基于HPLC-MS檢測食品中新霉素和潮霉素B的殘留量

□戴 輝 孟 晶 祖立青 樂麗歡

（上海科茂糧油食品質量檢測有限公司 上海 普陀區 200333）

基于HPLC-MS檢測食品中新霉素和潮霉素B的殘留量

□戴 輝 孟 晶 祖立青 樂麗歡

（上海科茂糧油食品質量檢測有限公司 上海 普陀區 200333）

目的建立測定食品中新霉素和潮霉素B氨基糖苷類藥物殘留量的液相色譜-串聯質譜法(HPLC-MS/MS)。方法樣品中的氨基糖苷類藥物經磷酸鹽緩沖液提取后，經過弱陽離子固相萃取柱富集凈化后，采用液相色譜-三重四極桿串聯質譜檢測，使用電噴霧離子化源(ESI)，在正離子條件下以多反應監測(MRM)方式進行掃描。結果線性范圍為10～1 000μg·kg-1，新霉素和潮霉素B的最低定量濃度(LOQ)為100μg/kg，最低檢測濃度(LOD)為30μg/kg。；以加標樣品計算，在各濃度水平下，各被測物的方法回收率為60%～120%。結論本方法準確、高效，適用于食品中氨基糖苷類藥物殘留量的檢測。

氨基糖苷；液相色譜-串聯質譜；殘留檢測

氨基糖苷類化合物(aminoglycosides)作為廣譜抗生素的一種，其抗菌活性是針對諸多革蘭氏陰性菌和革蘭氏陽性菌。氨基糖苷酸抗生素在獸醫界和畜牧業中,被廣泛用于治療細菌性感染。但任何事物都具有兩面性，氨基糖苷類抗生素具有不可逆的耳毒性和腎毒性等不良反應，為了保證廣大消費者安全健康的飲食,美國食品及藥物管理局 (Food and Drug Administration)和歐盟委員會針對肉類,奶類及奶制品、蛋類等動物源性食品進行了幾種氨基糖類化合物最大殘留限量（Maximum residuelimit）的設定。

氨基糖苷類是由兩個或多個氨基糖通過苷鍵與氨基環醇鍵合而成的一類化合物，其結構由于缺少發色團和熒光團，需要在柱前或柱后衍生化反應結束后，采用液相色譜-熒光或紫外檢測。因為氨基糖苷類具有較強的極性，不易揮發，在進行衍生化反應后，也會需要繼續使用氣相色譜法測定。這些衍生化的方法不僅操作比較繁瑣，而且穩定性較差。本次試驗采用內標法，對動物源性食品中的新霉素和潮霉素B，這2種氨基糖苷類藥物殘留量進行檢測，經過較為嚴格的方法學驗證，對于測定動物源食品中氨基糖苷類藥物的殘留量內定法具有準確且高效的特點。

1 材料與方法

1.1 儀器與藥品

LC-MS 8050型三重四極桿串聯質譜儀 (日本島津公司)，配有電噴霧離子化源(ESI源)；LC-30A超高效液相色譜儀(日本島津公司)；MS 3 basic旋渦混合器 (德國 IKA)；D-37520臺式冷凍離心機 (美國Thermo公司)。Oasis混合型弱陽離子(WCX)固相萃取柱(3cm3，60mg，30μm，美國 Waters公司)。

新霉素和潮霉素B對照品購買于美國 Sigma公司；乙腈、甲醇、醋酸、醋酸銨、甲酸均為色譜純；磷酸氫二鈉為分析純；試驗用水為超純水。

1.2 方法

1.2.1 試樣制備。肌肉組織及器臟組織、水產品類取適量新鮮或冷藏的樣品，絞碎，并均質。置-18℃以下冰箱中冷凍保存。另準備空白樣品，絞碎后置于-18℃以下冰箱中冷凍保存，作為空白樣品備用。

1.2.2 提取和凈化。前處理1：取5.00g樣品，加入7.5%EDTA緩沖鹽溶液0.5ml（視情況而定，可不加），加入5%三氯乙酸溶液10ml，渦旋1min，超聲20min，4000r/min離心5min，取上清液于一離心管，殘渣中加入10ml5%三氯乙酸溶液重復提取一次，合并上清液。取10ml上清液，用氨水準確調ph=7，（用高速離心機離心后）準備上WCX小柱。WCX小柱依次用2ml甲醇、2ml水活化。上樣，待樣液自然流完，依次用2ml水，2ml甲醇淋洗，棄去淋洗液，用2ml5%甲酸甲醇洗脫。洗脫液過有機濾膜后直接上儀器待測。

前處理2：取5.00g樣品，加入7.5%EDTA緩沖鹽溶液0.5ml（視情況而定，可不加），加入5%三氯乙酸溶液10ml，渦旋1min，超聲20min，4000r/min離心5min，取上清液于一離心管，殘渣中加入10ml5%三氯乙酸溶液重復提取一次，合并上清液，取10ml提取液(PH≤1)，準備上HLB小柱。HLB小柱依次用2ml甲醇、2ml水活化。上樣，待樣液自然流完，用5ml水淋洗，2ml甲醇洗脫。洗脫液過濾膜上儀器待測。

