甘肅野生甘草內生菌發酵液與宿主水煎液、總黃酮、總皂苷對LPS致raw264.7分泌炎癥因子的影響△

董金香鄧　毅，2*劉　靚趙　妮曼　瓊吳國俠楊志軍（.甘肅中醫藥大學　蘭州730000；2.甘肅省中藥藥理與毒理學重點實驗室　蘭州　730000）

甘肅野生甘草內生菌發酵液與宿主水煎液、總黃酮、總皂苷對LPS致raw264.7分泌炎癥因子的影響△

董金香1鄧毅1，2*劉靚1趙妮1曼瓊1吳國俠1楊志軍1（1.甘肅中醫藥大學蘭州730000；2.甘肅省中藥藥理與毒理學重點實驗室蘭州730000）

摘要：目的：研究甘肅野生甘草內生菌發酵液與宿主水煎液、總黃酮、總皂苷對LPS刺激的raw264.7細胞炎癥模型分泌炎癥因子的調節作用。方法：采用Griess法、ELISA法檢測甘肅野生甘草內生菌有效菌株發酵液與宿主水煎液、總黃酮提取物、總皂苷提取物對LPS刺激raw264.7細胞分泌NO、TNF-α、IL-6含量。結果：經LPS刺激后，與模型組相比，野生甘草的水煎液和野生甘草的總黃酮、總皂苷以及其有效菌株的發酵液均能抑制NO、TNF-α、IL-6的分泌（P＜0.05）。結論：甘草內生菌JTYB018、JTYF027的發酵液有抑制raw264.7分泌NO、TNF-α、IL-6的作用。

關鍵詞：甘草 raw264.7內生菌 總黃酮 總皂苷 抗炎

甘草，補脾益氣，清熱解毒，祛痰止咳，緩急止痛，調和諸藥，由于療效好、作用廣，素有“中草藥之王”的美譽。植物內生菌（endophyte）是指生活在健康植物組織和器官內部的真菌或細菌，不會使宿主植物致病，是宿主植物在長期進化過程中衍生出的一類微生物，與宿主植物相互影響能產生與其相同或相似的作用成分。又有研究發現，甘草總黃酮［1～3］和甘草總皂苷［4］有不同途徑的抗炎作用，考慮其內生菌是否能產生甘草總黃酮、甘草總皂苷或與其相似結構的物質從而取代甘草，為解決植物甘草的大量需求，緩解資源瀕臨滅絕的危機，本實驗從甘草的抗炎作用方面著手探究，比較觀察5株有效菌株與宿主水煎液、總黃酮、總皂苷體外抗炎的效果。

1材料

1.1藥品：甘肅省酒泉市金塔縣野生烏拉爾甘草Glycyrrhiza uralensis Fisch。

1.2試劑：raw264.7，LPS，DMEM培養基，血清，青霉素-鏈霉素溶液，PBS，乙醇，氨水，濃鹽酸，馬鈴薯葡萄糖水（馬鈴薯葡萄糖培養基HB0233）營養瓊脂（NA，青島高科園海博生物技術，營養肉湯）一氧化氮檢測試劑盒（TNF-α試劑盒，IL-6試劑盒）。

1.3儀器：超凈工作臺（天津市泰斯特儀器有限公司，型號：CJ-2S），9082-B型電熱恒溫培養箱（上海福瑪實驗設備有限公司），二氧化碳培養箱（SHEL L/JB），醫用低速離心機（金壇市恒豐儀器廠，LXJ-802），全溫搖床柜（IKA-KS 4000i control），倒置顯微鏡（Ti-nikon），LDZX-30FB立體壓力蒸汽滅菌鍋（上海申安醫療器械廠），酶標儀。

2方法

2.1內生菌發酵液的制備和有效菌株的篩選：將野生甘草內生菌分離純化培養［5］，最終從野生甘草中分離出63株內生菌，其中內生細菌31株（JTYB001、JTYB002、JTYB003…JTYB031），內生真菌32株（JTYF001、JTYF002、JTYF003…JTYF032）；在無菌操作臺中，從已活化好的NA、PDA平板培養基挑取2環菌餅于

250mL裝有100mL的營養肉湯和馬鈴薯葡萄糖培養基的搖瓶中，分別以28℃、170r/min的搖床上震蕩培養4d、7d，得到發酵液。將發酵液經6層紗布過濾，放于蒸發皿中，在水浴鍋調至70℃蒸干至浸膏，分別稱取10mg，用DMEM培養基定容至5mL，即得2mg/mL的母液，備用。測其對LPS致raw264.7分泌NO、TNF-α、IL-6炎癥因子量的影響，從而篩選出有效的菌株。2.2甘草水煎液的制備：野生甘草破碎至1～3mm長度，取10g加100mL水，浸泡30min，武火加熱，文火煎煮60min，4層紗布過濾，濾液旋轉蒸干至浸膏，稱取4g，用DMEM 2mL稀釋，得到2mg/mL的母液，于冰箱保存備用。

2.3甘草總黃酮和總皂苷制備：在乙醇濃度80%，料液比1∶10和40℃的條件下，超聲提取40min。將提取液濃縮，加氨水直至溶液為堿性，用乙酸乙酯萃取4次，濃縮至固體，即得甘草總黃酮，紫外分光法測得其含量為75%。收集下層萃取液，加鹽酸至pH 為1～2，冰箱靜置，使甘草總皂苷充分沉淀，離心，取沉淀，干燥至恒重，即得甘草總皂苷，紫外分光法測得其含量為45%［6］。

