液相色譜串聯質譜法檢測液態乳及原料乳中舒巴坦

安　瑜，王慧芳，張敏娟，唐　欣，李　曉，蘇京晶

（陜西省產品質量監督檢驗研究院，陜西西安　710048）

液相色譜串聯質譜法檢測液態乳及原料乳中舒巴坦

安瑜，王慧芳，張敏娟，唐欣，李曉，蘇京晶

（陜西省產品質量監督檢驗研究院，陜西西安710048）

建立液態乳及原料乳中舒巴坦殘留量的液相色譜串聯質譜法檢測方法。樣品經溶劑提取凈化后，采用Poroshell 120SB-C18型液相色譜柱分離，以水和甲醇為流動相，進行等度洗脫，采用多反應監測模式，外標法定量。結果表明，舒巴坦測定方法檢出限為0.5 μg/kg，線性范圍內低、中、高3個添加水平的回收率為81.8%～87.8%，精密度為3.3%～4.4%。該方法具有簡便快捷、靈敏度高、結果準確等特點，適用于液態乳及原料乳中舒巴坦的檢測。

舒巴坦；液相色譜串聯質譜；液態乳；原料乳；檢測

畜牧養殖過程中，為了給牲畜防病、防疫會普遍使用抗生素，但是抗生素使用中不規范、濫用的情況較為普遍，導致生鮮乳中抗生素殘留超標。人長期食用超過安全限量抗生素的乳制品可產生耐藥性，造成人體腸道菌群紊亂，對易感人群更容易產生過敏反應，從而對人身體健康帶來危害。生鮮乳抗生素殘留一直是乳制品質量安全監管的重點，為了分解生鮮乳中殘留的抗生素以逃避監管，市場上出現了在生鮮乳中添加以β-內酰胺酶為主要成分的抗生素分解劑。衛生部在《食品中可能違法添加的非食用物質名單（第2批）》中明確將β-內酰胺酶列入非食用物質禁止在食品中添加，但目前又出現了添加舒巴坦來抑制β-內酰胺酶活性的問題。舒巴坦作為一種β-內酰胺酶抑制劑，一方面會干擾對β-內酰胺酶的檢測；另一方面人為添加的舒巴坦殘留在乳制品中，會對人身體健康帶來危害。目前，還沒有標準方法對原料乳及液態乳中舒巴坦殘留量進行檢測。

目前，國內外有關舒巴坦的檢測方法主要包括高效液相色譜法［1］、液相色譜-串聯質譜法［2-5］，它們各有優缺點。高效液相色譜法測定方法簡單，易于操作，可以較好地對舒巴坦含量進行定量測定，但其僅通過保留時間進行定性，易出現假陽性。而使用氣相色譜-串聯質譜法時，樣品前處理需要進行衍生化反應，操作復雜，回收率低。液相色譜-串聯質譜法操作簡便、靈敏度高、回收率和重復性良好，可以較好的對舒巴坦進行定性和定量分析，適用于原料乳及液態奶中舒巴坦藥物殘留的測定。

1　材料與方法

1.1材料、試劑與儀器

純牛奶，內蒙古伊利集團產品；調制乳，陜西銀橋集團產品；原料乳，陜西百躍集團產品。

舒巴坦標準品（純度＞99%），德國Dr.ehrenstor-fer gmbh公司產品；甲醇（色譜純），德國默克公司產品。

6420 Triple Quad LC/MS型液相色譜串聯質譜儀、Poroshell 120SB-C18型色譜柱，美國Agilent公司產品；UHP-Ⅲ-20T型超純水機，成都優越科技有限公司產品；BSA224S型電子天平，北京賽多利斯天平有限公司產品。

1.2方法

1.2.1樣品前處理

準確稱取樣品5.0 g（精確到0.01 g） 于50 mL聚丙烯離心管內，加入20 mL甲醇，振蕩提取20 min，于轉速6 500 r/min下離心5 min，上清液轉移至100 mL雞心瓶中，在50℃下旋轉至干，加入1 mL水溶解，渦旋混勻，轉移至2 mL離心管中，于轉速15 000 r/min下離心5 min，上清液過0.2 μm濾膜，供液相色譜串聯質譜儀測定。

1.2.2色譜條件

色譜柱：Poroshell120SB-C18型，3.0mm×100mm× 2.7 μm，或性能相當者；柱溫為30℃；進樣量為5 μL；流動相為水∶甲醇=90∶10，等度洗脫；流速為0.3 mL/min。

1.2.3質譜條件

電離方式：ESI負離子模式；干燥氣：氮氣，純度≥99.9%，10 L/min；離子源溫度：300℃；采集模式：多重反應監測模式（MRM）。

舒巴坦的質譜參數及保留時間見表1。

表1　舒巴坦的質譜參數及保留時間

2　結果與分析

2.1樣品前處理方法的優化

考察了甲醇、0.4%乙酸、乙腈3種提取溶劑的提取回收率及凈化效果。結果表明，當采用甲醇為提取溶劑時，質譜的檢測效果最好，沒有雜峰干擾。舒巴坦的提取回收率比較穩定，均能獲得81.5%～85%的回收率。因此，最終選擇的提取溶劑為甲醇。

2.2色譜與質譜條件的優化

2.2.1色譜柱的選擇

3種色譜柱分離舒巴坦MRM色譜見圖1。

選取了 Agilent公司的Poroshell 120SB-C18型、BEH-C18型和SB-C18型3種色譜柱。結果發現，采用SB-C18型色譜柱和BEH-C18型色譜柱時，舒巴坦峰形較差，不利于結果定性及定量分析；采用Poroshell 120SB-C18型色譜柱時，舒巴坦響應值較高，且峰形和保留時間都比較好。因此，最終選擇色譜柱為Poroshell120SB-C18型。

