食品中致病微生物檢測結果的不確定度評定

鄧曉鴻，強敏，朱新生，王韋崗（鎮江市產品質量監督檢驗中心，江蘇鎮江212132）

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食品中致病微生物檢測結果的不確定度評定

鄧曉鴻，強敏，朱新生，王韋崗
（鎮江市產品質量監督檢驗中心，江蘇鎮江212132）

摘要：了解本地區抽查的速凍面米制品的微生物指標狀況，并探討金黃色葡萄球菌的定量檢測的數值結果的不確定度評定方法。按照國標法GB 4789.1-2010《食品安全國家標準食品微生物學檢驗總則》、GB 4789.4-2010《食品安全國家標準食品微生物學檢驗金黃色葡萄球菌檢驗》、GB4789.10-2010《食品安全國家標準食品微生物學檢驗沙門氏菌檢驗》和GB 19295-2011《食品安全國家標準速凍面米制品》進行抽樣和檢測，依據JJF1059.1-2012《測定不確定度評定與表示》，泊松分布及相關統計學方法對檢測結果數字不確定度進行評定。抽檢的142批次速凍面米制品，兩種制品抽檢合格率都為100%，得出的兩份樣品檢測結果平均數分別為290 CFU/g和20 CFU/g，相對應該的標準不確定度分別為30 CFU/g和4 CFU/g。本文采用的評定方法，可以對面米制品金黃菌定量檢測結果平均數不確定度作出估計，用于速凍面米制品的安全評估。

關鍵詞：速凍面米制品；金黃色葡萄球菌；不確定度

速凍面米制品以小麥粉、大米、雜糧等谷物為主要原料，或同時配以肉、禽、蛋、水產品、蔬菜、果料、糖、油、調味品等單一或多種配料為餡料，經加工成型（或熟制），速凍而成的食品。它包括生制品（即產品凍結前未經加熱成熟的制品）和熟制品（即產品凍結前經加熱成熟的非即食制品［1］。

根據我國速凍面米制品產業發展和居民消費的特點，GB 19295-2011《食品安全國家標準速凍面米制品》的范圍包括了餃子、餛飩、包子、粽子、湯圓等速凍預包裝食品。隨著年底的臨近，各種速凍食品即將也將大量生產，有的企業很早就準備，由于管理不到位，及擺放時間過長，及擺放環境的因素，各種食品受到污染的情況，層出不窮。

金黃色葡萄球菌廣泛分布于環境中，人和動物是主要攜帶者，通常存在于50%或更多健康人群的鼻腔、咽喉、頭發和表皮中，對熱敏感，一般烹飪煮熟即可殺滅。金黃色葡萄球菌食物中毒主要是由其產生的致病性腸毒素導致的，通常在數量大于105 CFU/g時可能產生致病性腸毒素，引起食物中毒［2］。

2011年12月21日速凍面米制品食品安全國家標準實施以來微生物指標是GB 19295-2011《食品安全國家標準速凍面米制品》的重要內容，分為致病性微生物和指示菌。根據速凍面米制品檢驗和監測情況，借鑒國際組織和相關國家管理規定，GB 19295-2011《食品安全國家標準速凍面米制品》采用了國際食品微生物標準委員會采樣原則［3-4］。

1　材料與方法

1.1材料

1.1.1樣品來源

累計2013～2014兩年4次監督抽查共142批次速凍面米制品，其中生制品Y188批次，熟制品Y254批次，所有制品中包括水餃，湯圓和速凍包子等類型。

1.1.2培養基

BP計數瓊脂：由杭州微生物試劑有限公司提供，按照說明配制；腦心浸出液肉湯（BHI）、兔血漿、營養瓊脂小斜面：由紹興天恒生物技術有限公司提供；生理鹽水緩沖液由鎮江產品質量監督檢驗中心微生物制配。

1.1.3儀器

BILON-08比朗均質器：上海比朗儀器公司；Brand移液器：大龍興創實驗儀器（北京）有限公司。

1.1.4微生物限量

速凍面米制品在-18℃以下保存時，不利于金黃色葡萄球菌繁殖和產生腸毒素。國際食品微生物標準委員會根據致病菌及其致病風險，將金黃色葡萄球菌列為一般性危害致病菌，通常采用三級采樣方案。三級采樣方案具體意義是：規定同一批次產品采樣數（n）、微生物指標可接受水平的限量值（m）、最大可允許超出m值的樣品數（c）、微生物指標的最高安全限量值（M）［3］。

根據GB19295-2011《食品安全國家標準速凍面米制品》要求，生制品微生物限量見表1。

表1　 生制品的微生物的限量Table 1　Microbial limit of raw products

由表1可知：新標準采用了三級采樣方案，用多個樣品定量檢測結果進行綜合判定，具體規定為：生制速凍預包裝面米制品中金黃色葡萄球菌限量為（n=5，c=1，m=103CFU/g，M=104CFU/g）。