2.4細胞培養與儲存：將raw264.7放于含10%的胎牛血清和1%的青霉素-鏈霉素的DMEM高糖培養基中，37℃、5%CO2培養箱中進行傳代培養，直至實驗所需量，再將5～10支細胞株凍存在-80℃超低溫冰箱，隔夜后永久保存在液氮中。

2.5采用Griess法檢測細胞上清液中NO的含量：用Griess法檢測內生細菌發酵液對LPS誘導的NO產物的抑制作用，取指數生長期raw264.7配制成細胞懸液，分別以1×106個/mL接種于96孔板中，培養24h，棄去培養液，每孔加100μL不完全培養基，饑餓4h吸棄。空白組加完全培養基200μL，LPS組加100μL完全培養基和100μL（20μg/mL）LPS，終濃度為10μg/mL；實驗組加入100μL LPS（20μg/mL）和JTYB0028、JTYF027的樣品母液，終濃度為10μg/mL，每個樣品有6個復孔，干預24h。實驗分為空白對照組、LPS陽性對照組、LPS加JTYB028組、LPS加JTYF027組，48h后檢測細胞上清液中NO的含量，按照Griess試劑盒說明書操作。

2.6雙抗體夾心ELISA實驗：方法同“2.5”，實驗組加入100μL LPS（20μg/mL）和100μL的JTYB018、JTYF027樣品母液，終濃度為10μg/mL，具體操作按照試劑盒說明書。

3結果

各有效菌株發酵液與宿主水煎液、總黃酮、總皂苷對raw264.7分泌NO、TNF-α、IL-6的影響，結果見表1。

表1各樣品溶液對raw264.7分泌NO、TNF-α、IL-6的影響（±s）（n=6）

表1各樣品溶液對raw264.7分泌NO、TNF-α、IL-6的影響（±s）（n=6）

注：JTYB：野生甘草內生細菌，JTYF：野生甘草真菌

組別（10μg/mL）　NO濃度/（μmol/L）　TNF-α濃度/（pg/mL）　IL-6濃度/（pg/mL）空白組3.18±2.21**　193.38±86.30**　10.76±5.69**模型（LPS）組　14.28±2.10　2803.46±343.43　3031.06.±796.50野生甘草水煎液組　8.14±3.247**　1783.12±220.71**1443.23±569.68**野生甘草總黃酮組　5.65±2.44**　1700.52±124.23**1482.89±510.15**野生甘草總皂苷組　5.35±2.32**　1911.18±508.01**1704.85±449.34**JTYB018　7.75±2.79**　1502.21±334.23**☆　1594.47±320.83**JTYF027　6.99±1.83**　1620.84±502.54**1519.76±490.74**

與模型組比較**P＜0.05；與野生甘草總皂苷組比較☆P＜0.05。

結果表明，在LPS刺激下，模型組細胞釋放的NO、TNF-α、IL-6濃度高于空白組（P＜0.05），造模成功。與模型組相比，野生甘草水煎液、野生甘草總黃酮、野生甘草總皂苷和野生甘草各有效菌株對炎癥模型Raw264.7炎癥因子的分泌均有抑制作用（P＜0.05）；與野生甘草水煎液組、野生甘草總黃酮組、野生甘草總皂苷組相比，JTYF027無差異，表明其抑制作用無差異；JTYB018的TNF-α分泌量與野生甘草總皂苷比較；強于野生甘草總皂苷組（P＜0.05）；JTYB018的NO和IL-6分泌與野生甘草水煎液組、野生甘草總黃酮組、野生甘草總皂苷組相比無差異。

4討論

LPS是革蘭氏陰性菌的主要致病成分，成為現代體外實驗常用的造模用藥。研究發現，當巨噬細胞受到外界抗原刺激時（如內毒素）便會釋放一氧化氮（NO）、白介素（IL）、腫瘤壞死因子（TNF）等重要的炎癥細胞因子，它們均可促進炎癥反應和組織損傷。本實驗中，通過觀察LPS誘導炎癥因子NO、TNF-α、IL-6的分泌量判斷體外炎癥模型造的成功與否。從實驗結果中可以得出野生甘草水煎液、野生甘草總黃酮和野生甘草總皂苷組抑制炎癥因子分泌作用與JTYF027對NO、TNF-α、IL-6分泌的作用無差異，而JTYB018的抑制TNF-α作用還高于野生甘草總皂苷組，其他亦無差異。我們假想菌株的代謝產物中可能含有與甘草藥效成分相關的物質。本課題后續部分，我們將思考大批量生產發酵液，并從發酵液中進行成分的提取分離方面的研究，考慮是否有與植物甘草提取的成分相關或相似的物質，從而為解決甘草資源逐漸緊缺問題奠定基礎。

參考文獻

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［2］歐陽國棟，吳淵，王陳坤，等.復方甘草酸苷治療抗結核藥物性肝炎的臨床療效［J］.臨床研究，2012，2（4）：172-173.

［3］張宏方.中藥甘草作為“使藥”的規律探討［J］.陜西中醫學院學報，2010，33（5）：5-7.

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［5］劉霞，黨峰峰，賀曉龍，等.陜北野生甘草內生菌的分離及抑菌活性篩選［J］.西北植物學報，2010，30（10）：2110-2115.

［6］吳桐，白長勝，譚佳音，等.烏拉爾甘草內生真菌的分離及其抑菌活性研究［J］.中國食品學報，2014，2（14）：155-160.

中圖分類號：R284.1

文獻標識碼：B

文章編號：1672-8351（2016）07-0137-02

基金項目：△國家自然基金：甘草內生菌有效菌株代謝產物與甘草藥效成分的相關性研究，編號81360633。

*通訊作者