢圓形區(qū)域中心，去除率最大，并逐漸向邊緣減少。圖中橢圓排列越密集，表明因素的變化對(duì)去除率的影響越大，由圖4、圖5、圖6可知中反映出的去除率在各因素的中心點(diǎn)附近可獲得最大值。并且加酶量和時(shí)間的交互項(xiàng)對(duì)去除率的影響最大，加酶量是影響去除率的最主要因素。

圖4　X1和X2交互的響應(yīng)面和等高線（X3=8 mL/g）Fig.4　X1and X2response surface and contour to interact （X3=8 mL/g）

圖5　X1和X3交互的響應(yīng)面和等高線（X2=1 h）Fig.5　X1and X3response surface and contour to interact（X2=1h）

圖6　X2和X3交互的響應(yīng)面和等高線（X1=0.50%）Fig.6　X2and X3response surface and contour to interact （X1=0.50%）

2.3最佳工藝條件及其驗(yàn)證試驗(yàn)

通過Design expert軟件分析，得出最佳酶解條件為酶用量0.55%，時(shí)間1.05 h，料液比為1∶7.91（g/mL）。在該條件下，多糖最大去除率可達(dá)10.81%。在實(shí)際生產(chǎn)中，達(dá)不到如此精確控制反應(yīng)條件，故采用酶用量0.5%，時(shí)間1 h，料液比為1∶8（g/mL）。采用優(yōu)化后的酶解工藝，進(jìn)行了3組驗(yàn)證試驗(yàn)，多糖去除率達(dá)到10.75%，與估測值之間無顯著差異（P＜0.05）。

2.4生物酶法提取過程中的蛋白含量分析

將生物酶法制備過程各階段產(chǎn)物在105℃下烘干，通過凱式定氮儀測定其粗蛋白含量。生物酶法過程中的蛋白含量變化見圖7。

圖7　生物酶法制備過程中的蛋白含量變化Fig.7　Changes in the process of enzymatic protein

由圖7可知，隨著非蛋白成分的逐步去除，熱榨花生粕中蛋白含量逐步升高，最終達(dá)到81.38%。

3　結(jié)論

采用淀粉酶等酶解熱榨花生粕中的主要非蛋白組分，優(yōu)化的生物酶法最佳制備工藝為：淀粉酶加酶量0.55%、料液比為1∶8（g/mL）、pH 6.0、溫度60℃、酶解時(shí)間1.0 h。在此條件下，制備的花生蛋白含量為81.38%。達(dá)到了分離蛋白的水平，可以滿足后續(xù)花生蛋白精深加工的需求。

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DOI：10.3969/j.issn.1005-6521.2016.11.019

基金項(xiàng)目：國家“863”計(jì)劃項(xiàng)目（2013AA102206）

作者簡介：馬治良（1988—），男（漢），碩士研究生，研究方向：糧油加工。

*通信作者：陶海騰（1979—），男（漢），助理研究員，研究方向：糧油加工。

收稿日期：2015-07-06

Researches on Enzymatic Preparation of Peanut Protein from Hot-pressed Meals

MA Zhi-liang1，2，XU Xiao-qian3，DAI Ming-tao4，XU Tong-cheng1，GAO Guan-yong2，CHEN Ning2，TAO Hai-teng1，*

（1.Institute of Agro-Food Science and Technology，Shandong Academy of Agricultural Sciences，Jinan 250100，Shandong，China；2.Shandong Jinsheng Grain and Oil Group CO.，Ltd.，Linyi 276600，Shandong，China；3.Junan Agricultural Comprehensive Development Office，Linyi 276600，Shandong，China；4.Junan Agricultural Bureau，Linyi 276600，Shandong，China）

Abstract：A novel preparation method of peanut protein was established by enzymatic hydrolysis of starch in hot pressed meals.Starch removal rate as index，the single factor experiments of enzymatic hydrolysis technology were carried out.Based on above results，the response experiment for three factors（solid-liquid ratio，time，enzyme dosage）and three levels was designed.The optimal conditions were as follows：enzyme dosage of 0.55%，solid-liquid ratio of 1∶8（g/mL），pH 6.0，60℃，reaction time of 1.0 h.The purity of preparation peanut protein reached 81.38%as well as that of separation protein.

Key words：hot pressed peanut meal；protein；enzymatic preparation；starch