一起豬瘟病毒感染病例的實(shí)驗(yàn)室診斷

張　平，賀志昊，龍冬梅，馬惠琴，王蕓華，王　云（.貴州省畢節(jié)市動物疫病預(yù)防控制中心，貴州 畢節(jié) 55700；.貴州省納雍縣農(nóng)牧局，貴州 納雍 553300）

一起豬瘟病毒感染病例的實(shí)驗(yàn)室診斷

張平1，賀志昊1，龍冬梅1，馬惠琴1，王蕓華1，王云2
（1.貴州省畢節(jié)市動物疫病預(yù)防控制中心，貴州 畢節(jié) 551700；2.貴州省納雍縣農(nóng)牧局，貴州 納雍 553300）

摘要：2015年11月畢節(jié)市納雍縣某豬場3頭育肥豬出現(xiàn)體溫升高不下，食欲減退，糞便干燥，全身皮膚出血等癥狀。臨床剖檢發(fā)現(xiàn)肝、脾、腎多器官廣泛性出血。采集剖檢豬病變組織，提取RNA，利用熒光定量PCR方法檢測，結(jié)果顯示，豬瘟病毒陽性，確診為豬瘟病毒感染。

關(guān)鍵字：豬瘟；臨床癥狀；實(shí)時熒光RT-PCR

豬瘟（Classical Swine Fever，CSF）是由豬瘟病毒引起豬的一種急性、熱性、接觸性傳染病。以發(fā)病急、高熱稽留和細(xì)小血管壁變性引起廣泛出血、梗死和壞死等變化為特征。1885年首先在美國發(fā)現(xiàn)，以后傳播到世界各大洲[1]。中國大部分省都有發(fā)生，主要通過直接接觸，或由于接觸污染的媒介物而發(fā)病。消化道、鼻腔黏膜和破裂的皮膚均為感染途徑。一年四季都可發(fā)生，以春夏多雨季節(jié)為多[2-4]。2015年11月畢節(jié)市納雍縣某豬場飼養(yǎng)的3頭育肥豬，出現(xiàn)，體溫升高不下，食欲減退，糞便干燥，全身皮膚出血等癥狀。臨床剖檢發(fā)現(xiàn)心肝脾肺腎多器官廣泛性出血。剖檢采集豬脾、腎、腸系膜淋巴結(jié)，采用實(shí)驗(yàn)室實(shí)時熒光RT-PCR診斷技術(shù)，最終確診為豬瘟病毒感染引起。

1　材料與方法

1.1材料

1.1.1病料采集發(fā)病豬肝、脾、腎、腸系膜淋巴結(jié)放在50％甘油生理鹽水溶液中，低溫保存送至市動物疫病預(yù)防控制中心獸醫(yī)實(shí)驗(yàn)室。

1.1.2主要試劑世紀(jì)元亨豬瘟病毒提取試劑盒，豬瘟病毒通用型熒光定量PCR試劑盒。

1.2方法

1.2.1樣品的處理分別從豬肝、脾、腎、腸系膜淋巴結(jié)取約1 g組織，用手術(shù)剪剪碎混勻后取0.2 g于研磨器中研磨，加入1.5 ml生理鹽水，研磨均勻后離心取100 μl上清液于滅菌離心管中。

1.2.2總RNA提取按照豬瘟病毒提取試劑盒說明書進(jìn)行。

1.2.3實(shí)時熒光RP-PCR檢測反應(yīng)采用20 μl體系，反應(yīng)體系為：無菌無核酸水2.7 μl，RT-PCR反應(yīng)液10 μl，酶混合液0.4 μl，熒光探針1.9 μl，RNA模板5 μl。反應(yīng)條件為：45℃15 min，95℃1 min；95℃5 s，60℃35 s，在每個循環(huán)第二步收集FAM熒光信號，共40循環(huán)（報(bào)告基因“FAM”，淬滅基團(tuán)“NONE”）。

2　試驗(yàn)結(jié)果

2.1臨床癥狀

病豬極度消瘦，被毛粗亂，精神沉郁，體溫升高，眼角可見分泌物，大便干燥且惡臭，部分豬只四肢、耳后出現(xiàn)出血斑癥狀。

2.2剖檢癥狀

對病死豬只剖檢可見全身性出血，脾臟明顯梗死，肝臟、肺臟表面有壞死灶，腎臟水腫，皮膚出現(xiàn)紫斑，膀胱黏膜中有小點(diǎn)出血，腸壞死，腸系膜淋巴結(jié)腫脹。

