親水色譜法測定硝酸鹽和亞硝酸鹽方法研究

張宏偉，張立娟，鄭冬梅，*（.東北農業大學食品學院，黑龍江哈爾濱50030；.天津市食品研究所有限公司，天津30609）

?

親水色譜法測定硝酸鹽和亞硝酸鹽方法研究

張宏偉1，張立娟2，鄭冬梅1，*
（1.東北農業大學食品學院，黑龍江哈爾濱150030；2.天津市食品研究所有限公司，天津301609）

摘要：建立使親水色譜柱同時測定硝酸鹽和亞硝酸鹽的高效液相色譜方法。樣品勻漿后超聲提取，高速離心處理，采用親水色譜柱分離，乙酸銨和乙腈作為流動相進行等度洗脫，210 nm紫外檢測。該方法簡便快捷、準確可靠，成本低廉，適用于多種蔬菜中亞硝酸鹽和硝酸鹽的分析。

關鍵詞：蔬菜；硝酸鹽；亞硝酸鹽；親水色譜

蔬菜中含有較多的硝酸鹽，在硝酸鹽還原酶作用下硝酸鹽可能產生大量的亞硝酸鹽，對人產生毒害作用。隨著分析化學新方法和新技術的不斷出現和發展，食品中亞硝酸鹽的檢測也更加多元化，新的檢測方法層出不窮，常見方法有［1-8］：（1）光度法：包括格里斯試劑比色法、催化光度法、流動注射系統-分光光度法、順序注射系統-分光光度法、導數光度法；（2）示波極譜法；（3）熒光法；（4）離子色譜法；（5）催化動力學法、氣相色譜法以及各種傳感器技術等。我國的國標方法為離子色譜法和格里斯試劑比色法［8］。這兩種方法基本是肉類食品與果蔬制品中亞硝酸鹽殘留檢測的主要方法。離子色譜可以對硝酸鹽和亞硝酸鹽進行同時分析，已經成為國際標準方法［9-10］，但離子色譜尚未在中國普及，而且耗材較貴，嚴重影響色譜法在硝酸鹽和亞硝酸鹽分析中應用。

本研究采用高效液相色譜法對硝酸鹽和亞硝酸鹽的含量進行檢測，利用親水色譜柱ZIC-HILIC作為實驗的色譜柱，分別采用不同濃度的甲酸胺和醋酸銨作為流動相，紫外檢測器于210 nm條件下檢測亞硝酸鹽的含量，通過改變不同流動相的濃度以及pH來確定最佳的方法。

1　材料與方法

1.1材料與儀器設備

水為超純水；硝酸鉀、亞硝酸鈉、甲酸銨、乙酸銨、甲酸、冰乙酸：國藥集團化學試劑有限公司；甲醇和乙腈：Merck。

1100高效液相色譜儀：Agilent，配紫外檢測器；MIXER B-400均質儀：Buchi；KQ3200B超聲波清洗儀（250 W，40 KHz）：昆山市超聲波儀器有限公司；FE20 pH計：梅特勒-托利多儀器有限公司。

1.2樣品前處理

使用MIXER B-400均質儀將黃瓜樣品粉碎均質。準確稱取勻漿5.00 g，加入80 mL純水，40℃超聲提取30 min，每隔5 min振蕩1次，提取后取出放置至室溫，加水稀釋至刻度。溶液經濾紙過濾后，取部分溶液于10 000 r/min離心15 min，取上清液1 mL使用乙腈定容至10 mL，取定容液過0.22 μm四氟乙烯濾膜后上機檢測。

1.3色譜條件

色譜柱ZIC-HILIC（MERCK）100mm×2.1mm，3.5μm，流速0.3 mL/min，柱溫30℃，紫外檢測器波長210 nm［3］，流動相為20 mmol/L pH=4.0乙酸銨，90%乙腈。