根據GB19295-2011《食品安全國家標準速凍面米制品》要求，熟制品微生物限量見表2。

表2　熟制品的微生物的限量Table 2　Microbial limit of cooked products

由表2可知：熟制速凍預包裝面米制品金黃色葡萄球菌為（n=5，c=1，m=100 CFU/g，M=1 000 CFU/g），即在同一批次采5個樣品，允許全部樣品檢驗值小于或等于100CFU/g，允許1個樣品檢驗值在100CFU/g至1000CFU/g之間；不允許有樣品檢驗值大于103CFU/g；不允許2個及以上樣品檢測值大于100 CFU/g。

1.2方法

1.2.1金黃色葡萄菌定量檢測法的基本步驟［2］

檢樣按照GB4789.10-2010《食品安全國家標準食品微生物學檢驗金黃色葡萄球菌檢驗》第二法Baird-Parker平板記數法進行。每稀釋度按0.3、0.3、0.4 mL 做3塊平板，選擇同一稀釋度3個平板所有菌落數在20CFU～200CFU的平板，計典型菌落數和典型菌落確認試驗，Baird-Parker平板記數法檢測的基本程序見圖1。

圖1　金黃色葡萄球菌Baird-Parker平板法檢驗程序Fig.1　Staphylococcus aureus Baird-Parker tablet test procedures

1.2.2數學模型的建立及金黃色葡萄菌落總數計算方法［3］

1）只有一個稀釋度平板的菌落數在20CFU～200CFU之間且有典型菌落，計數該稀釋度平板上的典型菌落；

2）最低稀釋度平板的菌落數小于20 CFU且有典型菌落，計數該稀釋度平板上的典型菌落；

3）某一稀釋度平板的菌落數大于200 CFU且有典型菌落，但下一稀釋度平板上沒有典型菌落，應計數該稀釋度平板上的典型菌落；

4）某一稀釋度平板的菌落數大于200 CFU且有典型菌落，且下一稀釋度平板上有典型菌落，但其平板上的菌落數不在20 CFU～200 CFU之間，應計數該稀釋度平板上的典型菌落；

以上按公式（1）計算。

公式（1）：

式中：T為樣品中金黃色葡萄球菌菌落數；A為某一稀釋度典型菌落的總數；B為某一稀釋度血漿凝固酶陽性的菌落數；C為某一稀釋度用于血漿凝固酶試驗的菌落數；D為稀釋因子。

5）2個連續稀釋度的平板菌落數均在20 CFU～ 200 CFU之間，按公式（2）計算。

式中：T為樣品中金黃色葡萄球菌菌落數；A1為第一稀釋度（低稀釋倍數）典型菌落的總數；A2為第二稀釋度（高稀釋倍數）典型菌落的總數；B1為第一稀釋度（低稀釋倍數）血漿凝固酶陽性的菌落數；B2為第二稀釋度（高稀釋倍數）血漿凝固酶陽性的菌落數；C1為第一稀釋度（低稀釋倍數）用于血漿凝固酶試驗的菌落數；C2為第二稀釋度（高稀釋倍數）用于血漿凝固酶試驗的菌落數；1.1為計算系數；d為稀釋因子（第一稀釋度）。

1.2.3金黃色葡萄球定量檢測結果的不確定度來源

1）基質及培養條件［標準菌種，培養基質量及培養箱參數（培養時間，溫度）］。

2）取樣操作（樣品取樣均勻，溶解均質，樣品的逐級稀釋）。

3）結果處理（確證試驗判定，平板記數，數字修約）。

2　結果與分析

2.1本次抽查樣品致病菌檢測結果

本次抽查的142批次生熟制品的微生物檢測結果見表3。

表3　 面米制品的致病菌檢測結果Table 3　Pathogenic bacteria detection results of rice products

由表3可知，在本次統計的已檢測的142批次的速凍面米制品中，對于沙門氏菌指標，生熟制品所檢樣品都未檢出；對于金黃色葡萄球菌指標，生熟制品所檢樣品都在國家標準限定值范圍內；88份生制品和54份熟制品依據GB 19295-2011《食品安全國家標準速凍面米制品》都符合要求，合格率都為100%。

2.2選定兩份樣品Y1和Y2檢測的結果報告

選定的兩份樣品Y1（生制品）和Y2（熟制品）檢測記錄見表4。

表4　 樣品Y1和Y2檢測記錄Table 4　Samples Y1 and Y2 detection records

由表4可知：樣品Y1和樣品Y2都定性地檢出了金黃色葡萄球菌，在樣品Y1中同批次的5個獨立包裝中，根據公式（2）生制品有兩個連續稀釋度（10-1，10-2）平板所有菌落數合計在20 CFU～200 CFU之間，經計算數字分別為：270、410、260、330、190 CFU/g。

