環介導等溫擴增技術在嗜水氣單胞菌檢測中的應用

孟　雙，王　毅，王　艷，葉長蕓

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環介導等溫擴增技術在嗜水氣單胞菌檢測中的應用

孟雙，王毅，王艷，葉長蕓

中國疾病預防控制中心傳染病預防控制所，傳染病預防控制國家重點實驗室，北京102206

摘要：目的建立環介導等溫擴增技術(Loop-mediated isothermal amplification, LAMP)對嗜水氣單胞菌檢測的方法，并用臨床標本對該方法進行評價。方法根據嗜水氣單胞菌desA 基因的保守序列設計特異性引物，利用參考質粒評價該檢測體系的靈敏度；用30種其他腸道致病菌及院內感染中常見的致病菌評價該檢測體系的特異性；用糞便模擬樣本以及臨床樣本評價該檢測體系的臨床檢測的可行性。結果LAMP檢測體系對嗜水氣單胞菌重組質粒的檢測靈敏度為1×102拷貝/反應體系；LAMP檢測體系在檢測30種其他腸道致病菌及院內感染中常見的致病菌時未出現假陽性；LAMP檢測體系在糞便模擬標本中的檢測下限為5 × 103 CFU/g；通過與qPCR技術相比較，LAMP具有更高的靈敏度以及更優秀的臨床標本的檢測能力。結論本研究建立的LAMP方法是首次將LAMP技術運用到了嗜水氣單胞菌的檢測，所需儀器設備簡單，可作為一種快速的篩查方法在臨床檢驗和基層實驗室應用。

關鍵詞：嗜水氣單胞菌；LAMP；qPCR

Supported by the National Major Science and Technology Project of Prevention and Control in Significant Infectious Diseases(No. 2013ZX10004-101)

嗜水氣單胞菌(Aeromonashydrophila)是一種革蘭陰性、能運動、兼性厭氧、氧化酶陽性的桿狀細菌，屬于弧菌科、氣單胞菌屬[1]。嗜水氣單胞菌廣泛分布于自然界的各種水體，是多種水生動物的原發性致病菌，是典型的人-獸-魚共患病的病原菌。近年來大量研究表明，嗜水氣單胞可單獨或者與其他致病菌共同感染，引起人類腸胃炎、敗血癥以及外傷引起軟組織感染等病癥[2]，危害食品安全，并且是免疫缺陷病人和肝功能疾病患者的條件致病菌，具有重要的公共衛生意義[3-4]。

目前對于嗜水氣單胞菌的檢測方法主要有分離培養、普通PCR和實時熒光PCR(qPCR)等分子生物學方法。分離培養方法操作步驟繁瑣，檢測周期長，一般需要3～5 d完成，不能滿足快速檢測的需求[5]。最近幾年，PCR和qPCR分子生物學檢測方法在病原菌檢測中的應用越來越廣[6-7]，但這些方法的檢測成本高，需要精密昂貴的熱循環儀器，且對實驗環境和操作者的技術也有嚴格的要求，因此限制了該技術的普遍適用性，不利于在農村地區以及基層實驗室的推廣應用。

環介導等溫擴增技術(Loop-mediated isothermal amplification, LAMP)是Notomi等建立的一種新的核酸擴增方法[8]。其原理是利用4條特殊設計的引物及具有鏈置換活性的BstDNA聚合酶，在恒溫條件下特異、高效、快速的擴增DNA，可以在1 h之內使產物的量達到109個拷貝。最近幾年，LAMP以其靈敏度高、特異性好、反應速度快和操作簡單等特點在各種病原菌檢測中的應用越來越廣[9]。本研究的目標是建立一種嗜水氣單胞菌的快速、可靠的LAMP技術，并使用糞便模擬標本和實際臨床樣本對該技術的檢測能力進行評價，以期將該項技術在基層實驗室及農村地區進行大規模的推廣使用。

1材料與方法

1.1材料

1.1.1菌株來源本實驗所用標準菌株購自中國藥品生物制品檢定所，其他菌株分離自食品、糞便和嘔吐物等樣品，均經德靈WALKAWAY-40SI全自動微生物分析儀鑒定。用于特異性評價的菌株見表1。

