解毒化瘀方藥物血清與藥物血漿對模型PC12細胞蛋白酶活化受體-1、細胞外信號調節激酶1/2表達的影響

鄧奕輝，李銀，譚琥，覃弘宇，李定祥

湖南中醫藥大學中西醫結合心腦疾病防治湖南省重點實驗室，細胞生物學與分子技術湖南省高校重點實驗室，湖南 長沙 410208

解毒化瘀方藥物血清與藥物血漿對模型PC12細胞蛋白酶活化受體-1、細胞外信號調節激酶1/2表達的影響

鄧奕輝，李銀，譚琥，覃弘宇，李定祥

湖南中醫藥大學中西醫結合心腦疾病防治湖南省重點實驗室，細胞生物學與分子技術湖南省高校重點實驗室，湖南 長沙 410208

目的比較解毒化瘀方藥物血清與藥物血漿對凝血酶合并缺氧誘導PC12細胞損傷蛋白酶活化受體（PAR）-1、細胞外信號調節激酶（ERK）1/2表達的差異。方法灌胃給藥制備大鼠藥物血清和藥物血漿。采用三氣培養箱和無糖DMEM培養液造成細胞缺氧模擬缺血，并同時加入150 U/mL凝血酶，建立體外缺氧合并凝血酶誘導的PC12細胞損傷模型。實驗分為空白組、模型組、藥物血清組及藥物血漿組。實時熒光定量PCR檢測細胞PAR-1、ERK1/2 mRNA表達，免疫熒光法檢測細胞PAR-1、ERK1/2蛋白表達。結果與空白組比較，模型組PAR-1、ERK1/2 mRNA和蛋白表達增強（P＜0.05）；與模型組比較，藥物血清組和藥物血漿組PAR-1、ERK1/2 mRNA和蛋白表達下降（P＜0.05，P＜0.01）；藥物血漿組PAR-1、ERK 1/2表達較藥物血清組下降（P＜0.05）。結論解毒化瘀方藥物血漿抗缺氧合并凝血酶誘導PC12細胞損傷作用優于其藥物血清。

解毒化瘀方；藥物血漿；藥物血清；PC12細胞；大鼠

中藥血清藥理學是指將中藥或中藥復方經口給動物灌服一定時間后采集動物血液、分離血清，用此含有藥物成分血清進行體外實驗的一種實驗技術［1］。然而，近年來不少學者發現，中藥復方或單味藥藥物血清與血漿在成分和作用上存在差異，且在大多數情況下，中藥藥物血漿較藥物血清具有優勢。

近年來，急性缺血性中風的中醫病機理論取得重大突破，其中王永炎院士提出的“毒損腦絡”病機假說得到了廣泛的研究［2-6］。本課題組認為，缺血性中風主要病機瘀血阻滯、毒損腦絡的形成與凝血酶毒性相關，化瘀解毒法是該病的有效治法。解毒化瘀方為基于“瘀毒”理論的中藥復方，由黃連、黃芩、黃柏、梔子等8味中藥組成。而凝血酶正是通過與蛋白酶活化受體（protease-activated receptor，PAR）結合發揮對神經細胞的毒性作用，同時，細胞外信號調節激酶（ERK）1/2系統在凝血酶誘導的腦耐受中發揮重要作用。故基于本課題組前期體外缺氧合并凝血酶誘導PC12細胞損傷模型的建立，研究該方藥物血清與藥物血漿對上述模型PAR-1、ERK1/2 mRNA和蛋白表達的差異，為血漿藥理學方法的提出提供依據。

1 實驗材料

1.1 動物

SPF級SD大鼠32只，5周齡，體質量180～200g，雌雄各半，湖南斯萊克景達實驗動物有限公司，許可證號SCXK（湘）2013-0005。飼養于室溫18～20 ℃、濕度65%～70%環境，自由飲水飲食。

1.2 實驗細胞

PC12細胞，來源于大鼠的腎上腺嗜鉻細胞瘤細胞，高分化、永生性，長沙贏潤生物技術有限公司，編號2015032007。

1.3 藥物及制備

解毒化瘀方（黃連9g，黃芩6g，黃柏6g，梔子9g，紅花9g，川芎12g，赤芍12g，地龍9g）飲片購自湖南省中醫藥研究院附屬醫院中藥房。第1次加4倍量蒸餾水，煎煮1 h，濾出煎液，第2次加2倍量蒸餾水，煎煮30 min，合并2次煎液，過濾濃縮至2g/mL原藥材藥液，4 ℃冰箱保存備用。

