食品微生物DNA能力驗證樣品的均勻性和穩(wěn)定性研究

侯大海，劉云國，張　亮，徐云峰，劉凌霄

（1.新疆大學(xué)生命科學(xué)與技術(shù)學(xué)院，新疆烏魯木齊　830046；2.廣東產(chǎn)品質(zhì)量檢驗監(jiān)督研究院，廣東廣州　510330；3.青州榮美爾生物科技有限公司，山東青州　262500；4.黃島出入境檢驗檢疫局，山東青島　266000）

食品微生物DNA能力驗證樣品的均勻性和穩(wěn)定性研究

侯大海1，2，*劉云國1，3，張亮3，徐云峰4，劉凌霄3

（1.新疆大學(xué)生命科學(xué)與技術(shù)學(xué)院，新疆烏魯木齊830046；2.廣東產(chǎn)品質(zhì)量檢驗監(jiān)督研究院，廣東廣州510330；3.青州榮美爾生物科技有限公司，山東青州262500；4.黃島出入境檢驗檢疫局，山東青島266000）

食品微生物DNA能力驗證，是利用DNA檢測方法，通過實驗室間微生物檢測結(jié)果的比對來確定實驗室檢測能力的活動。以沙門氏菌（Salmonella）基因組DNA為測試目標，開展了實驗室間食品微生物DNA檢測能力驗證樣品的制備，研究了DNA檢測能力驗證中樣品的均勻性和穩(wěn)定性，以期為食品微生物DNA能力驗證的運作提供指導(dǎo)。

食品微生物；DNA能力驗證；均勻性；穩(wěn)定性

實驗室能力驗證，是通過實驗室間檢測結(jié)果的比對來確定實驗室能力的活動。通過持續(xù)地開展實驗室能力驗證活動，可以有效地提高實驗室的品質(zhì)控制能力和檢測水平，并提高檢測結(jié)果的可靠性和權(quán)威性［1］。同時，為科研工作以及政府管理工作提供科學(xué)、客觀的信息。常規(guī)微生物能力驗證，通常指寄送含或不含目標測試菌盲樣時的驗證能力。由于可能存在致病微生物，常規(guī)微生物能力驗證方式在檢測樣品的運輸、儲存、檢測時，存在較大的生物安全隱患。實驗室能力驗證活動中采用滅活的微生物，通過提取DNA進行檢測的方法可消除這種危險。因而研究食源性致病微生物時，DNA檢測能力驗證的運作極其重要。能力驗證計劃中的樣品制備不同于一般檢測樣品的制備，除保證樣品具有代表性和可靠性外，還應(yīng)考慮樣品的均一性和穩(wěn)定性［2］。基于以上能力驗證規(guī)則的要求，本文研究了沙門氏菌（Salmonella）DNA樣品能力驗證中的均勻性和穩(wěn)定性試驗。

1　材料與方法

1.1沙門氏菌的培養(yǎng)和制備

沙門氏菌菌株，來源于美國典型微生物菌種保藏中心（ATCC）。沙門氏菌標準菌株（ATCC 49416）經(jīng)活化后，挑取單菌落接種到含有200 mL的TSBYE三角瓶中大量培養(yǎng)，以轉(zhuǎn)速10 000 r/min離心5 min收集沉淀，加入雙蒸水重新懸浮，水浴滅活后，分裝到Eppendorf管中凍干制樣［3］。

1.2均勻性試驗

若F＜自由度為（v1，v2） 及給定顯著性水平α（通常α=0.05）的臨界值 Fα（v1，v2），則表明樣品內(nèi)和樣品間無顯著性差異，因而樣品是均勻的。

1.3穩(wěn)定性試驗

采用室溫條件下的儲存溫度（20℃），進行穩(wěn)定性試驗。樣品制備完畢后間隔15 d，從沙門氏菌陽性樣品中各隨機抽取6份樣品，進行熒光定量PCR檢測。采用2個樣本均數(shù)顯著性檢驗-t檢驗進行統(tǒng)計分析。

自由度df=2（n-1）

若|t|＜自由度為2（n-1）給定顯著性水平α（α= 0.05）的臨界值t0.05［2（n-1）］，則表明2次檢測結(jié)果無顯著性差異，因而樣品是穩(wěn)定的。

2　結(jié)果與分析

2.1均勻性試驗

（1）樣品A為沙門氏菌陽性樣品。隨機選取A樣品6個，進行熒光定量PCR檢測，結(jié)果與已知本底結(jié)果相吻合，說明均為陽性。CT值的平均值為14.75。

（2）樣品B為沙門氏菌陰性樣品。經(jīng)隨機選取B樣品6個，進行熒光定量PCR檢測，結(jié)果與已知本底結(jié)果相吻合，說明結(jié)果均為陰性。