2　結果與討論

2.1試樣提取方法的選擇

為了確定較優的亞硝酸鹽和硝酸鹽提取溫度和時間，本試驗對提取時間和溫度進行優化。準確稱取黃瓜勻漿5.00g，以超純水定容到100mL，分別選用30、40、50、60℃進行超聲水浴提取，超聲功率250 W，頻率40 KHz，提取時間為20、30、40、50 min，以60℃、50 min時亞硝酸鹽提取效率為100%計算，不同時間和溫度時的提取效率如圖1所示。

圖1　不同處理方式對亞硝酸鹽提取率的影響Fig.1　Effect of treatments on the extraction rate of nitrite

如圖1所示，試驗結果表明，在同一個提取溫度條件下隨著提取時間的延長，亞硝酸鹽提取率呈現先提高再下降的趨勢，在40℃超聲提取30 min即可獲得最高的提取率，提取時間適中，因此選擇40℃超聲提取30 min為本研究的提取條件。

2.2流動相的優化

分別選用20 mmol/L甲酸銨，20 mmol/L乙酸銨，在其自然pH、pH=4和pH=3條件下與乙腈進行混合，混合比例為乙腈85%和90%，由于亞硝酸根較硝酸根出峰晚，本文以分離度和亞硝酸根出峰時間為判定指標進行試驗。試驗結果見表1和表2，最優色譜條件下標準品圖見圖2。

由表1和表2可知，甲酸胺流動相組分離度低于相同條件下的乙酸銨流動相組，甲酸胺流動相組亞硝酸根出峰時間長于相同條件下的乙酸銨流動相組，因此選擇乙酸銨組作為流動相。相同條件下90%乙腈組較85%乙腈亞硝酸根離子出峰時間晚，硝酸根和亞硝酸根分離度大，同時硝酸根距離負吸收峰遠，有助于自動積分，因此選取20 mmol/L乙酸銨，乙腈濃度為90%，pH為4時，為最快捷，高效的測定亞硝酸鹽含量的方法。

表1　不同流動相對分離度的影響Table 1　The effect of Mobile phase on the resolution of peaks

表2　不同流動相對亞硝酸鹽出峰時間的影響Table 2　The effect of Mobile phase on the peak-time of nitrite min

圖2　標準品色譜圖Fig.2　The chromatographicdetection result of standardsample

2.3方法線性試驗、檢出限及回收率

參照國標方法一［8］配制亞硝酸鹽和硝酸鹽混合標準工作溶液，采用上述色譜條件檢測，以峰面積（y）對濃度（x）作圖，得到工作曲線，并由基線噪音確定出檢測限和定量限。其線性范圍、方程及相關系數見表3。

表3　 回歸方程與檢測限Table 3　The correlation coefficients and LODs

由表3可知，該方法檢測亞硝酸根和硝酸根具有良好的線性關系。線性相關系數外都達到0.998以上，亞硝酸根和硝酸根最低檢出限分別為：0.01 mg/L和0.05 mg/L，均達到或超過國標方法一的水平。由于亞硝酸根和硝酸根在210 nm附近有較大吸收，因此紫外檢測器在210 nm波長下對這兩種離子具有較高的靈敏度，因此獲得較國標方法更高的靈敏度。同時，紫外檢測器對Cl-不靈敏，可以降低常見的Cl-的干擾［11］。

2.4精密度試驗

取濃度為0.1 mg/L亞硝酸鹽和硝酸鹽混合標準工作溶液按上述確定的色譜條件進樣6次，保持每次進樣色譜條件一致。通過分析色譜圖計算得出各生物胺色譜峰的平均值，通過統計分析得出標準偏差（SD）和相對標準偏差（RSD），得出結果越小說明精密度越高。精密度試驗結果如表4所示。