2.3實(shí)時熒光RT-PCR試驗(yàn)結(jié)果

對3份組織總RNA進(jìn)行實(shí)時熒光RT-PCR檢測，結(jié)果顯示，3份樣品均為陽性（見圖2）。

由圖2可知病死豬3份組織樣品RNA均呈現(xiàn)出特異性擴(kuò)增曲線。根據(jù)試劑盒說明書，CT值在25.3172～29.2240范圍。根據(jù)說明書結(jié)果判定CT＜30且呈現(xiàn)特異性擴(kuò)增曲線，判定三份樣品均為CSF陽性。

圖1病死豬剖檢病變

圖2 CSF實(shí)時熒光RT-PCR檢測結(jié)果A1：陽性對照；C1：陰性對照；B1/D1/H1：待檢樣品

3　討論

豬瘟一直是感染率、發(fā)病率、死亡率都很高的傳染病，一旦發(fā)生會給養(yǎng)豬業(yè)帶來很大損失，因此豬瘟的預(yù)防及診斷問題一直備受世界各國關(guān)注[5,9]。近年來豬瘟的流行和發(fā)病特點(diǎn)已轉(zhuǎn)變?yōu)橐苑堑湫拓i瘟為主的流行形勢，在臨床以及剖檢上出現(xiàn)不同于典型豬瘟的特征性病變，給豬瘟臨床診斷帶來極大困難，開展實(shí)驗(yàn)室確診成為一種準(zhǔn)確、方便的診斷方法[6,7]。實(shí)時熒光RT-PCR方法，在PCR擴(kuò)增過程中，通過熒光信號，對PCR進(jìn)程進(jìn)行實(shí)時檢測。具有操作簡單，特異性強(qiáng)，重復(fù)性好等特點(diǎn)，已然成為實(shí)驗(yàn)室檢測動物疫病的主要手段[8,10,11,12]。相信隨著分子生物學(xué)技術(shù)的不斷發(fā)展，豬瘟病毒檢測技術(shù)將更靈敏、更特異、更快速、通量更大，檢測豬瘟病毒手段將更豐富、更高效，從而有利于開展豬瘟的檢測工作。

本實(shí)驗(yàn)采用分子生物學(xué)技術(shù)對3頭臨床豬瘟癥狀不典型的育肥豬進(jìn)行實(shí)時熒光RT-PCR方法的檢測，確診了該次疫病由豬瘟病毒引起。為今后實(shí)驗(yàn)室確診豬瘟病毒引起非典型豬瘟提供科學(xué)依據(jù)。

參考文獻(xiàn)：

[1]蔡寶祥.實(shí)用家畜傳染病學(xué)[M].上海：上海科學(xué)技術(shù)出版社,1989.

[2]姚文生,范學(xué)政,王琴,等.我國豬瘟流行現(xiàn)狀與防控措施建議[J].中國獸藥雜志,2011,45(9):44-47.

[3]王娟萍,姚敬明,吳忻,等.規(guī)?；N豬場豬瘟免疫情況調(diào)研[J].中國畜牧獸醫(yī),2012,39(1):184-187.

[4]王琴,范學(xué)政,趙啟祖,等.豬瘟防控技術(shù)研究進(jìn)展[J].中國獸藥雜志,2012,46(9):58-61.

[5]陳甜甜,程福亮,梁瑾,等.豬瘟和豬藍(lán)耳病病毒多重RT-PCR檢測方法的建立及初步應(yīng)用[J].中國生物制品學(xué)雜志,2013(3):425-429.

[6]劉建,湯德元,李春燕,等.我國豬瘟流行新趨勢與防控措施[J].中國豬業(yè),2013,8(2):37-39.

[7]石順利.檢測豬瘟病毒實(shí)時熒光定量PCR方法的研究[D].內(nèi)蒙古農(nóng)業(yè)大學(xué),2014.

[8]李嬌,沈志強(qiáng),祖立闖.豬瘟病毒熒光定量PCR檢測方法研究進(jìn)展[J].動物醫(yī)學(xué)進(jìn)展,2012,33(5):89-93.

[9]高順.淺談豬瘟病毒[J].畜牧獸醫(yī)科技信息,2015(10):89-89.

[10]劉坤,蘭鄒然,姜平.豬瘟病毒分子生物學(xué)及檢測技術(shù)研究進(jìn)展[J].動物醫(yī)學(xué)進(jìn)展,2012,33(10):99-104.

[11]Moennig V，Becher P，Beer M.Classical swine fever.[J].Australian Veterinary Journal，2013，135(2):167-174.

[12]Huang C,Chien M S,Lin G J.Yeast expressed classical Swine fever virus glycoprotein E2 and use thereof:US，US 20140099338 A1[P].2014.

（編輯：高真貞）

中圖分類號：S852.65+1

文獻(xiàn)標(biāo)識碼：B

文章編號：1006-799X(2016)04-0092-02

作者簡介：張平（1988-），女，安徽阜陽人，主要從事獸醫(yī)實(shí)驗(yàn)室檢測工作。