熱休克蛋白質DnaK的純化及其二聚體性質研究

劉清岱，蘇家躍田雪利楊 營趙 飛，盛長忠（. 天津科技大學食品工程與生物技術學院，天津 00457；. 天津天隆種業科技有限公司，天津 00457；. 丹娜（天津）生物科技有限公司，天津 00457）

熱休克蛋白質DnaK的純化及其二聚體性質研究

劉清岱1，2，蘇家躍1，田雪利1，楊 營1，趙 飛1，2，盛長忠1，3
（1. 天津科技大學食品工程與生物技術學院，天津 300457；2. 天津天隆種業科技有限公司，天津 300457；3. 丹娜（天津）生物科技有限公司，天津 300457）

通過定點突變技術構建了兩個DnaK蛋白質突變體，研究腺嘌呤核苷三磷酸（ATP）和腺苷二磷酸（ADP）條件對熱休克蛋白質DnaK二聚體性質的影響.首先誘導表達DnaK蛋白質的兩個突變體DnaK-A303C和DnaK-H541C，并采用硫酸鎳親和層析和陰離子交換層析對重組蛋白質進行純化.對等量的DnaK蛋白質進行氧化交聯處理，然后采用聚丙烯酰胺凝膠電泳（SDS-PAGE）檢測ATP、ADP對DnaK二聚體的影響.研究表明DnaK突變體在ADP的存在下以同二聚體的形式存在，但是在ATP條件下能夠形成異二聚體.由此為深入認識熱休克蛋白質兩個亞基之間的協同作用提供了實驗依據.

DnaK；ATP；二聚體；突變體

熱休克蛋白70s（heat shock proteins，Hsp70s）是從細菌到哺乳動物中均廣泛存在的一類保守的蛋白質家族，是維持蛋白內穩態所必需的分子伴侶［1］.在果蔬保鮮中，適當的熱處理誘導產生的熱休克蛋白能夠提高果蔬抗冷性，降低冷害［2］，并能通過幫助調節果蔬采后的生理生化代謝［3］，保持果蔬原有品質并延長保鮮期［4-5］.同時在生物醫學領域，熱休克蛋白及其自身抗體可能參與了許多疾病的發病過程［6］.

DnaK是大腸桿菌中的Hsp70蛋白質，能夠促進蛋白合成、折疊、裝配和運輸并且參與變性蛋白的清除［7］.DnaK包括兩個結構域，其中N末端是腺嘌呤核苷三磷酸（ATP）水解酶結構域，C末端是底物結合結構域.DnaK與ATP的結合影響著DnaK蛋白質的結構，在沒有ATP的情況下，純化的DnaK形成無序的低聚物，當DnaK與ATP結合時DnaK更傾向于形成二聚體結構［8］.但是，其具體反應機理和生化意義并不清楚，因此有必要對DnaK進行純化，研究ATP與腺苷二磷酸（ADP）對DnaK蛋白質二聚體的影響，進而為醫學研究以及在食品科學領域中的應用提供基本理論依據.

1 材料與方法

1.1 菌株、質粒

受體菌為dnak基因缺失的大腸桿菌（E.coli）菌株BB205（卡那霉素和氯霉素抗性），表達載體質粒為pBB46（氨芐抗性），均由美國弗吉尼亞聯邦大學醫學院惠贈.

1.2 試劑和儀器

DNA提取試劑盒，Qiagen公司；定點突變試劑盒，Agilent Technologies公司；蛋白質marker，Biolabs公司；40%，丙烯酰胺、β-巰基乙醇、苯甲基磺酸鈉、十二烷基磺酸鈉等試劑，Sigma公司.

主要儀器包括AKTA prime蛋白質純化系統、Ni親和層析柱和陰離子交換柱（HisTrap）、12500，SERIES型搖床、1938型超聲儀、Mini-PROTEAN Ⅲ型電泳槽、RS232型分光熒光計等.

1.3 突變體質粒的獲得

根據DnaK-ATP的空間結構，本實驗構建了兩個突變體，即將第303位、541位氨基酸突變為半胱氨酸（A303C和H541C）.突變后經純化的DNA經測序，序列分析正確后進行下一步實驗.A303C，正向引物為5′-AAAGTGACTCGTTCAAACTGGAAAGC-3′，反向引物為5′-GCTTTCCAGTTTGAACGAGTCA CTTT-3′；H541C，正向引物為5′-CTGGTACAGACT ACCTGCTGCACAGC-3′，反向引物為5′-GCTGTGC AGCAGGTAGTCTGTACCAG-3′.PCR反應體系為50，μL體系，PCR buffer 5，μL，PCR solution 1.5，μL，脫氧核糖核苷三磷酸（dNTP）1，μL，模板2，μL，5′引物2，μL，3′引物2，μL，DNA聚合酶1，μL.反應程序為94，℃模板預變性3，min，94，℃變性15，s，55，℃退火30，s，68，℃延伸4，min，68，℃充分延伸10，min，用4，℃進行保存.