沙門氏菌陽性樣品的均勻性試驗結(jié)果（熒光定量PCR CT值）見表1，沙門氏菌樣品均勻性試驗方差分析結(jié)果見表2。

表1　沙門氏菌陽性樣品的均勻性試驗結(jié)果（熒光定量PCR CT值）

表2　沙門氏菌樣品均勻性試驗方差分析結(jié)果

F臨界值F0.05（5，6）=4.387，計算的F值為0.106 4，該值＜F臨界值，無顯著性差異，這表明樣品中沙門氏菌含量均勻。

沙門氏菌均勻性試驗熒光定量PCR擴增曲線見圖1。

圖1　沙門氏菌均勻性試驗熒光定量PCR擴增曲線

2.2穩(wěn)定性試驗

沙門氏菌陽性樣品穩(wěn)定性試驗結(jié)果（熒光定量PCR CT值）見表3。

表3　沙門氏菌陽性樣品穩(wěn)定性試驗結(jié)果（熒光定量PCR CT值）

由表3可知，沙門氏菌陽性樣品第1次檢測的平均值結(jié)果為14.73，室溫條件下放置15 d后第2次檢測的平均值結(jié)果為14.93。

沙門氏菌陽性樣品穩(wěn)定性試驗結(jié)果見表4。

表4　沙門氏菌陽性樣品穩(wěn)定性試驗結(jié)果

t臨界值t0.05（10）=2.228，計算所得|t|值＜t臨界值，無顯著性差異，這表明沙門氏菌樣品的穩(wěn)定性良好。

沙門氏菌穩(wěn)定性試驗熒光定量PCR擴增曲線見圖2。

圖2　沙門氏菌穩(wěn)定性試驗熒光定量PCR擴增曲線

3　結(jié)論與討論

本次沙門氏菌DNA能力驗證要求利用基于DNA技術(shù)的分子生物學(xué)手段進行檢測，試驗結(jié)果表明DNA樣品符合均勻性和穩(wěn)定性的要求。實驗室間食源致病微生物DNA檢測能力驗證提供的沙門氏菌檢測樣品已經(jīng)滅活，目的是消除能力驗證活動中食源致病微生物在運輸、儲存、檢測過程中的生物安全隱患。本次能力驗證活動的樣品在制備、保存、運輸、安全性等技術(shù)指標上均能達到實驗要求。本研究以CNAS-RL02∶2011能力驗證規(guī)則、CNASPD21∶2011能力驗證工作程序、CNAS-CL03∶2010能力驗證計劃提供者認可準則、ISO/IEC導(dǎo)則43-1∶1997利用實驗室間比對的能力驗證-能力驗證計劃的建立和運作、CNAS-CL04∶2010標準物質(zhì)/標準樣品生產(chǎn)者能力認可準則等規(guī)則為基礎(chǔ)，結(jié)合食源致病微生物檢測實驗室的特點，通過對樣品均勻性、穩(wěn)定性等關(guān)鍵技術(shù)的研究，旨在建立一個與國際規(guī)范接軌、操作性強的食品微生物能力驗證關(guān)鍵技術(shù)規(guī)范。

［1］中國實驗室國家認可委員會.ISO/IEC 17025∶2005檢測和校準實驗室能力的通用要求 ［S］.北京：中國標準出版社，2005.

［2］中國合格評定國家認可委員會.CNAS-GL02∶2014能力驗證結(jié)果的統(tǒng)計處理和能力評價指南 ［S］.北京：中國標準出版社，2014.

［3］中華人民共和國衛(wèi)生部.GB 4789.4—2010食品安全國家標準食品微生物學(xué)檢驗沙門氏菌檢驗 ［S］.北京：中國標準出版社，2010.◇

Study on Uniformity and Stability of Food Micro-organism DNA Proficiency Testing

HOU Dahai1，2，*LIU Yunguo1，3，ZHANG Liang3，XU Yunfeng4，LIU Lingxiao3
（1.College of Life Science and Technology，Xinjiang University，Urumqi，Xinjiang 830046，China；2.Guangdong Testing Institute of Product Quality Supervision，Guangzhou，Guangdong 510330，China 3.Qingzhou Ronmer Biology Technology Co.，Ltd.，Qingzhou，Shandong 262500，China；4.Huangdao Entry-Exit Inspection and Quarantine Bureau，Qingdao，Shandong 266000，China）

Food micro-organism DNA proficiency testing is to determine the testing capacity by inter-laboratory testing results using DNA testing method.This study organized DNA proficiency testing of food micro-organism using genomic DNA of Salmonella as the test objective.The uniformity and stability of food micro-organism DNA samples are studied in order to provide guidance for the operation of DNA proficiency testing.

food micro-organism；DNA proficiency testing；uniformity；stability

R378

A

10.16693/j.cnki.1671-9646（X）.2016.06.033

1671-9646（2016）06b-0022-03

2016-05-08

新疆大學(xué)自治區(qū)天山學(xué)者科研啟動金資金項目（45030）；新疆自治區(qū)高層次人才引進工程專項經(jīng)費項目（45049）。

侯大海（1976— ），男，碩士，質(zhì)量工程師，研究方向為食品加工。
*

劉云國（1977— ），男，博士，教授級高級工程師，碩士生導(dǎo)師，研究方向為食品生物技術(shù)。