1.4 主要試劑與儀器

DMEM高糖培養基，美國HyClone公司；胰蛋白酶，Sango公司；鏈霉素青霉素混合溶液（100 U/mL青霉素、100g/L鏈霉素）、磷酸鹽緩沖液（PBS，pH 7.2），GIBICO公司；胎牛血清，美國HyClone公司。凝血酶，中國Solarbio試劑公司；Trizol，Invitrogen公司；SYBR Green PCR試劑盒，Thermo公司，批號#K0223；反轉錄試劑盒，Fermentas公司，批號#K1622；一抗-蛋白酶活化受體（PAR-1），sc-13503，Santa Cruz公司；二抗-TRITC標記山羊抗小鼠IgG，CW 0152，康為世紀公司；一抗-p44/42MAPK（ERK1/2），#9102，Santa Cruz公司；二抗-TRITC標記山羊抗兔 IgG，CW 0160，康為世紀公司。普通CO2培養箱（德國賀利氏，Heracell），三氣培養箱（Thermo，3131），Real-time檢測儀（ABI公司，ABI-7300），低溫冷凍離心機（上海盧湘儀離心機儀器有限公司，TG-16M），電動勻漿機（FLUKO，PRO200），旋渦振蕩器（青浦瀘西儀器廠，K30），激光共聚焦顯微鏡（日本奧林巴斯，CSC6F24407）。

2 實驗方法

2.1 藥物血清與藥物血漿制備

SD大鼠適應性飼養7 d，隨機分為空白血漿組、空白血清組、藥物血漿組、藥物血清組，每組8只，藥物血漿組和藥物血清組每日給予解毒化瘀方煎液36.4g/kg灌胃（按動物體表面積劑量換算，相當于5倍臨床等效劑量），空白血漿組和空白血清組予等量蒸餾水灌胃。藥液濃度為2g/mL，每只給藥體積按36.4g/kg換算，每日1次，連續7 d。末次給藥前禁食12 h，末次給藥后1 h，腹腔注射10%水合氯醛（1mL/250g）麻醉，無菌條件下腹主動脈采血。血清組所采血液置于普通采血管，37 ℃水浴30 min，置于4 ℃冰箱過夜，凝固后3000 r/min離心15 min，取上清液為血清。血漿組所采血液置于抗凝管內（所含抗凝劑為1.5%EDTA-Na2，血液∶抗凝劑=9∶1），輕顛3次，使抗凝劑與血液充分混合，3000 r/min離心15 min，取上清液為血漿。將制備好的血清與血漿過濾除菌后分裝，置于-80 ℃冰箱保存備用。

2.2 PC12細胞培養及缺氧缺血損傷模型的建立

PC12細胞用10%胎牛血清，1%100 U/mL青霉素、100g/L鏈霉素混合溶液，90%DMEM高糖培養基配成的完全培養液培養于37 ℃、5%CO2及飽和濕度培養箱中，2 d換液1次，待細胞成長融合后傳代培養。細胞以1×105個/mL接種于96孔培養板，每孔0.18mL，培養24 h待細胞完全貼壁后再加終濃度為50 μg/L神經生長因子誘導分化72 h［7］棄原培養液，加入含150 U/mL凝血酶的無血清低糖培養基，置于三氣培養箱中（5%CO2、1%O2、94%N2）培養模擬缺氧缺血過程，12 h后取出。

2.3 分組

取誘導分化72 h后、融合80%以上PC12細胞進行實驗，隨機分為空白組、模型組、藥物血漿組和藥物血清組。模型組、藥物血漿組和藥物血清組均需加入含150 UU/mL凝血酶的無血清低糖培養基，置于三氣培養箱中培養，空白組加入完全培養液普通培養箱培養。12 h后，棄原培養液，模型組、藥物血漿組和藥物血清組分別加入完全培養液、含10%藥物血漿完全培養液、含10%藥物血清完全培養液，空白組則加入等量完全培養液，均置于普通培養箱培養24 h后備檢。

2.4 指標檢測

2.4.1 實時熒光定量PCR檢測細胞蛋白酶活化受體-1、細胞外信號調節激酶1/2 mRNA表達 引物合成：引物設計合成純化均由Invitroggen Biotechnnology Co.，LTD中國公司完成，所用引物見表 1。細胞總RNA的提取：按照試劑盒說明提取細胞RNA，紫外分光度計測定RNA純度，并進行RNA定量。PCR條件：95 ℃℃預變性10m in，95 ℃變性15 s，60 ℃復性45 s，60 ℃延伸1 min，40個個循環。PCR產物分析：取 PPCR產物瓊脂糖凝膠中電電泳，紫外燈下觀察條帶，數據采用儀器自帶軟件ABBI Prism 7300 SDS Software分析。各標本重復3次，取其平均值。