表1　實驗用菌株

1.1.2試劑與儀器設備Loopamp Kit (Eiken Chemical Co. Ltd., Tokyo, Japan)購自日本榮研公司。Premix Ex TaqTM、Easy Dilution、pMD18-T載體、JM109 感受態細胞、Ex Taq DNA聚合酶以及小量質粒提取試劑盒均購自大連寶生物工程有限公司。細菌基因組DNA抽提試劑盒購自Promega公司。Loopamp實時濁度儀LA-320(Eiken Chemical Co., Ltd, Japan)購于日本榮研公司。ABI 7900Fsat 實時熒光定量PCR儀為美國應用生物系統公司產品。

1.2方法

1.2.1細菌基因組DNA的提取細菌基因組DNA的提取使用TAKARA公司的MiniBEST試劑盒，按照說明書進行操作。利用紫外分光光度計測定細菌基因組DNA的純度和濃度，嗜水氣單胞菌基因組DNA用EasyDilution緩沖液稀釋至5×105～ 5×10-3pg/μL的濃度梯度，陰性對照用EasyDilution緩沖液稀釋至5×104pg/μL，各種基因組DNA均少量分裝，-20 ℃保存備用。

1.2.2 LAMP引物的設計及LAMP反應體系的建立 根據嗜水氣單胞菌特異性基因desA設計交叉反應引物。我們利用多序列比對軟件ClustalX 1.83對嗜水氣單胞菌的參考菌株進行desA基因的序列比對，在該基因的保守區域使用引物設計軟件PrimerExplorer V4 software(http://primerexplorer.jp)(Eiken Chemical Co. Ltd., Tokyo, Japan)在線進行LAMP引物設計，并將設計的引物在NCBI數據庫中進行序列比對分析，以排除引物與其他物種序列可能存在的非特異性匹配。引物設計的位置和方向見圖1，序列見表2。LAMP的反應體系如下：引物F3和B3的濃度為5 pmol，引物FIP和BIP的濃度為40 pmol，引物LF和LB的濃度為20 pmol，Betain的濃度為2.5 mol/L，MgSO4的濃度為150 mmol/L，dNTP的濃度為10 mmol/L，BstDNA polymerase 的濃度為8 U，模板為2 μL，補加去離子水至25 μL。整個反應在LA320實時濁度儀中進行，等溫擴增65 ℃1 h，80 ℃5 min終止反應。由于擴增產物是一系列反向重復的靶序列構成的莖環結構和多環花椰菜樣結構的DNA片段混合物，擴增產物可以通過凝膠電泳進行檢測；LAMP在合成DNA的同時還產生大量的焦磷酸根離子，它們能與鎂離子結合生成白色的焦磷酸鎂沉淀，擴增產物也可以通過濁度進行檢測。

1.2.3評價LAMP檢測技術的靈敏度和特異性 含desA基因的質粒標準品的構建與制備 ①使用desA特異引物進行PCR擴增后得到目的片段；②切膠回收，純化PCR 產物；③連接到T載體；④轉化JM109 感受態細胞；⑤篩選陽性克隆子，用PCR 進行驗證，最終測序確認；⑥提取質粒，根據質粒的分子量將質粒樣品濃度換算為拷貝數濃度：每μL樣品中檢測基因的拷貝數=濃度(ng/μL)×阿佛加德羅常數×10-9/(660×重組質粒堿基數)；⑦用Easy Dilution將上述質粒依次稀釋成1.0×100拷貝/μL～1.0×106拷貝/μL，共7個濃度梯度。