1.4 重組DnaK蛋白質的誘導表達

本實驗所需的蛋白均是將dnak表達載體pBB46導入到dnak缺失菌株BB205中進行表達而得到的.挑取轉化后的單菌落于100，mL含有卡那-氯霉素-氨芐的LB培養基中，30，℃過夜進行預培養，經預培養后的菌體1﹕100接種于1，L培養基中進行擴大培養，待菌體密度A600達到0.6時加入1，mmol/L IPTG進行誘導表達，4，h后誘導完成，離心收集菌體并用2倍磷酸鹽緩沖液（PBS）沖洗菌體［9］.

菌體充分重懸后加入100，μL 30，mg/mL的裂解酶充分裂解菌體，冰上孵育30，min后，置于冰水浴中進行超聲裂解.超聲結束后，將裂解后的菌體于4，℃、20，000g離心1，h，上清液經0.22，μm濾膜過濾后作為蛋白質上樣液.

1.5 DnaK蛋白質的純化

1.5.1 Ni親和層析純化

采用Ni親和柱進行親和層析，上樣流量為1，mL/min.上樣結束后用裂解液PBS平衡洗脫柱子時，流量為5，mL/min，洗脫體積為300，mL，之后用含200，μmol的ATP、10，mmol醋酸鎂的裂解液以同樣流量清洗100，mL［10］.然后采用含4%，、8%，的洗脫液（2× PBS+300，mmol/L NaCl+400，mmol/L pH 為7.5的咪唑）對柱子進行梯度洗脫，保持同樣流量，各洗200，mL.最后進行梯度洗脫，洗脫流量為2，mL/min，總體積為120，mL，洗脫液的含量從8%，上升至60%，并收集樣品，每管3，mL.洗脫結束后，選取有紫外吸收值的樣品，取樣，利用聚丙烯酰胺凝膠電泳（SDSPAGE）進行檢測［11］.

收集蛋白濃度較高且雜蛋白較少的樣品，置于相對分子質量為1.0×104的透析袋中，在2倍PBS中過夜透析，同時加入1，mmol/L二硫蘇糖醇（DTT）還原被氧化的蛋白.

1.5.2 陰離子交換柱進一步純化

采用陽離子交換柱進一步純化，選擇5，mL/min的上樣流量.上樣結束后用溶液A（25，mmol/L pH 7.5的4-羥乙基哌嗪乙磺酸（Hepes）+50，mmol/L NaCl+ 1，mmol/L DTT）沖洗柱子，流量為5，mL/min，體積為100，mL，之后用5%，溶液B（25，mmol/L pH 7.5，Hepes +1，mol/L NaCl+1，mmol/L DTT）繼續沖洗，流量為5，mL/min，體積為100，mL［12］.然后進行蛋白梯度洗脫，洗脫流量為2，mL/min，總體積為120，mL，洗脫液（25，mmol/L pH 7.5，Hepes+1，mol/L NaCl+1，mmol/L DTT）的含量從5%，上升至60%，并收集樣品，每管3，mL［13］.洗脫后選取有紫外吸收值的樣品進行SDSPAGE檢測其純度，然后收集樣品，濃縮，并用洗脫液稀釋，蛋白最終質量濃度應高于10，mg/mL.分裝后用液氮速凍并保存于-80，℃冰箱中.

1.6 蛋白質交聯實驗

利用溶液A（25，mmol/L pH 7.5，Hepes+ 150，mmol/L KCl+10，mmol/L Mg（OAc）2，10%，丙三醇+5，mmol/L DTT）將蛋白稀釋至5，mg/mL，并在冰上孵育2，h，以徹底除去產生的半胱氨酸殘基［14］.然后將樣品加到事先用溶液B（25，mmol/L pH 7.5，Hepes +150，mmol/L KCl+10，mmol/L Mg（OAc）2，10%，丙三醇）平衡好的除鹽柱子中，離心使蛋白通過柱子而除去DTT［15］.用超微量分光光度計測定蛋白質量濃度，并用溶液B將蛋白稀釋至0.5，mg/mL，然后加入100，μmol/L 的硫酸銅和200，μmol/L的鄰菲羅啉開始氧化蛋白，氧化過程需在冰上進行，1，h后加入終濃度為5，mmol/L 的二乙烯三胺（DETA）終止反應.通過聚丙烯酰胺凝膠檢測蛋白質交聯結果［16］.