表1 PCR引物序列

2.4.2 免疫熒光法檢測細胞蛋白酶活化受體--1、細胞外信號調節激酶 1/22蛋白表達 取各組細胞，吸去培養基后PBS洗3次次×10 min，加4%多聚甲醛固定15 min，PBS洗3次×10 min，加加0.5%Triton穿孔10 min，PBBS洗3次×10 min，加5%胎牛血清封閉30 min，加一抗（1∶2000封閉液稀釋），4 ℃過夜，PBS洗3次×100 min，加TTRITC標記的抗小鼠熒光二抗（1∶50封閉閉液稀釋），室溫避光30 min，PBS洗3次× 10 min，加HHoechst332588（1∶200）核染10 min，PBS洗3次×100 min后，加甘油封片，于激光共聚焦顯微鏡下觀察，以平均熒光強度值反映蛋蛋白的表達強度。

3 統計學方法

采用SPSS17.0統計軟件進行分析。實驗結果以

4 結果

4.1 解毒化瘀方藥物血清與藥物血漿對模型大鼠蛋白酶活化受體-1、細胞外信號調節激酶 1/2 mRNA表達的影響

與空白組比較，模型組 PAR-1、ERK1、ERK2 mRRNA表達增增強（P＜0.011）；與模型組比較，藥物血清組和藥物血漿組PAR-1、ERK1、ERK2 mRNA表達下降（P＜00.05，P＜0.001）；藥物血漿組 PAR-1、ERRK1、ERK2mRNA表達較藥物血清組下降（P＜0.005）。結果見表2。

表2 各組細胞PAR-1、ERK1、ERK2 mRNA表表達比較（±s）

表2 各組細胞PAR-1、ERK1、ERK2 mRNA表表達比較（±s）

注：與空白組比較，▲▲P＜0.01；與模型組比較，*P＜0.05，**P＜0.01；與藥物血清組比較，#P＜0.05（下同）

組別 n組PAR-1ERK1ERK2空白組 3 0.003 8±0.000 5 0.008 8±0.000 50.026 0±0.004 6模型藥物藥物組 3 0.05血清組 3 0.02血漿組 3 0.01 3 6±0.008 6▲▲0 7 4±0.003 4**0 4 6±0.004 8**#0 .060 8±0.007 8▲.049 8±0.007 0*.029 7±0.001 9**▲0.174 7±0.025 0.104 2±0.016#0.067 7±0.012 0▲▲5*4**#

4.2 解毒化瘀方藥物血清與藥物血漿對模型大鼠蛋白酶活化受體-1、細胞外信號調節激酶1/2蛋白表達的的影響

與空白組比較，模型組PAR-1、ERK1/2蛋白表達增強（P＜0.011）；與模型組比較，藥物血清組和藥物血漿組PAR-1、、ERK1/2蛋白表達下降（P＜0.05，P＜0.001）；其中，藥藥物血漿組PAR-1、ERK1/2蛋白表達較藥藥物血清組下降（P＜0.05）。結果見表3、圖1、圖2。

表3 各組細胞PAAR-1、ERK1/2蛋白表達比較（±s，平均熒光強度）

表3 各組細胞PAAR-1、ERK1/2蛋白表達比較（±s，平均熒光強度）

組別 n PAR1ERK1/2空白組 33.753 2±0.445 86.950 0±1.684 0模藥藥型組 3物血清組 3物血漿組 3 15.818 7±0 8.761 7±1 6.729 0±0 .350 7▲▲ 2 .348 6** 1 .530 5**# 1 0.696 7±1.808 6 4.900 0±0.975 4 1.395 0±1.231 1▲▲* **#

圖1 PAR-1蛋白表達熒光圖（×600）

圖22 ERK1/2蛋白表達熒光圖（×600）

5 討論

中藥血清藥理學不僅具有體外實驗的優點，如條件可控性強，可以進行大量的藥理效應實驗觀察，較整體動物容易控制，并可在細胞、亞細胞水平進行超微、生化、受體、基因等方面的研究，揭示藥物作用機理較為深入，重復性好，使用材料少等，而且避免了中藥粗制劑直接進行體外實驗的缺陷，更加接近中藥經消化吸收后在體內產生的作用。然而，經消化道吸收的中藥有效成分在體內進入的是血漿，而非血清。不同于血漿，血清是血液凝固后除去纖維蛋白與血細胞的液體成分，血液凝固過程及其激發的一系列生物學反應不僅明顯改變了血液成分，而且對中藥成分與其派生物質可能產生影響。2003年，有學者查閱我國大量發表的有關“血清藥理學”的論著，發現絕大部分其實是“血漿藥理學”，只有少部分是真正的血清藥理學［8］；同時也有學者從血液生理的角度通過實驗研究認為，某些情況下血漿藥理學方法能更好地再現體內環境中產生的藥理效應［9］。因此，賀氏等［10］提出了“血漿藥理學方法”。

