分離培養適用于染色體分選的新生小鼠皮膚成纖維細胞

晁天柱， 徐福意， 徐　偉， 李　凱， 周宇荀， 肖君華

(東華大學 生物科學與技術研究所，上海 201620)

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分離培養適用于染色體分選的新生小鼠皮膚成纖維細胞

晁天柱， 徐福意， 徐偉， 李凱， 周宇荀， 肖君華

(東華大學 生物科學與技術研究所，上海 201620)

摘要：采用酶消化法分離培養新生小鼠皮膚成纖維細胞(mouse skin fibroblasts, MSFs)．通過噻唑藍(MTT)比色法和流式細胞術(flow cytometry, FCM)，深入探討不同培養基和血清濃度對MSFs增殖率和同步化效率的影響．結果表明：酶消化法能快速獲取大量健康、高活力的MSFs；在杜氏培養液(DMEM)傳代培養條件下，P2代MSFs具有高增殖率和有絲分裂指數；地美可辛工作濃度為0.05 μg/mL時，阻斷同步化獲取M期MSFs的效率最佳．研究結果為流式細胞術分選染色體提供實驗材料和研究基礎．

關鍵詞：成纖維細胞； 噻唑藍(MTT)； 細胞同步化； 流式細胞術

純化的染色體可應用于物理作圖[1-2]、熒光原位雜交(fluorescence in situ hybridization, FISH)[3-4]、構建DNA文庫[5-6]、有絲分裂相關蛋白質[7-8]的研究和二代測序．染色體純化和測序技術相結合能快速、高效地獲取目標染色體的DNA序列信息[9]，并廣泛應用于動植物個體，如小麥[10]、山羊草[11]、人[12]、小鼠[13]和倉鼠[14]等．在染色體純化方法中，顯微切割技術雖能獲得高純度染色體，但耗時、耗力，得率低[15]；磁珠分選法的純度低，且染色體不完整[16]；而流式細胞術(FCM)是染色體純化效率最高的方法[17]．

雖然各種細胞類型都能用于流式細胞術分選染色體[18]，但細胞的質量、穩定性和有絲分裂指數，嚴重影響單染色體懸液的質量和流式分辨率[19]．成纖維細胞在適當體外培養條件下可迅速增長繁殖，而具有較高有絲分裂指數的胎鼠成纖維細胞(mouse embryonic fibroblasts, MEFs)是最佳選擇[20].但原代培養MEFs需處死母鼠和子鼠，因此針對珍貴的數量性狀基因座(quantitative trait locus, QTL)定位新策略“野生小家鼠來源一號染色體替換系”群體(population chromosome substitution strains, PCSSs)[21]，選取快捷、方便的新生小鼠皮膚是更合適的選擇．

通過優化細胞培養條件提高細胞有絲分裂指數，結合秋水仙酰胺[20]或地美可辛[22]提高有絲分裂中期(mitosis metaphase, M-phase)細胞的比例，能有效降低影響流式分辨率的細胞碎片數量[18,23]．本文以PCSSs群體新生小鼠皮膚為樣本，利用酶消化法分離培養新生小鼠皮膚成纖維細胞(mouse skin fibroblasts, MSFs)，并進一步通過噻唑藍(MTT)比色法和流式細胞周期檢測技術獲得MSFs最佳培養條件．

1材料和方法

1.1實驗動物

遵守1988年《實驗動物管理條例》,在東華大學生物科學與技術研究所屏障動物實驗室設施進行實驗，獲取清潔級PCSSs群體新生小鼠，并在冰冷的碘酊和75%酒精中，分別處理2～3min，備用．

1.2新生小鼠皮膚成纖維細胞培養

取新生小鼠皮膚，磷酸鹽緩沖液(PBS，Hyclone)漂洗后用手術刀將其切成盡量小塊，膠原酶(1mg/mL, Sigma)37℃消化處理30min；1 500 r/min離心5min，棄上清；PBS重懸清洗，胰酶(0.5mg/mL，含乙二胺四乙酸(EDTA)，上海吉泰生物科技有限公司)37℃消化處理20min；離心棄上清；加入含特級胎牛血清(FBS，體積分數為15%，Gibico)和雙抗(250 μg /mL青霉素和400 μg/mL鏈霉素，南京凱基生物科技發展有限公司)的杜氏培養液和F12培養液混合培養基(DMEM/F12，體積比為1∶1，Gibco)培養基，重懸吹散沉淀并接種于T75培養瓶(Corning)中，置入37℃，5% CO2培養箱．用胰酶(2.5 mg/mL)消化傳代融合在85%的MSFs，傳代培養條件分別為含雙抗(50 μg /mL青霉素和80 μg/mL鏈霉素)的DMEM-15%FBS，DMEM-10%FBS，DMEM/F12-15%FBS和DMEM/F12-10%FBS．取P1～P5代MSFs開展實驗．