表4　 精密度試驗結果Table 4　The results of precision

由表4可知，亞硝酸根和硝酸根色譜峰面積的RSD在1.267 8%～1.734 3%范圍內，說明該方法精密度良好。

2.5回收率試驗

采用向樣品中加標的方法進行回收率試驗，試驗結果如表5所示。

表5　回收率試驗結果Table 5　The results of recovery rate

3　結論

經過試驗確定分析方法為樣品勻漿加純水40℃超聲提取30 min，使用ZIC-HILIC（MERCK）100 mm× 2.1 mm，3.5 μm色譜柱，以20 mmol pH=4.0乙酸銨和90%乙腈溶液等度洗脫，流速0.3 mL/min，柱溫30℃，210 nm紫外檢測，5 min內完成分析。該方法具有無需復雜前處理，不需固相萃取小柱，利用現有高效液相色譜，檢測時間短，7 min內完成分析等優點，僅需購買親水色譜柱（HILIC柱）就可以開展工作，因此具有良好的應用推廣價值。

參考文獻：

［1］杜紅霞，霍稚非，李洪軍.食品中亞硝酸鹽檢測技術研究進展［J］.肉類研究，2006（1）：41-45

［2］張新智.離子色譜法同時測定蘋果汁中的亞硝酸鹽、硝酸鹽和硫酸鹽［J］.檢驗檢疫科學，2008，18（1）：32-34

［3］徐霞，應興華，段彬伍.紫外檢測離子色譜法測定醬腌菜中的亞硝酸鹽與硝酸鹽［J］.食品與發酵工業，2007，33（3）：120-122

［4］曾健華.適用于全自動在線監測水體中硝酸鹽和亞硝酸鹽的流動注射分析方法的研究［D］.南京：河海大學，2006

［5］胡艷.幾種陰離子的超分子傳感及亞硝酸鹽的綠色化分析方法的研究［D］.成都：四川大學，2007

［6］蔡薈梅，侯如燕，高柱，等.離子色譜法測定茶葉中的硝酸鹽和亞硝酸鹽［J］.茶葉科學，2012，32（2）：95-99

［7］王燕.化學發光法測定海水中低濃度硝酸鹽和亞硝酸鹽含量的方法探究及應用［D］.青島：中國海洋大學，2009

［8］中華人民共和國衛生部.GB 5009.33-2010食品安全國家標準食品中亞硝酸鹽與硝酸鹽的測定［S］.北京：中國標準出版社，2010

［9］ AOAC.Official methods of analysis of the Association of Official Analyti-cal Chemists（15th ed）［S］.Philadelphia：Association of Official AnalyticalChemists，1990，Section 973.31

［10］European Committee for standardization.Foodstuffs-determination of nitrate and/or nitrite content-Part4：Ion-exchange chromatographic（IC）methodfor the determination of nitrate and nitrite content of meat products.（EN12014-4：2005）

［11］牟世芬，劉克納，丁曉靜.離子色譜方法及應用［M］.2版.北京：化學工業出版社，2005

DOI：10.3969/j.issn.1005-6521.2016.11.034

作者簡介：張宏偉（1982—），男（漢），實驗師，碩士，研究方向：食品科學。

*通信作者

收稿日期：2015-11-12

Research of Determination of Nitrate and Nitrite by Hydrophilic Chromatography

ZHANG Hong-wei1，ZHANG Li-juan2，ZHENG Dong-mei1，*

（1.College of Food Science，Northeast Agricultural University，Harbin 150030，Heilongjiang，China；2.Food Research Institute Co.，Ltd.，Tianjin 301609，China）

Abstract：The method to determination of nitrate and nitrite in vegetables was established by HILIC column. Vegetables samples were pre-treated by ultrasonic extraction and high-speed centrifugation，separated by HILIC column which used ammonium acetate and acetonitrile as the mobile phase，isocratic elution and UV detection at 210 nm.The method was simple，rapid，accurate and reliable，cheap，and suited forthe analysis of nitrite and nitrate in vegetables.

Key words：vegetables；nitrates；nitrites；HILIC