遼寧地區貂源銅綠假單胞菌分離鑒定與藥敏試驗

屈騰飛，張小桐，曹嫚嫚，周鐵忠，柴文戌，屈禹城，王春華，陳磊，米成軍，王輝暖?

遼寧地區貂源銅綠假單胞菌分離鑒定與藥敏試驗

屈騰飛1，張小桐1，曹嫚嫚1，周鐵忠1，柴文戌2，屈禹城1，王春華1，陳磊3，米成軍4，王輝暖1?

（1.錦州醫科大學畜牧獸醫學院，遼寧錦州121001；2.錦州醫科大學第一附屬醫院。遼寧錦州121001；3.遼寧省興城市藥王動物衛生監督所，遼寧興城125127；4.山東省臨沂市蘭山區畜牧獸醫局，山東臨沂267004）

為了解遼寧地區水貂銅綠假單胞菌的流行狀況及耐藥情況，對從遼寧地區暴發出血性肺炎養貂場分離的16株分離菌進行了分離純化、生化鑒定、基因鑒定、血清學分型和藥敏試驗。結果顯示，分離株包括G型和B型兩種血清型，其中G型是主要流行血清型，占分離株的75%，其余是B型。分離株對阿米卡星、頭孢呋肟、阿莫西林和亞胺培南的敏感率較高，對氨芐青霉素的敏感率中等，對氯霉素、氨曲南和左氟沙星具有一定的耐藥性。

水貂；銅綠假單胞菌；分離；鑒定；藥敏試驗；血清型

水貂出血性肺炎又稱水貂假單胞菌肺炎，是由銅綠假單胞菌（Pseudomonas aeruginosa，PA），俗稱綠膿桿菌引起的急性、敗血性傳染病，是一類人畜共患的條件致病菌，在水貂以出血性肺炎為主要特征，發病急，死亡快，常呈地方性暴發流行，給養貂業造成巨大經濟損失[1]，該病自1953年丹麥的Knox首次報道以來[2]，相繼在瑞典、芬蘭、美國、法國和日本被報道，1979年我國的劉凱[3]對該病做了首次報道，隨后在國內陸續出現[4-5]。近幾年隨著養貂業快速發展，養殖密度增加，尤其是在炎熱潮濕的夏秋季節，水貂出血性肺炎已呈暴發性流行，成為嚴重危害水貂養殖的重要傳染病。由于引起水貂出血性肺炎的銅綠假單胞菌血清型較多，并且不同血清型之間幾乎沒有交叉感染保護或者交叉保護力低，同時銅綠假單胞菌又具有極強的耐藥性[6]，而目前國內缺少正式上市的水貂出血性肺炎疫苗，因此本研究對采自遼寧各地的水貂出血性肺炎的病料進行分離、基因鑒定、血清學分型并進行了耐藥試驗，以了解遼寧省水貂銅綠假單胞菌的流行特點、耐藥性，為臨床治療和研制疫苗預防該病提供理論依據和參考。

1 材料和方法

1.1 病料和菌株采集2013～2014年遼寧省大連市、盤錦市、營口市、錦州市、葫蘆島市等地暴發出血性肺炎貂場的病貂，銅綠假單胞菌標準菌株ATCC27583本實驗室保存。

1.2 主要試劑十六烷三甲基溴化胺瓊脂培養基（NAC）（購自北京陸橋技術有限責任公司）、藥敏試紙（購自杭州天和微生物試劑有限責任公司）、2×PCR TaqMix、DNA提取試劑盒、膠回收與純化試劑盒（購自北京索萊寶科技有限公司）、綠膿桿菌血清分型用標準陽性血清（日本生研株式會社）。

1.3 細菌分離純化無菌條件下打開病貂的肺臟接種于NAC瓊脂培養基，37℃培養16～24 h，待長出單個菌落，進行革蘭氏染色和菌落形態觀察，同時挑取單菌落進行連續純化培養，直到顯微鏡檢查為單一細菌，將純培養物接種于LB瓊脂糖培養管進行增菌備用，同時接種于NAC瓊脂平板觀察培養特性。

