γ-GCS及TGF-β1在MRL/1pr雌性小鼠腎組織表達研究

張北平　劉樹鋒　王　海　譚　校（汕頭大學醫學院附屬粵北人民醫院風濕免疫科　韶關　512026）

γ-GCS及TGF-β1在MRL/1pr雌性小鼠腎組織表達研究

張北平劉樹鋒王海譚校（汕頭大學醫學院附屬粵北人民醫院風濕免疫科韶關512026）

摘要：目的：對狼瘡小鼠腎組織γ-谷氨酰半胱氨酸合成酶（γ-GCS）表達水平進行研究，發現γ-GCS的表達量改變在轉化生長因子β1（TGF-β1）促纖維化中的作用。方法：以C57BL/6小鼠為對照，熒光定量PCR法檢測MRL/1pr雌性小鼠腎組織γ-GCS和TGF-β1的mRNA表達。結果：狼瘡小鼠組腎組織中γ-GCS的mRNA及蛋白表達減少，TGF-β1的mRNA表達水平升高，與C57BL/6小鼠組比較有顯著差異（P＜0.05）。結論：γ-GCS表達降低導致谷胱甘肽（GSH）合成減少，抗氧化能力減弱，促使腎間質纖維化。

關鍵詞：狼瘡性腎炎 轉化生長因子 γ-谷氨酰半胱氨酸合成酶

系統性紅斑狼瘡（systemic lupus erythematosus，SLE）是一種累及多系統的疾病，狼瘡性腎炎（lupus nephritis，LN）是最常見器官損害，免疫損傷聯合炎癥反應，導致腎組織中活性氧簇含量增加［1］，同時抗氧化劑GSH含量減少，氧化-抗氧化失衡造成組織損害，最終發展到腎間質纖維化的不可逆性損害。轉化生長因子（TGF-β1）與LN腎間質纖維化過程中最重要的促纖維化因子，表達影響著腎組織的纖維化進展。谷胱甘肽（GSH）是機體最重要的抗氧化損害物質，在LN中起到重要作用，γ-谷氨酰半胱氨酸合成酶（γ-GCS）為合成GSH的關鍵限速酶，γ-GCS的活性和表達水平直接影響GSH的水平，是維持細胞內GSH穩態的主要決定因素。本研究在MRL/1pr雌性小鼠模型中，從轉錄水平研究TGF-β1和γ-GCS在狼瘡鼠腎組織的表達，探討GSH合成限速酶γ-GCS在MRL/1pr的表達在LN腎氧化應激及間質纖維化中的作用。

1資料與方法

1.1研究資料：正常組小鼠：SPF級C57BL/6小鼠；自發性狼瘡性腎炎模型組：MRL/1pr雌性小鼠，各10只，均為雌性。

1.2實驗方法：試劑Trizol Reagent（Invitrogen公司），PrimeScriptTMRT-PCR試劑盒（寶生物工程有限公司），PCR引物合成（上海英駿生物技術有限公司）。兩組小鼠培養至16周時斷頸處死，無菌環境下取出腎臟，用Trizol Reagent分別提取兩組小鼠腎組織總RNA（按照試劑盒方法操作）。用熒光定量PCR方法檢測總RNA中TGF-β1、γ-GCS的mRNA水平，反應按照試劑盒說明采用2步法完成。設計引物：內參GAPDH（150bp）F：TGTGTCCGTCGTGGATCTGA，R：TTGCTGTTGAAGTCGCAGGAG；TGFβ1 （92bp）F：TTTCCGCTGCTACTGCAAGTC，R：AGGGCTGTCTGGAGTCCTCA；γ-GCS（132bp）F：TGCACATCTACCACGCAGTCAA，R：GAACATCGCCTCCATTCAGTAACA，實驗條件 95℃5min→94℃10s→59℃，33個循環。以稀釋的cDNA濃度梯度制作標準曲線。

2實驗結果（表1）

TGF-β1半定量PCR結果：狼瘡組TGF-β1mRNA的表達高于正常組（P＜0.05）。狼瘡組γ-GCS的mRNA表達較正常組減少（P＜0.05）。

3討論

表1

腎間質纖維化是LN發展到終末期的表現，是SLE最常見死亡原因。多項研究認為，LN腎組織內大量氧自由基通過多種途徑造成腎組織損害，這種損害和患者機體GSH降低有關［2］。研究認為LN腎組織TGF-β1過度表達導致了腎間質纖維化。研究表明小鼠胚胎成纖維細胞GSH可以阻斷TGF-β1引起的纖溶酶原激活物抑制物-1mRNA的表達，促進細胞外基質降解；狼瘡患者體內GSH水平下降，是機體內氧化-抗氧化失衡的主要原因，其降低水平和疾病活動有相關性［4］，這個結論與本項研究中GSH合成限速酶γ-GCS表達降低（P＜0.05）的結果是一致的。γ-GCS的mRNA表達降低，必然導致GSH水平降低。因此認為，SLE患者體內GSH降低是消耗增加和產生減少共同導致的。目前考慮炎癥損傷及免疫學損害使腎組織GSH消耗并γ-GCS表達減少，氧化損害加劇導致纖維化因子TGF-β1過度表達，腎間質纖維化。

綜上，GSH在狼瘡性腎炎發展到纖維化過程中有重要作用［5］，本研究認為γ-GCS在MRL/1pr小鼠腎組織表達減少可能是導致腎組織GSH降低的根本原因，也是LN腎組織氧化應激加重的重要原因，外源性補充GSH或增強表達γ-GCS可從根本上提高腎組織GSH水平，可能減緩腎間質纖維化進程。

參考文獻

［1］Kurien BT，Scofield RH.Free radical mediated peroxidative damage in systemic lupus erythematosus［J］.Life Sci，2003，73 （13）：1655-1666.

［2］廖永強，夏洪嬌，彭可君，等.氧化還原態改變和淋巴細胞凋亡與系統性紅斑狼瘡疾病活動度的相關性研究［J］.中國免疫學雜志，2013，29（12）：1288-1292.

［3］許鳴華，李振彬，孫彩霞，等.雷公藤多苷對狼瘡小鼠腎組織高遷移率族蛋白-1及轉化生長因子-β1表達的影響［J］.中華臨床免疫和變態反應雜志，2015，9（3）：187-193.

［4］逯惠敏，胡曉蕾，蔣紅梅，等.系統性紅斑狼瘡患者的氧化應激狀態分析［J］.山東醫藥，2010，50（9）：60-61.

［5］齊亞軍，劉健，曹云祥，等.風濕病的氧化應激及干預研究進展［J］.中華中醫藥學刊，2013，31（12）：2606-2609.

中圖分類號：R593.24+2

文獻標識碼：B

文章編號：1672-8351（2016）07-0133-01