在樣品Y2中同批次的5個獨立包裝中，根據公式（1）熟制品結果數字分別為：18、3、0、44 CFU/g和37 CFU/g。結果表明，樣品Y1和Y2金黃色葡萄球菌定量未超標，符合國家標準要求且平均報告數分別為：290 CFU/g和20 CFU/g。

2.3各分量不確定度分量［5］

金黃色葡萄球菌計數的不確定度主要由系統性效應和隨機性效應引起。本文主要分析稀釋度、加樣體積、菌落數、個人計數重復性、確證實驗人員計數的不確定度。金黃色葡萄球菌計數各分量合成的相對標準不確定度為：

式中：WN為金黃色葡萄球菌計數的相對標準不確定度；WD為稀釋過程中相對標準不確定度；WV為樣品加樣體積的相對標準不確定度；WC為平板金黃菌落數的相對標準不確定度；WT為個人重復計數所產生的不確定度；WQ為血漿凝固酶陽性菌落數的比例所引入的不確定度。

取k=2，U（WN）為擴展標準不確定度，U（WN）=k×WN，而金黃色葡萄球菌總數擴展不確定度為：UN=U（WN）× N，（N為樣品一次檢測中金黃色葡萄球菌檢驗平均值。）

2.3.1稀釋過程中相對標準不確定度

稀釋過程中相對標準不確定度包括：首步10倍稀釋（25 g檢樣+225 mL生理鹽水）和后續連續10倍系列稀釋（1 mL首步稀釋懸液+9 mL生理鹽水）所產生的不確定度，每步稀釋所產生的相對不確定度平方可由下式計算

式中：a為被稀釋固體樣品質量或樣品稀釋液體積；b為生理鹽水體積。

試驗中除首步外，其余各步稀釋均相同。則稀釋度的相對不確定度平方為：

在本次試驗檢測中，用電子天平稱取樣品25 g（分度0.01 g）加入225 mL生理鹽水中（250 mL量筒），它們的容許誤差分別為0.01 g和2 mL。兩者允差屬于矩形分布；后續的稀釋中，所用的量器為1 mL和10 mL移液槍，依據JJG 646－2006《移液器檢定規程》，吸取1 mL和9 mL時容量允差分別為±1.0%和±0.6%，屬于矩形分布［7］。則：

1）天平的相對標準不確定度為：

2）量筒的相對標準不確定度為：

3）移液槍的相對標準不確定度為：

根據公式，則首步稀釋的相對不確定度的平方為：

后續稀釋各步的相對不確定度的平方：

本次試驗中，用于金黃色葡萄球菌平板計數的樣品Y1（生制品）稀釋度10-1和10-2在計數范圍內。

W2D=2W2d1+W2d2=4.271 908×10-5+2.708 7×10-5= 6.980 6×10-5

樣品Y2（熟制品）稀釋度10-1在計數范圍內。W2D=W2d1=2.1360×10-5

2.3.2樣品加樣體積的相對標準不確定度

分別用1 mL移液器取，每個稀釋度分別吸取1 mL樣品勻液按0.3、0.3、0.4 mL接種量加入到Baird-Parker平板。依據JJG 646－2006《移液器檢定規程》，則本次試驗加樣過程中，1個獨立包裝的1個梯度產生的相對標準不確定為：

U2V1mL=U2V0.4mL+U2V0.3mL+U2V0.3mL=3×0.005 772=5.376×10-7

對于樣品Y1（生制品），以第一稀釋度為準。則加樣總體積為5.5 mL。因涉及到稀釋度，根據公式（6），則相對標準不確定度為：

對于樣品Y2（熟制品），加樣總體積為5mL，則相對標準不確定度為：

W2V=1.152 6×10-7

2.3.3平板金黃菌落數的相對標準不確定度

胡巔［8］等認為平板法測金黃菌數的相對標準不確定度宜按照普松分布理論計算，由于泊松分布的可加性，平板上菌落數總和的泊松分布（相對方差）可以由公式W2c=1/C估計得到。則本次試驗中：

樣品Y1（生制品）相對不確定度平方為：

W2c=1/（270+510+260+330+190）=6.41×10-4

樣品Y2（熟制品）相對不確定度平方為：

W2c=1/（18+3+44+37+0）=9.81×10-3

2.3.4個人重復計數所產生的不確定度

本次試驗，以重復測量的平均值的相對標準不確定度作為依據，通常的做法是取對數以后在用常規的貝塞爾方法進行計算合成標準不確定度［9］。

生制品Y1組合的平均值，重復次數為10次，每次5個獨立包裝食品平板菌落總平均值分別為：290、240、180、220、390、360、310、190、210、370 CFU/g。這組數據的平均值為：=280故平均值的標準不確定度為：