1.4 基因鑒定取1.5 mL菌液按照試劑盒的說明提取分離菌株的DNA，以細菌的16S rRNA為目標基因進行PCR鑒定，引物采用27F和1 492 r通用引物，見表1[7]，反應體系為30μL，其中PCR模板2μL，2×PCR TaqMix 15μL，上下游引物各1μL，去離子水10μL；PCR反應條件：94℃5 min，30個循環，94℃45 s，55℃45 s，72℃45 s，72℃10 min，4℃保存。PCR產物用1.5%瓊脂糖凝膠電泳，然后凝膠成像系統分析結果。結果為目的片段后，膠回收純化PCR產物并送上海生工生物技術有限公司序列測定，序列利用Blast與已知序列進行對比，確定所分離菌株的種屬。

1.5 血清型鑒定根據參考文獻[8]的方法進行操作。

1.6 藥敏試驗按照CLSI 2009版銅綠假單胞菌K-B法標準操作程序和判斷標準進行。

2 結果和分析

2.1 細菌分離純化共分離得到16份菌株，全部能夠在NAC培養基上生長良好，菌落呈圓形、微隆起、扁平、濕潤、大小不一，有水溶性綠色或褐色色素產生，革蘭氏染色為陰性兩端鈍圓的短桿菌，單個或者成雙排列。

2.2 基因鑒定將PCR產物凝膠電泳后，在1 500 bp附近可見清晰的目的條帶（見圖1），膠回收后對PCR產物測序，16株分離株16S rRNA片段長度1 438 bp左右。在NCBI上通過Blast對序列對比，發現分離株序列與銅綠假單胞菌的同源性到達99%，同源性達到97%以上視為同種水平，因此，進一步確認分離的菌株為銅綠假單胞菌屬的銅綠假單胞菌。

2.3 血清型鑒定經玻板凝集試驗鑒定，16株銅綠假單胞菌的血清型見表2，可見在遼寧地區G型和B型是水貂銅綠假單胞菌的主要流行菌株，其中G型占的比例最高，達到75%，；其次是B型占25%，其余血清型未檢出。

圖1 16株分離菌株PCR擴增結果Fig.1 PCR result of 16 isolated strains

表2 16株銅綠假單胞菌血清型鑒定結果Table2 Serotyping result of 16 strains

2.4 藥敏試驗銅綠假單胞菌分離菌株的藥敏試驗結果見表3，可見分離株對阿米卡星、頭孢呋肟、阿莫西林和亞胺培南四種藥物的敏感率較高，分別為88%、75%、69%和66%，而耐藥性較低。對氨芐青霉素的敏感率中等，而對氯霉素、左氟沙星和氨曲南具有一定的耐藥性，其中對氯霉素的耐藥性最高達到75%，其余兩種的耐藥性為44%和50%。

3 討論

本試驗通過銅綠假單胞菌選擇培養基和16S rRNA的基因鑒定，確認從多個水貂出血性肺炎的肺臟中分離的菌株為銅綠假單胞菌，表明銅綠假單胞菌是導致水貂暴發出血性肺炎的重要病原菌之一。隨著水貂出血性肺炎的頻繁暴發，以及對養貂業造成的危害程度，需要獲得該病原菌的病原學、流行病學詳細資料，以期能夠提出有效的防治策略，保障水貂養殖業的健康發展，而目前對銅綠假單胞菌主要針對的是人源銅綠假單胞菌的研究，尤其是人源銅綠假單胞菌耐藥機理的研究，而對貂源銅綠假單胞菌的研究資料相對較少，因此開展更多貂源銅綠假單胞菌的相關研究工作很有必要。

表3 16株銅綠假單胞菌藥敏試驗結果Table3 Results on drug sensitivity test of 16 strains

本次血清型的鑒定結果與閆新武等[9]報道的相同，與其他學者報道的基本相同，只是比例稍有差異外，以及他們還鑒定出少量的其他血清型，比如I型[8，10-12]、C型[6，12-13]、E型[6]、D型和F型[12]，但都以G型為主要血清型，由于不同血清之間沒有交叉保護或者交叉保護力低[6]，這就需要研制能夠包含所有血清型的疫苗才能起到很好的保護作用。