1.3MTT法評估細胞增殖狀況

MSFs以1×104細胞/孔于96孔培養板上接種細胞，培養48h后，加入質量濃度為0.5mg/mL的MTT溶液，37℃，4h后棄上清并加入100μL二甲基亞砜(DMSO，Sigma)，15min后采用Multiskan MK3(Thermo)型酶標儀測定490nm處的吸光度值．

1.4MSFs阻斷同步化

取P2代MSFs以1×105細胞/孔于6孔培養板接種細胞，在細胞密度約為70%時，分別加入質量濃度為0.20，0.10，0.05 μg/mL的地美可辛．放入培養箱，分別在0,12,14,16,18,20,22 h，用胰酶消化法收集細胞，PBS清洗2次，緩慢加入1mL體積分數為75%的乙醇重懸細胞，-20℃保存備用．

1.5細胞周期分析

取酒精固定MSFs，PBS清洗2次，加入500μL 含核糖核酸酶(100 μg/mL，Sigma)、乙二胺四乙酸(0.003 7 mg/mL，Sigma)和碘化丙啶(50 μg/mL，上海生工生物工程技術有限公司)的混合溶液，避光4℃染色1h．通過BD Accuri C6檢測MSFs細胞周期，用BD Csampler software軟件分析MSFs細胞周期各時期細胞的百分比．

2結果與分析

2.1新生小鼠成纖維細胞分離培養

利用酶消化法獲取大量、高活力新生小鼠成纖維細胞如圖1所示．由圖1(a)可知，初始培養12h后原代培養的MSFs散布貼壁，細胞呈紡錘形或不規則三角形，有少量上皮細胞，細胞核清晰，無集落．培養2d，細胞生長成單層細胞，呈典型梭形，旋渦狀排列或縱橫交錯(圖1(b))．3d左右單層細胞鋪滿瓶底，可消化傳代進行傳代培養(圖1(c))．傳代培養48h細胞可鋪滿皿底(圖1(d))．

2.2MSFs增殖率檢測

采用MTT比色法檢測各世代MSFs增殖率，測試結果如圖2所示．由圖2可知，在DMEM培養條件下，P1～P2代MSFs的吸光度最高(吸光度與細胞數量成正比)，說明此時MSFs增殖率最高，P3代開始快速下降；DMEM/F12培養條件下，MSFs增殖率逐代下降，且在P3～P4代開始凋亡．P1～P2代MSFs的增殖率，在DMEM和DMEM/F12兩種培養基之間具有極顯著差異(P<0.000 1)，而10%FBS和15% FBS對MSF增殖率無顯著影響(P>0.1)，說明影響P1～P2代MSF增殖率的主要因素為培養基．

(a) MSFs初始培養12 h(×50)

(b) MSFs初始培養2 d(×100)

(d) MSFs傳代培養48 h(×100)

圖2　MSFs的增殖率Fig.2　The proliferation rate of MSFs

高濃度雙抗既抑制細菌滋生也抑制細胞增殖，MSFs初始培養的雙抗濃度高于傳代培養，因此P1→P2代MSFs的增殖率逐漸上升．MSFs對氧化壓力敏感，在20% O2的培養條件下易發生氧化損傷和傳代危機[24-25]，氧化壓力是導致P3代MSFs活力急速下降的可能原因．雖然DMEM/F12能促進MSFs貼壁和增殖，但會降低MSFs傳代次數，是P1～P2代MSFs低增殖率和有絲分裂指數以及P3代MSFs開始凋亡的原因．