2 結果與討論

2.1 定點突變DNA測序結果

為了研究DnaK蛋白質的結構，根據已經報道的DnaK的兩個結構域功能，設計DnaK-A303C、DnaKH541C兩個蛋白質突變體，并構建帶有突變位點的表達載體.將經快速定點突變實驗（Quickchange）之后所得到的質粒進行測序，圖1為DnaK-A303C與DnaK野生型堿基序列比對圖，上一排顯示DnaKA303C堿基序列，下一排顯示DnaK堿基序列，其中第303位氨基酸對應由907～909位堿基編碼，密碼子GCG突變成為UGU，對照氨基酸序列表，即由丙氨酸突變為半胱氨酸（DnaK-A303C）.測序結果進行比對分析，所有結果全部正確，進行下一步實驗.共得到DnaK-A303C、DnaK-H541C兩個突變質粒.

2.2 蛋白質的誘導表達

經IPTG誘導后的菌體，需要經SDS-PAGE檢測表達并進行下一步純化，結果如圖2所示，即DnaKA303C誘導表達前，蛋白質分布均勻（泳道1、2）.經IPTG誘導后，在大于6.6×104的位置有明顯的誘導條帶，此蛋白質誘導表達量占蛋白質總量的50%，以上（泳道3、4）.通過計算遷移率可知此蛋白質相對分子質量約為7.0×104，即為所需要的目標蛋白質DnaK-A303C.

圖1 DnaK-A303C與DnaK野生型測序堿基比對結果Fig. 1 Sequence comparison of DnaK-A303C and the wild DnaK

圖2 DnaK-A303C蛋白質表達電泳圖Fig. 2 SDS-PAGE expression of DnaK-A303C

2.3 純化結果

2.3.1 Ni親和層析純化

Ni離子柱親和層析是一種高效的蛋白質純化方法.本實驗采用DnaK表達載體pBB46，重組表達的DnaK-A303C蛋白質產物帶有6個組氨酸標簽，可以采用Ni親和層析進行高效純化.首先研究DnaKA303C蛋白質在上清液和沉淀中的含量，比較圖3中第1、2、3泳道樣品，大部分目標蛋白質存在于上清液中，僅有少量目標蛋白質在沉淀中，說明重組表達的DnaK-A303C蛋白質溶解性極好.

重組蛋白質上柱后，分析上樣流出液的組成，發現少量目標蛋白質進入流出液，說明目標蛋白質與Ni親和柱結合的較好（圖3，泳道4）.第5泳道為裂解液沖洗柱子的流出液樣品，由SDS-PAGE顯示，有雜蛋白質脫離柱子.洗脫液以每管3，mL的體積進行收集.凝膠第5泳道直至16泳道，所有樣品均為洗脫所得到的樣品.

圖3 Ni親和層析純化蛋白質電泳圖Fig. 3 SDS-PAGE analysis of Ni-clumn purification

2.3.2 離子交換純化

由于DnaK-A303C蛋白質的等電點為4.83，根據陰、陽離子交換柱的不同性質，繼續使用陰離子交換柱對2×PBS透析后的蛋白質進行進一步純化.首先分析了樣品與陰離子交換柱的結合，其中第1泳道是上樣前的樣品，第2泳道為流出液，對比第1、2泳道，可以發現僅有少量蛋白質沒有很好地與柱子結合，隨流出液流出（圖4）.從第3泳道至最后10泳道全部為梯度洗脫陰離子交換柱所得到的樣品.由電泳圖可見，陰離子交換柱對蛋白質的進一步純化具有較好的效果，特別是在2.7×104附近有一條雜蛋白質在較高的鹽濃度時被洗脫下來，與大部分目標蛋白質分離開來.

圖4 陰離子交換柱純化蛋白質電泳圖Fig. 4 SDS-PAGE analysis of Q-clumn purification

2.3.3 DnaK突變體的純化

將DnaK的兩個突變體（DnaK-A303C、DnaKH541C）依照兩步層析的方法分別進行純化，并將所純化的蛋白質同時稀釋至1，mg/mL，用7.5%，的SDSPAGE檢測其純度.純化結果如圖5所示，DnaK的兩個突變體在SDS-PAGE條件下呈現單獨的電泳帶，純度達85%，以上.