銅綠假單胞菌的耐藥機制比較復雜，主要包括青霉素結合蛋白的突變、外膜蛋白缺乏、產生鈍化酶以及泵的主動外排等，其耐藥性受多個系統參與調控。本次的藥敏試驗結果表明，由于分離株對氨芐青霉素（6%）、氯霉素（6%）、左氟沙星（19%）和氨曲南（6%）的敏感率低于20%，因此不建議在臨床上使用這些藥物治療銅綠假單胞菌的感染。而在抗銅綠假單胞菌的藥物中抗菌活性最高的是阿米卡星，這也是本次藥敏試驗中唯一一個敏感率超過80%的藥物（88%），潘德芹[14]對2010年3月～2014年2月118株臨床分離的貂源銅綠假單胞菌藥敏試驗顯示阿米卡星的敏感率為72%，白雪等[8]檢測2002～2010年間從國內5個省水貂養殖場暴發出血性肺炎的水貂肺中分離獲得45株綠膿桿菌對阿米卡星的敏感率為78%，其他學者的檢測結果也表明貂源銅綠假單胞菌對阿米卡星是敏感的，耐藥率低[9，15-16]，該結果與人源銅綠假單胞菌耐藥性試驗的調查相同。陳越等[17]對2012年中國不同地區7 270株銅綠假單胞菌臨床分離株的耐藥性調查顯示，在檢測的12種臨床常用抗菌藥物中銅綠假單胞菌對阿米卡星的耐藥率最低，為13.5%，同時也是敏感率最高的藥物達到82.3%，而隨后張祎博等[18]對國內19家醫院2005～2014年臨床分離的銅綠假單胞菌耐藥性調查顯示10年間銅綠假單胞菌對阿米卡星敏感率一直是最高的，原因可能是銅綠假單胞菌對氨基糖苷類修飾酶介導的耐藥存在底物特異性，高度耐藥較少；同時臨床上該類藥物較其他類抗菌藥物少。但孫娜等[19]對山東某貂場分離的5株銅綠假單胞菌藥敏分析發現該菌對阿米卡星耐藥，這是新的耐藥趨勢還是其他原因引起的值得進一步的研究。由于銅綠假單胞菌的耐藥性高，耐藥機制復雜，使用單一抗菌藥物治療易產生耐藥，因此建議在臨床上治療銅綠假單胞菌引起的疾病，一方面堅持聯合用藥、規范用藥，另一方面應加強細菌耐藥監測，根據試驗結果及時調整合適的抗菌藥物。

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Identification and Drug Sensitivity Testof Pseudomonas Aeruginosa from Mink

Qu Tengfei1,Zhang Xiaotong1,Cao Manman1,Zhou Tiezhong1,Chai Wenxu2, Qu Yucheng1,Wang Chunhua1,Chen Lei3,Mi Chengjun4,Wang Huinuan1*
(1.College of Animal Husbandry&Veterinary,Jinzhou Medical University,Liaoning Jinzhou 121001; 2.The First Affiliated Hospital,Jinzhou Medical University,Liaoning Jinzhou 121001; 3.Xingcheng Animal Health Supervision Institute,Liaoning Xingcheng 125127; 4.Lanshan of Linyi City Animal Husbandry&Veterinary Bureau,Shandong Linyi 267004)

To investigate the epidemic characteristics and drug resistance of pseudomonas aeruginosa(PA)from minks in Liaoning province,16 bacterial isolated from minks with hemorrhagic pneumonia were identified and characterized by biochemical test,gene,serotypes and drug sensitivity test.Result showed that all 16 isolates were identified as PA by biochemical test and gene.Serogroup G and serogroup B were identified in all isolated strains.Serogroup G was the major serotype,75%of the isolates,The rest is serogroup B.Isolates were high sensitive to amikacin,cefuroxime,amoxicillin and imipenem,moderate sensitivity to ampicillin,and has high resistance to chloramphenicol,aztreonam and levofloxacin.This showed that pseudomonas aeruginosa from mink were multidrug resistance.

Mink;Pseudomonas aeruginosa;Separation;Identification;Drug sensitivity test; Serotype

S852.61

B

1672-9692(2016)11-0001-04

2016-09-15

屈騰飛（1994-），男，河南周口人，本科在讀，從事動植物檢疫工作。

王輝暖（1974-），男，山東威海人，博士，講師。

2014年省級大學生創新創業訓練計劃項目（201410160036）、遼寧省自然科學基金（2015020779）。