2.3流式細胞術檢測MSFs細胞周期

采用流式細胞術檢測細胞周期，根據單細胞中DNA含量的差異將細胞周期分為 G0/G1期(2倍體)、S期(2～4倍體)和G2/M期(4倍體).表1列舉了4種培養條件下，地美可辛(0.05， 0.10，0.20 μg/mL)阻斷同步化MSFs停滯在M期，導致G2/M期4倍體MSFs的百分數變化情況．由表1可知，0.05 μg/mL地美可辛阻斷同步化MSFs的效率最佳：在DMEM-15%FBS培養條件下，阻斷同步化MSFs 18h，G2/M期細胞百分數達到最大(56.4%±0.19%)；DMEM-10%FBS為18h(58.6%±0.53%)；DMEM/F12-15%FBS為16h(57.4%±0.52%)；DMEM/F12-10%FBS為22 h(58.5%±0.69%),都高于0.10和0.20μg/mL地美可辛阻斷同步化的效率，且具有顯著差異(P<0.05)．在DMEM傳代培養條件下，指數生長期MSFs(對照組)的有絲分裂指數更高，即G2/M期細胞比例高于DMEM/F12傳代培養的MSFs且存在極顯著差異(P<0.000 1)，表明DMEM更適于MSFs傳代培養．

隨著地美可辛阻斷同步化時間的延長，凋亡MSFs的比例逐漸增加(如表2所示)，G2/M期細胞的百分數達到最大值(阻斷同步化16～18h)后逐漸下降，說明阻斷同步化16h后，M期細胞凋亡率高于其增加率．地美可辛阻斷同步化超過16h誘發M期細胞凋亡，生成降低流式分辨率的亞細胞結構[19]，因此地美可辛同步化MSFs的時間應小于16h．

表1　G2/M期MSFs百分數(平均值±標準差)

注：對照樣本和地美可辛處理樣本之間G2/M期細胞百分數存在極顯著差異(P<0.001)．

表2　凋亡MSFs百分數(平均值±標準差)

注：4種培養條件下，地美可辛(0.05 ，0.10，0.20 μg/mL)阻斷同步化MSFs，凋亡MSFs的百分數．對照樣本和地美可辛處理樣本之間凋亡細胞百分比數存在極顯著差異(P<0.001)．

3結語

本文通過酶消化法能快速獲得大量具有高增殖率的新生小鼠皮膚成纖維細胞；相比DMEM/F12，在DMEM傳代培養條件下MSFs具有更高的增殖率和有絲分裂指數；FCM分析MSFs在不同地美可辛濃度下G2/M期百分數，發現0.05 μg/mL地美可辛阻斷同步化MSFs 的效率最高．根據地美可辛處理條件下MSFs凋亡和G2/M百分數的變化規律，發現地美可辛阻斷同步化時間應小于16h．

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文章編號：1671-0444(2016)03-0390-05

收稿日期：2015-06-08

基金項目：國家自然科學基金面上資助項目(31371257)；上海市科委關鍵資助項目(12140900404)

作者簡介：晁天柱(1982—)，男，山東棗莊人，博士研究生，研究方向為醫學分子遺傳學.E-mail：chaotianzhu@126.com 肖君華(聯系人)，男，教授，E-mail：xiaojunhua@dhu.edu.cn

中圖分類號：Q 952

文獻標志碼：A

Isolation and Culturing of Fibroblasts from Newborn Mouse Skin for Chromosome Sorting

CHAOTian-zhu,XUFu-yi,XUWei,LIKai,ZHOUYu-xun,XIAOJun-hua

(Institute of Biological Sciences and Biotechnology,Donghua University, Shanghai 201620, China)

Abstract:The newborn mouse skin fibroblasts (MSFs) were isolated from the skin of newborn mouse using collagenase and trypsin digestion method. And the proliferation and synchronization rate of MSFs were measured by methylthiazolyl-tetrazolium (MTT ) assay and flow cytometry (FCM ) under different blood serum concentration and medium, respectively. Results show that the healthy and highly active MSFs were isolated using enzyme digestion method. In different blood serum concentration and medium, MSFs have the optimum synchronization rate with 0.05 μg/mL demecocline, and highest proliferation rate and mitoticindex under the culture of Dulbecco’s modified eagle medium (DMEM) in passage two. And the research result provides the experimental materials and research foundations for the flow chromosome sorting.

Key words:fibroblast; methylthiazolyl-tetrazolium (MTT ); cell synchronization; flow cytometry