前處理3：取5.00g樣品，加入7.5%EDTA緩沖鹽溶液0.5ml（視情況而定，可不加），加入5%三氯乙酸溶液10ml，渦旋1min，超聲20min，4000r/min離心5min，取上清液于一離心管，殘渣中加入10ml5%三氯乙酸溶液重復提取一次，合并上清液，取10ml提取液，準備上MCX小柱。MCX小柱依次用5ml甲醇、5ml水活化。上樣，待樣液自然流完，依次用5ml水，5ml乙腈，5ml乙腈甲酸銨水溶液（乙腈：2M甲酸銨水溶液=3:7）淋洗，再用5ml乙腈甲酸銨水溶液（乙腈：2M甲酸銨水溶液=3:7）（PH=8.0）洗脫，洗脫液過濾膜上儀器待測。

前處理1可測：壯觀霉素、二氫鏈霉素、潮霉素B、鏈霉素、丁胺卡那霉素、卡那霉素

前處理2可測：安普霉素、妥布霉素、慶大霉素

前處理3可測：新霉素

1.2.3 標準曲線的制備。精密量取10μg/mL10種氨基糖苷類藥物混合標準工作液適量，用樣品空白基質配制成氨基糖苷類藥物 濃度為 20、50、100、200、500ng/mL系列標準溶液，供液相色譜-串聯質譜測定。以特征離子質量色譜峰面積為縱坐標，標準溶液濃度為橫坐標，繪制標準曲線。求回歸方程和相關系數。

1.2.4 測定。

（1）色譜條件

a.除新霉素外九種氨基糖苷類

色譜柱：CORTECS Hilic 2.1*100mm 1.6μm；

流動相：A：250mM甲酸銨水（200mL中加800uL甲酸）B：200mM甲酸銨有機相（乙腈+甲醇+水=6+1+3）溶液，（200ml中加甲酸 400uL）；

流速：0.25mL/min；

柱溫：30℃；

進樣量：5μl；

表1 9種氨基糖苷類流動相梯度

b.新霉素的色譜條件

色譜柱：ZIC HILLIC 2.1*75mm 3μm；

流動相：A：250mM甲酸銨水（200mL中加800uL甲酸）B：200mM甲酸銨有機相（乙腈+甲醇+水=6+1+3）溶液，（200ml中加甲酸 400uL）；

流速：0.25mL/min；

柱溫：30℃；

進樣量：5μl；

表2 新霉素流動相梯度

（2）質譜條件

a）離子源：電噴霧離子源；

b）掃描方式：正離子掃描；

c）檢測方式：多反應監測；

d）毛細管電壓：Auto Tune(4.0KV)

e）Nebulizing Gas Flow:3L/min；

f）Heating Gas Flow:10L/min；

g）Interface Temperature:300℃；

h）DL Temperature:240℃；

i)Heat Block Temperature:400℃；

j)Drying Gas Flow:10L/min；

k）定量，定性離子對及碰撞能量見表2

表3 2種氨基糖苷類定量，定性離子對及碰撞能量

1.2.5 空白試驗。除不加試料外，采用完全相同的步驟進行平行操作。

1.3 計算方法

1.3.1 定性判斷。在相同實驗條件下，樣品中目標化合物與氨基糖苷類標準物質的保留時間一致，且監測離子對的相對豐度滿足表3要求。可認為目標峰是氨基糖苷類物質。

表4 目標物離子對相對豐度比允許偏差范圍

1.3.2 定量方法。將樣品制備液與標準溶液等體積進樣，建立標準工作曲線進行定量校準，標準溶液和樣液中待分析物的響應均應在儀器測定的線性范圍內。

計算公式：

X-樣品中藥物含量（μg/kg）；

C-儀器測定樣液中藥物含量（ng/mL）；

V-定容體積（mL）；

m-稱取樣品質量（g）；

計算結果需扣除空白值，測定結果用平行測定的算術平均值表示。

3 結果

3.1 檢出限

最低定量濃度 (LOQ)與最低檢測濃度(LOD)以信噪比 10∶1和 3∶1分別計算各被測物的LOQ和 LOD。新霉素和潮霉素B的最低定量濃度(LOQ)為 100μg/kg，最低檢測濃度(LOD)為30μg/kg。

3.2 準確度

本方法在添加濃度水平為30～200μg/kg時新霉素和潮霉素B的回收率范圍為60%～120%。

3.3 精密度

本方法的批內變異系數≤20%。

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1004-7026（2016）18-0097-03

S859.84

A

DOI：10.16675/j.cnki.cn14-1065/f.2016.18.075

戴輝（1985-），男，湖北黃岡人，本科，主要研究方向為食品檢測分析。