圖5 DnaK突變蛋白質純化結果Fig. 5 Purified DnaK mutant proteins

2.4 蛋白質交聯結果

為了研究ATP和ADP對DnaK二聚體的影響，將兩種蛋白質等量混合后，采用銅-鄰菲羅啉氧化DnaK蛋白之間的二硫鍵，通過特殊二硫鍵的形成來研究二聚體的狀態.兩個DnaK突變體在沒有ATP或ADP存在下，以相對分子質量約為7.0×104的蛋白質單體形式存在（圖6，泳道1—3）.在ADP條件下，DnaK-A303C形成相對分子質量約為2.2×105同二聚體，DnaK-H541C形成相對分子質量約為1.6× 105同二聚體（圖6，泳道4、5）.當兩種突變體混合氧化后，同二聚體沒有變化，分別形成2.2×105和1.6×105兩條電泳帶（圖6，泳道6）.DnaK-A303C和DnaK-H541C之間二硫鍵氧化后形成的異二聚體結構.

圖6 Dnak蛋白質交聯結果Fig. 6 Crosslinked Dnak protein

3 結 語

DnaK是原核生物中的熱休克蛋白質，具有分子伴侶功能，需要從ATP水解過程獲取能量，以結合多肽底物并執行正常功能.本文通過構建兩個DnaK的突變體，研究在ATP或ADP條件下，對DnaK二聚體性質的影響.研究表明兩個DnaK突變體在ADP的存在下以同二聚體的形式存在，但是在ATP條件下能夠形成異二聚體，ATP能夠影響DnaK蛋白質的結構.已有研究報道了ATP結合熱休克蛋白后，誘導其發生變構效應實現對底物的結合［8］.本文通過兩個DnaK突變體在ATP條件下生成異二聚體，從生物化學的角度驗證了該理論，對于揭示蛋白正確折疊和維持蛋白內穩態具有重要意義.DnaK突變體蛋白質經IPTG高效誘導表達后，Ni親和層析柱純化與陰離子交換柱純化后可得到純度達85%，以上的蛋白質，符合生物化學實驗的要求.

DnaK突變體純化是整個實驗中最為基礎，也最為關鍵的一步，因此需要在最大程度上提高蛋白的純度，并且保持蛋白活性.具體應注意：蛋白質對理化因素的影響特別敏感，特別是pH、溫度等.因此應根據蛋白質自身的等電點，結合所用層析柱的特性，選擇合適pH的緩沖液.同時，為了最大程度降低蛋白的變性和降解，整個純化過程都在4，℃層析柜中進行.

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責任編輯：郎婧

Purification of DnaK Mutants and the Characteristics of DnaK Dimer

LIU Qingdai1，2，SU Jiayue1，TIAN Xueli1，YANG Ying1，ZHAO Fei1，2，SHENG Changzhong1，3
（1.College of Food Engineering and Biotechnology，Tianjin University of Science & Technology，Tianjin 300457，China；2.Tianjin Tianlong Seeds Science and Technology Co.，Ltd，Tianjin 300457，China；3.Dynamiker Biotechnology（Tianjin）Co.，Ltd，Tianjin 300457，China）

Two DnaK mutants were constructed by site-directed mutagenesis to study the effect of ATP or ADP on heat shocked protein.DnaK-A303C and DnaK-H541C were expression through induction.Then the recombined proteinswere purified by using sulfate nickel affinity chromatography and anion exchange chromatography.The same amount of proteins was oxidized and the protein cross-linking was detected by SDS-PAGE.The results show that DnaK mutants formed dimmer in the presence of ADP.However，the heterodimer was found under the condition of ATP.This study provides an experimental basis for understanding the synergism between the two subunits of heat shocked protein.

DnaK；ATP；dimer；mutant

TS201

A

1672-6510（2016）03-0011-05

10.13364/j.issn.1672-6510.20150071

2015-06-07；

2015-09-06

國家自然科學基金資助項目（31571029）；天津市應用基礎與前沿技術研究計劃資助項目（15JCYBJC30300，15JCQNJC46300，15JCTPJC55400）

劉清岱（1975—），男（滿），河北保定人，副研究員，lqd@tust.edu.cn.

數字出版日期：2015-12-10；數字出版網址：http://www.cnki.net/kcms/detail/12.1355.N.20151210.1045.002.html.