則W2T=1.473×10-3

熟制品Y2組合的平均值，重復次數為10次，每次5個獨立包裝食品平板菌落總平均值分別為：20、35、17、59、44、18、25、40、22、23 CFU/g這組數據的平均值為：=31CFU/g故平均值的標準不確定度為：

2.3.5血漿凝固酶陽性菌落數的比例所引入的不確定度［10］

每個梯度BP平板上長出來的典型菌落任選5個菌落（小于5個全選），做血漿凝固酶試驗進行驗證［2］，因為挑選的差異，則會產生不確定度。

本次試驗，重復次數為10次，每次5個獨立包裝食品平板菌落總數，從典型菌落中樣品Y1確證陽性菌落數的比例分別為：0.92、0.96、1.0、0.96、0.88、0.8、 0.92、0.96、1.0、1.0。這組數據的平均值為：0.94

故平均值的標準不確定度為：

對于熟制品Y2，陽性菌落數的比例分別為：1.0、1.0、0.96、1.0、0.92、1.0、0.96、0.96、1.0、0.96。這組數據的平均值為：=0.976故平均值的標準不確定度為：

2.3.6樣品中金黃葡萄球菌合成不確定度和擴展不確定度

綜合2.3.1-2.3.5各分量不確定度結果，可以得出，樣品金黃色葡萄球菌計數合成的相對標準不確定度。

對于樣品Y1（生制品），相對標準不確定度為：

對于樣品Y2（熟制品），相對標準不確定度為：

在置信概率p=0.95時，取k=2則擴展不確定度為：

樣品Y1：U95uel=kp×WN=1.02×10-1，

樣品Y2：U95uel=kp×WN=2.32×10-1

根據以上數樣品Y1檢測結果報告為：平均菌落為290 CFU/g；不確定度為30 CFU/g；樣品Y2檢測結果報告為：20 CFU/g；不確定度為4 CFU/g。

3　結論

影響金黃色葡萄球菌平板記數法結果不確定度的因素很多，本次試驗中主要討論了稀釋度、加樣體積、菌落數、個人計數重復性、確證實驗人員計數過程中的不確定度。在其整個檢測過程中除了上述不確定度之外，結果還受標準菌種、培養基質量、培養箱參數、樣品取樣均勻、菌落的重疊和菌落的計數誤差等因素的影響［10］。

通過對各不確定度分量進行分析和計算表明，樣品金黃色葡萄球菌平板記數，重復計數及確證試驗血漿凝固酶中陽性菌比例及計數產生的不確定度所占分量最大。

通過選擇合適的、可行的試驗方案，規范操作就可以減小關鍵步驟的不確定度分量值，保證檢驗結果的準確、可靠。該方法可以廣泛應用于各類食品中大腸菌群平板計數不確定度的評定［10］。

參考文獻：

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［3］中華人民共和國衛生部.GB 4789.4-2010食品安全國家標準食品微生物學檢驗沙門氏菌檢驗［S］.北京：中國標準出版社，2010：1-20

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DOI：10.3969/j.issn.1005-6521.2016.11.038

作者簡介：鄧曉鴻（1986—），男（漢），工程師，碩士研究生，研究方向：食品微生物。

收稿日期：2015-05-14

Uncertainty Evaluation for Palte Counts of Pathogenic Bacteria Colonies in Foods

DENG Xiao-hong，QIANG Min，ZHU Xin-sheng，WANG Wei-gang

（Zhenjiang Center for Products Quality Supervision&Inspection，Zhenjiang 212132，Jiangsu，China）

Abstract：To understand the microbial indicators of frozen rice products in the region and probe the uncertainty assessment methods for testing the results of Staphylococcus aureus.the products were sampled and test accord

ing to GB 4789.1-2010，GB 4789.4-2010，GB 4789.10-2010 and GB 19295-2011 and evaluated uncertainty of the samples based on JJF1059.1-2012，poisson scatter and related statistical methods to evaluate uncertainty of the samples.142 quick-frozen product of wheat flour and rice，including 88 samples of Frozen without cook

ing and 54 samples of Cooked before frozen，both qualified rate of them was 100%.According to the methods used，it was concluded that the average results of two samples was 290 CFU/g and 20 CFU/g.Also the relative standard uncertainty of test results of was 30 CFU/g and 4 CFU/g respectively.Evaluation method used in this paper could estimate the uncertainty of test results of Staphylococcus aureus coming form quick-frozen products of wheat flour and rice，which was suitable to evaluate the safety of them.

Key words：quick-frozen product of wheat flour and rice；Staphylococcus aureus；Uncertainty evaluation