圖13種色譜柱分離舒巴坦MRM色譜

2.2.2流動相的選擇

考察了甲醇和水、乙腈和水作為流動相對檢測結果的影響。結果表明，當流動相為甲醇-水溶液體系時，質譜響應值最高，并且能夠獲得色譜分離效果，色譜峰形也較好。因此，最終選擇流動相為甲醇-水溶液（配比為10∶90）。

2.2.3質譜條件的選擇

舒巴坦離子MRM色譜及質譜見圖2。

舒巴坦的化學結構表明，此化合物進行電噴霧負離子模式掃描。在負離子模式下，舒巴坦產生140.1 m/z和64.1 m/z的特征離子。最終確定舒巴坦的定量離子對為 232.1/140.1 m/z，定性離子對為232.1/64.1 m/z。對質譜錐孔電壓和碰撞能量進行了優化，確定了舒巴坦的最佳質譜參數，質譜條件見1.2.3。在選定的質譜參數下，舒巴坦均響應良好。

2.3方法的驗證

2.3.1標準曲線和檢出限

采用空白基質匹配標準溶液法，得到液態乳中的標準曲線。空白基質溶液，采用1.2.1中所描述的樣品前處理方法制得。使用空白基質溶液逐級稀釋標準溶液至1.5，5.0，10.0，20.0，50.0，100.0 μg/L質量濃度范圍，在選定的色譜條件和質譜條件下進行測定，得到舒巴坦的線性方程、線性范圍、相關系數和檢出限。

試驗采用空白樣品加標法，分別以各定量離子3倍和10倍信噪比（S/N）對應樣品中目標化合物的濃度，得到檢出限和定量限。

舒巴坦的線性方程、線性范圍、相關系數和檢出限見表2，空白樣品、舒巴坦標準品及加標樣品（50 μg/kg）的MRM色譜見圖3。

圖3　空白樣品、舒巴坦標準品及加標樣品（50 μg/kg）的MRM色譜

2.3.2方法精密度和回收率

本試驗選取3類空白樣品（純牛奶、調制乳、原料乳）加標的方法進行回收率和精密度試驗，在空白樣品中添加低、中、高3個濃度水平（1.5，5.0，50 μg/kg） 的標準溶液，按照1.2.1描述的方法進行測定，每個添加水平平行測定6次。

舒巴坦在樣品中的回收率和精密度見表3。

表3　舒巴坦在樣品中的回收率和精密度

試驗結果表明，回收率在81.8%～87.8%范圍內，精密度（RSD）在3.3%～4.4%范圍內，表明該方法回收率良好，數據結果穩定，可以滿足實際檢測要求。

3　結論

建立了液相色譜串聯質譜檢測液態乳及原料乳中舒巴坦殘留量的方法，該方法具有簡便快捷、靈敏度高、結果準確、回收率穩定等特點，適用于液態乳及原料乳中舒巴坦的檢測與驗證。

［1］劉珊珊，單藝，滿朝新，等.高效液相色譜——二極管陣列檢測法測定原料乳中的舒巴坦 ［J］.食品工業科技，2012（16）：64-66.

［2］崔向云，常建軍，張雪峰，等.UPLC-MS/MS法測定液態乳中舒巴坦殘留 ［J］.中國乳品工業，2014（10）：42-43，45.

［3］張立，李娜思，馮峰，等.超高壓液相色譜-串聯質譜法測定牛奶中的β-內酰胺類抗生素及其酶抑制劑 ［J］.食品安全檢測質量學報，2013，6（4）：1 821-1 827.

［4］馬曉斐，張敬軒，李揮，等.超高效液相色譜-串聯質譜法同時測定液態奶中克拉維酸和舒巴坦 ［J］.食品科學，2013（6）：257-260.

［5］郭啟雷，王浩，楊紅梅，等.液相色譜-串聯質譜法測定牛奶中舒巴坦和他唑巴坦 ［G］//2009年中國有機質譜年會論文集.北京：中國物理學會質譜分會有機質譜專業委員會，2009.◇

Determination of Sulbactam Content in Milk and Raw Milk by LC-MS/MS Method

AN Yu，WANG Huifang，ZHANG Minjuan，TANG Xin，LI Xiao，SU Jingjing
（Shaanxi Testing Institute of Product Quality Supervision，Xi'an，Shaanxi 710048，China）

To develop a method for determination of sulbactam content in milk and raw milk by using LC-MS/MS.Samples are extracted by solvent extraction and cleaned up before chromatographic separation on a Poroshell 120SB-C18column using a mobile phase consisting of water and methanol by isocratic elution.The dyes are analyzed by LC-MS/MS in multiple reaction monitoring（MRM） mode and quantified by the external standard method.The limits of detection for the dyes varied from 0.5 μg/kg.The average recoveries across high，medium and low spike levels are between 81.8%～87.8%with a relative standard deviation（RSD）in the range of 3.3%～4.4%.The method is simple，rapid，sensitive，accurate and suitable for determination of sulbactam content in milk and raw milk.

sulbactam；LC-MS/MS；milk；raw milk；determination

TS252.7

A

10.16693/j.cnki.1671-9646（X）.2016.06.042

1671-9646（2016）06b-0052-03

2016-04-21

安瑜（1985— ），女，碩士，工程師，研究方向為食品安全檢測技術。