近年來，凝血酶在急性缺血性中風發生發展中的作用受到了學術界的重視，凝血酶不僅是血液凝固、血栓形成的關鍵水解酶，而且也通過與 PAR結合發揮對神經細胞的毒性作用。因此，以凝血酶為靶點來研究急性缺血性中風具有重要價值。PAR介導的凝血酶反應在腦損傷中具有雙重作用，凝血酶在低濃度時誘導腦耐受性，而在高濃度時對腦細胞產生毒性效應而加重對腦組織的損害，以上過程是通過信號轉導來實現的。絲裂原活化蛋白激酶（mitogen activated protein kinase，MAPKs）是細胞內的一類絲/蘇氨蛋白激酶，可將胞外刺激信號傳遞給胞核，導致細胞應激和損傷反應。ERK是MAPK家族的一員，屬絲/蘇氨酸蛋白激酶，正常定位于胞漿，當激活后轉位至胞核，調節轉錄因子活性，產生細胞效應。ERK家族有 5個亞族，包括ERK1～ERK5，其中ERK1/2系統在凝血酶誘導的腦耐受中發揮重要作用。ERK1/2磷酸化可促進神經細胞存活，但持續的磷酸化能導致細胞的凋亡。

本研究采用實時熒光定量PCR及免疫熒光法檢測解毒化瘀方藥物血清與藥物血漿對凝血酶合并缺氧誘導PC12細胞損傷模型PAR-1、ERK1/2 mRNA和蛋白表達的影響。實驗結果表明，藥物血漿抗凝血酶合并缺氧誘導PC12細胞損傷作用強于藥物血清。這可能是因為血液通過凝血形成血清的過程中，激活了許多酶類物質以及血小板和白細胞，這些活性物質可能會產生能降解中藥有效成分的作用。同時，凝血過程中形成的纖維蛋白及其網絡的血細胞很可能會吸附或結合一些中藥有效成分，從而減少中藥有效成分，造成效應減弱。因此，對于使用藥物血漿和藥物血清均可的實驗，藥物血漿能更真實地反映藥物療效。

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Effects of Jiedu Huayu Prescription Containing Serum and Plasma on PAR-1 and ERK 1/2 of PC12 Cell Model

DENG Yi-hui， LI Yin， TAN Hu， QIN Hong-yu， LI Ding-xiang
（Key Laboratory of Hunan Province for Prevention and Treatment of Integrated Traditional Chinese and Western Medicine on Cardio-cerebral Diseases， Key Laboratory of Hunan Universities for Cell Biology and Molecular Techniques， Hunan University of Chinese Medicine， Changsha 410208， China）

ObjectiveTo compare the differences betweenJiedu HuayuPrescription containing serum and plasma on PAR-1， ERK1/2 expression of the PC12 cell injury model.MethodsRat serum containing and plasma models was prepared through gavage. Three gas incubators and sugar-free DMEM medium simulated ischemia caused by hypoxia were used， and 150 U/mL of thrombin was added， with a purpose to establish the thrombin-induced hypoxic PC12 cell injury model. The experiment was divided as control group， model group， serum containing group and plasma containing group. Real-time fluorescent quantitative PCR was used to detect the expression levels of PAR-1 and ERK1/2 mRNA in each group； immunofluorescence was used to detect the protein expressions of PAR-1 and ERK1/2.ResultsCompared with the control group， the expressions of PAR-1 and ERK1/2 mRNA and protein in model group were enhanced （P＜0.05）； compared with the model group， the expressions of PAR-1 and ERK1/2 mRNA and protein in serum containing group and plasma containing group decreased （P＜0.05，P＜0.01）； the expressions of PAR-1 and ERK1/2 mRNA and protein in plasma containing group decreased more significantly than serum containing group（P＜0.05）.ConclusionJiedu HuayuPrescription containing plasma was superior to its containing serum against the injury of PC12 cell induced by hypoxic and thrombin.

Jiedu HuayuPrescription； plasma containing medicine； serum containing medicine； PC12 cells； rats

10.3969/j.issn.1005-5304.2016.06.019

R285.5

A

1005-5304（2016）06-0073-04

2015-10-24）

（

2015-11-17；編輯：華強）

國家自然科學基金（81373508）；湖南省自然科學基金（13JJ6061、14JJ2113）；湖南省中醫藥科研基金資助項目（201319）；湖南省教育廳資助項目（12A105）；湖南省重點學科中西醫結合基礎資助項目（2011-2015）；湖南省自然科學創新群體基金（2012年）；湖南省高校科技創新團隊（2012年）

李定祥，E-mai l：ldxlzy@hotmail.com