1.2.3.1LAMP檢測的靈敏度評價取質粒標準品加入每反應體系100拷貝至106拷貝為模板，每個濃度進行3次重復，評價LAMP檢測體系的靈敏度。

1.2.3.2LAMP檢測的特異性評價以常見致病菌及條件致病菌DNA(見表1)為模板評價LAMP體系的特異性。

1.2.4LAMP與qPCR技術檢測能力比較qPCR技術對嗜水氣單胞菌的檢測(本科室建立)所用的引物探針見表1。qPCR的反應總體系為20 μL，含2×Premix(TaKaRa) Ex TaqTM 10 μL、10 μmol/ L的引物探針各0. 4 μL、DNA 模板1 μL，補加去離子水至20 μL。在ABI 7900實時熒光定量PCR儀上擴增并測定結果，PCR 循環參數：95 ℃預變性30 s；95 ℃變性5 s，60 ℃延伸34 s，共40個循環。擴增結束后，扣除本底熒光信號后取同一閾值分析數據，確定各樣本的Ct(cycle threshold) 值。通過靈敏度、特異性這兩方面對這兩種檢測技術進行比較。LAMP技術的反應體系和反應參數如上所述。

1.2.5評價LAMP技術在糞便模擬樣本中的應用①嗜水氣單胞菌(ATCC7966)搖菌至對數生長期。②用磷酸鹽緩沖液將該菌培養物進行10倍連續稀釋，并進行平板計數。③取健康人新鮮糞便0.2 g/管，分別加入100 μL不同濃度的嗜水氣單胞菌稀釋懸液，制成5×101～ 5×106CFU/g 梯度濃度的糞便模擬標本。④應用QIAamp DNA stool mini kit(QIAGEN, Venlo, Netherlands)試劑盒抽提所有糞便標本，每個菌濃度進行3次重復，平行獨立提取DNA進行qPCR和LAMP檢測。

1.2.660份臨床樣本的檢測60份腹瀉病人的糞便標本分別進行分離培養鑒定、qPCR和LAMP檢測。培養分離方法的操作步驟如下。首先標本使用堿性蛋白胨水(APW, pH 8.5)進行增菌過夜培養，然后取適量接種于嗜水氣單胞菌的選擇性培養基(Ryan, OXOID, 英國)。該培養基在30 ℃～35 ℃孵育18 h后，挑選疑似嗜水氣單胞的菌落(青綠色，菌落中心為不透明的深綠色)進行生化鑒定。接著將初步鑒定為嗜水氣單胞菌的菌株進行管家基因rpoD的擴增和測序，將測序結果在GenBank上用Blast進行比對，最后對嗜水氣單胞菌株進行確認。LAMP和qPCR的檢測體系如前所述。將適量的堿性蛋白胨水增菌液使用DNA提取試劑盒(QIAamp DNA minikits; Qiagen, Hilden, 德國)提取核酸后，吸取2 μL作為qPCR和LAMP的模板。

表2　實驗中所用引物

2結果

2.1目的基因片段的克隆實驗獲得的desA擴增片段分子量大小與預期結果一致，將所得片段連接到T載體轉化受體菌獲得克隆子中，經測序驗證，所獲陽性克隆包含的目的片段序列完全正確。

2.2LAMP檢測體系的靈敏度LAMP和qPCR針對desA基因的檢測下限分別為20 拷貝每反應體系(Fig.2A)和200 拷貝每反應體系，顯示LAMP在檢測嗜水氣單胞菌DNA時比qPCR方法更靈敏。LMAP的擴增結果可以用電泳方法來檢測(Fig. 2B)，也可以通過加入Loopamp熒光染料(FD)通過肉眼觀察顏色的改變來檢測(Fig.2C)。當存在陽性擴增時，FD染料的桔色快速變為綠色，在黑色背景下更為顯著；當擴增為陰性時，管內顏色維持桔黃色不變。

2.3LAMP檢測方法的特異性評價30株嗜水氣單胞菌核酸檢測均在1 h內出現了陽性擴增，33株非嗜水氣單胞菌核酸檢測都未出現擴增，說明該LAMP檢測技術的特異性好。

2.4LAMP檢測技術在糞便模擬樣本中的應用LAMP檢測技術在糞便模擬標本中的檢測下限為5×103CFU/g，相比之下，qPCR針對desA基因在糞便模擬標本中的檢測下限為5×104CFU/g，說明LAMP比qPCR對糞便模擬標本的檢測更靈敏。

2.5LAMP檢測技術在臨床標本中的應用結果發現LAMP技術能檢測出嗜水氣單胞菌陽性標本9份，而qPCR技術只能檢測出嗜水氣單胞菌陽性標本7份，并且LAMP的檢測結果與分離培養方法相一致(見表3)，說明LAMP技術對臨床標本的檢測能力優于qPCR。因此LAMP檢測可作為一種快速的嗜水氣單胞菌的篩查方法在基層實驗室及現場處理疫情時進行推廣使用。

3討論

(A)通過檢測產物的濁度變化來評價LAMP檢測的靈敏度。1-6:質粒模板濃度分別為2.0×107～1.0×102 拷貝每反應體系，檢測下限為20 拷貝每反應體系。(B) 通過瓊脂糖凝膠電泳來評價LAMP檢測的靈敏度。1-8:質粒模板濃度分別為2.0×107～1.0×100 拷貝每反應體系，檢測下限為20 拷貝每反應體系。(C) LAMP的擴增產物可以通過加入FD熒光染料來檢測。發生陽性擴增時，產物的顏色由最初的橙黃色變為綠色；而陰性擴增的顏色則不會發生改變。

表3　LAMP技術在臨床樣本檢測中的應用

近幾年來，嗜水氣單胞菌作為一種突發的食源性疾病受到越來越多的重視。來自西班牙國家傳染病預防控制中心的數據表明在1997-2006年間所有引起胃腸疾病的細菌中，嗜水氣單胞菌位居第四位[10]。2014年印度研究者[11]報道了1例嗜水氣單胞菌感染引起壞死性筋膜炎導致患者死亡的病例，受到了國內外的高度重視。隨著嗜水氣單胞菌誘發病例的增多，環境保護署(EPA)已經將該菌列入潛在的水傳播病原菌的候選名單[12]。因此，為了給予臨床病人準確快速的治療和嗜水氣單胞菌的流行病學調查，研發一個操作簡單、靈敏度高和特異性好的嗜水氣單胞菌檢測方法成為必要。

雖然嗜水氣單胞菌誘發腸胃炎的致病機理并未完全闡明，但研究者已經對一些潛在的毒力因子進行了深入的研究。攝取鐵離子與一些病原菌的毒力密切相關，人體中的亞鐵血紅素是病原菌鐵離子的一個重要來源，并且許多病原菌本身就具有亞鐵血紅素運輸系統，desA基因是編碼嗜水氣單胞菌亞鐵血紅素鐵離子利用系統的重要基因之一[13]，并且編碼一種外膜蛋白受體，可以從環境中攝取細菌生長和存活所必需的鐵離子，因此是一個理想的檢測目的基因。

傳統的細菌培養和生化鑒定方法費時費力。目前常用的嗜水氣單胞菌商品化檢測系統(API和Vitek, bioMérieux)能夠進行屬水平的鑒定，通常需要24 h，但該過程卻忽略了對溫度和培養基有明顯依賴的脫羧酶和水解酶反應，在將嗜水氣單胞菌與其他密切相近的菌種進行區分時出現了困難[5,14]。PCR技術和qPCR技術的檢測成本高，需要精密昂貴的熱循環儀器，且對實驗環境和操作者的技術也有嚴格的要求，因此限制了該技術的普遍適用性，不利于基層實驗室的推廣應用。相比之下，LAMP檢測技術則具有很多的優勢：1)LAMP對靶序列擴增效率高，體系中其他共存非靶DNA對其擴增的影響較小。LAMP的檢測下限為幾個拷貝，靈敏度遠遠高于普通PCR技術，有研究者證實LAMP的靈敏度等于甚至高于qPCR的檢測靈敏度。2) 產物檢測方便、快捷。因為LAMP在合成各種莖環DNA的同時還產生大量的副產物—焦磷酸鹽，并且生成白色的焦磷酸鎂沉淀物。Mori等[8-9]利用這些特性來檢測LAMP產物，可以直接根據沉淀的形成來定性的判斷擴增反應是否發生，還可以通過檢測其產物濁度的變化進行實時定量檢測。3) LAMP對靶序列擴增的特異性高。由于LAMP通過4條引物與靶序列上的6個特異部位準確結合來產生擴增效應，因此可以獲得比PCR更高的特異性。4) 設備要求簡單，易操作。LAMP反應只需要一個普通的水浴鍋或者恒溫裝置，不需要昂貴的PCR儀。5) 反應速度快。LAMP是恒溫擴增反應，沒有PCR反應中溫度變化的耗時，一般在30 min～60 min內即可完成，比普通PCR和qPCR反應速度更快，能更好的滿足臨床快速檢測的要求。另外，在LAMP反應體系中增加2條環引物可使反應所需時間比原來縮短一半，整個反應可以在40 min內完成，大大提高了檢測效率。這些特性使得LAMP技術更適用于在基層實驗室及現場處理疫情時使用。

本研究首次使用了LAMP技術對嗜水氣單胞菌進行了檢測。LAMP檢測體系對嗜水氣單胞菌重組質粒的檢測靈敏度為1×102拷貝每反應體系，并在檢測30種其他腸道致病菌及院內感染中常見的致病菌時未出現假陽性；LAMP檢測體系在糞便模擬標本中的檢測下限為5×103CFU/g，在60份臨床標本中檢出嗜水氣單胞菌陽性標本9份，該檢測結果與分離培養結果相一致。通過對LAMP檢測技術和qPCR檢測技術進行比較，我們發現LAMP技術無論在檢測靈敏度上還是在檢測速度上都優于qPCR。一般情況下，以分子水平為基礎的檢測方法例如PCR和qPCR都會受臨床標本中抑制物的影響，一些研究者報道LAMP使用的BstDNA聚合酶對樣品中抑制物的耐受能力比qPCR中的Taq酶要強[15]，因此，LAMP比qPCR具有更廣闊的臨床應用前景。

總之，本研究建立的LAMP方法是首次將LAMP技術運用到了嗜水氣單胞菌的檢測，該方法在1 h內就可以觀察結果，滿足了臨床快速診斷的需要，并且該方法對臨床樣本的靈敏度高于qPCR法，反應時間更快，所需儀器設備簡單，可作為一種快速的篩查方法在臨床檢驗、檢疫及基層實驗室進行推廣應用。

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DOI:10.3969/j.issn.1002-2694.2016.01.001

通訊作者：葉長蕓，Email：yechangyun@icdc.cn

中圖分類號：R378

文獻標識碼：A

文章編號：1002-2694(2016)01-0001-06

Corresponding author:Ye Chang-yun, Email:yechangyun@icdc.cn

收稿日期：2015-06-19；修回日期:2015-07-24

Loop-mediated isothermal amplification assay for the detection of Aeromonas hydrophila

MENG Shuang,WANG Yi,WANG Yan,YE Chang-yun

(StateKeyLaboratoryforInfectiousDiseasePreventionandControl,NationalInstituteforCommunicableDiseaseControlandPrevention,ChineseCenterofDiseaseControlandPrevention,Beijing102206,China)

Abstract:To develop a sensitive and specific loop-mediated isothermal amplification(LAMP) assay for the detection of Aeromonas hydrophila, a set of 6 primers targeted toward the desA gene of the A. hydrophila was designed using PrimerExplorer V4 software(Eiken Chemical Co. Ltd., Tokyo, Japan) based on the conserved sequences. The performance of the assay with reference plasmids, simulated human stools, and clinical specimens were evaluated and compared with quantitative PCR(qPCR). No false-positive results were observed for the 33 non-A. hydrophila strains used to evaluate assay specificity. The sensitivity of the LAMP assay was approximately 20 copies per reaction in reference plasmids and 5×103 CFU per gram in spiked human stool, which were more sensitive than the results of qPCR. The performance of the LAMP assay was evaluated with clinical specimens, which had the better detection ability than qPCR. In conclusion, the LAMP assay developed in this study is a valuable method for rapid, cost-effective, and simple detection of A. hydrophila in basic clinical and field laboratories.

Keywords:Aeromonas hydrophila; loop-mediated isothermal amplification; qPCR

國家重大傳染病防治科技重大專項(2013ZX10004-101)資助