分散固相萃取凈化-高效液相色譜-串聯質譜法測定魚體中地克珠利殘留量

邢麗紅，孫偉紅*，孫曉杰，李兆新，郭江濤（中國水產科學研究院黃海水產研究所，農業部水產品質量安全檢測與評價重點實驗，農業部水產品質量安全風險評估實驗室（青島），山東 青島 266071）

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分散固相萃取凈化-高效液相色譜-串聯質譜法測定魚體中地克珠利殘留量

邢麗紅，孫偉紅*，孫曉杰，李兆新，郭江濤
（中國水產科學研究院黃海水產研究所，農業部水產品質量安全檢測與評價重點實驗，農業部水產品質量安全風險評估實驗室（青島），山東 青島 266071）

建立分散固相萃取凈化-高效液相色譜-串聯質譜法測定魚體中地克珠利殘留量的分析方法。樣品經無水硫酸鈉脫水，乙腈超聲提取并減壓濃縮，正己烷去脂，基質分散固相萃取凈化，以電噴霧離子源負離子掃描模式進行質譜分析，內標法定量。結果表明，地克珠利在1～100 μg/L范圍內線性關系良好，相關系數R2大于0.999。地克珠利添加水平為1.00～50.0 μg/kg時，平均回收率在95.4%～108%之間，批內和批間變異系數均小于15%。地克珠利的檢出限為0.50 μg/kg。本方法靈敏、高效、簡單、重復性好，能滿足魚體中地克珠利殘留量的檢測要求。

分散固相萃取；高效液相色譜-串聯質譜；魚；地克珠利

地克珠利是20世紀80年代由比利時楊森制藥公司開發研制的非聚醚類化學合成抗球蟲藥，屬三嗪苯乙腈化合物，具有高效、低毒、廣譜的特點，常被用于養禽業和養兔業抗球蟲病的預防和治療［1-3］。地克珠利對水生動物孢子蟲等有抑制或殺滅作用，在水產養殖中主要用于防治鯉科魚類粘孢子蟲、碘泡蟲、尾孢子、四極蟲、單極蟲等孢子蟲病。由于地克珠利具有低毒、廣譜、用量小等特點，在使用過程中存在濫用藥物、不遵守休藥期等情況，因此帶來了一系列獸藥殘留問題，對人體健康存在潛在的危害。

地克珠利的殘留標示物是其本身。各國政府和國際組織均制定了動物源性食品中地克珠利的最大殘留限量（maximum residue limits，MRLs）［4-6］。我國農業部公告第235號規定地克珠利在綿羊/禽/兔的肌肉、脂肪、肝和腎組織中的MRLs分別為500、1 000、3 000、2 000 μg/kg［7］。由于缺少地克珠利在有鰭魚類肌肉中殘留量的檢測方法，因此，目前國內外均沒有制定地克珠利在魚體組織中的MRLs［8］。

地克珠利殘留量的檢測方法主要有氣相色譜-質譜法［9］、高效液相色譜法［8，10-11］、液相色譜-串聯質譜法［12-22］及高分辨質譜法［23-24］，檢測對象以畜禽組織為主，目前鮮見測定魚體中地克珠利殘留量的液相色譜-串聯質譜法。現有的樣品前處理方法復雜，樣品凈化步驟操作繁瑣，檢測效率低下。本研究對樣品提取和凈化方式進行優化，采用與地克珠利化學結構和性質相似的Diclazuril-methyl作為內標，利用分散固相萃取凈化結合高效液相色譜-串聯質譜，建立了一種操作快速、簡便且高靈敏度的檢測魚體中地克珠利殘留量的分析方法。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

地克珠利標準品（CAS:101831-37-2）、Diclazurilmethyl內標標準品（純度≥98.0%） 美國Sigma公司。

乙腈、甲醇、正己烷（均為色譜純） 德國Merck公司；無水硫酸鈉（分析純，經650 ℃灼燒4 h，置于干燥器內備用） 國藥集團化學試劑有限公司；N-丙基乙二胺（N-propylethylendiamine，PSA）、十八烷基鍵合硅膠吸附劑（C18）、硅膠（Cleanert Silica）天津博納艾杰爾科技有限公司；強陰離子交換層析填料（LC-SAX）、石墨化炭黑（ENVI-Carb） 美國Sigma-Aldrich公司；酸性氧化鋁（LC-Alumina-A）、弗羅里硅土（Florisil）、中性氧化鋁（LC-Alumina-N）、堿性氧化鋁（LC-Alumina-B）、強陽離子交換層析填料（LCSCX） 美國Supelco公司；N-乙烯吡咯烷酮-二乙烯基苯聚合物（HLB） 德國CNW公司。

1.2 儀器與設備

TSQ Quantum Access高效液相色譜-串聯質譜儀（配電噴霧離子源）、高速離心機（6 000 r/min） 美國Thermo Fisher科技公司；分析天平（感量0.01 g）德國賽多利斯集團；離心機（14 000 r/min） 德國Sigma公司；渦旋混合器 美國Talboys公司；旋轉蒸發儀 德國Heidoplh公司；超聲波清洗儀 昆山市超聲儀器有限公司；Gradient A10 Mill-Q超純水儀 美國Millipore公司。

1.3 方法

1.3.1 樣品處理

稱取樣品2 g（精確到0.01 g）于50 mL具塞離心管中，準確加入內標標準溶液100 μL，渦旋混合30 s，避光放置10 min。加入無水硫酸鈉2 g，渦旋振蕩1 min使其分散均勻，再加入乙腈10 mL，渦旋混合1 min，超聲提取10 min，6 000 r/min離心5 min，將上清液轉移至50 mL梨形瓶中。乙腈10 mL加入到50 mL離心管中重復提取一次，合并提取液，40 ℃減壓濃縮至干。準確加入80%甲醇溶液1 mL，渦旋混勻，充分溶解殘余物，待凈化。

在上述待凈化液中，先加入正己烷2 mL，充分渦旋混合1 min，6 000 r/min離心5 min，棄去正己烷層，再加入C18吸附劑50 mg，充分渦旋混合1 min，14 000 r/min離心5 min，取清液過0.22 μm有機相濾膜后，供高效液相色譜-串聯質譜儀測定。

1.3.2 標準工作曲線的制作

標準儲備液的配制：稱取適量地克珠利及其內標標準品，先用1 mL N，N-二甲基甲酰胺將其溶解，再用甲醇稀釋并定容，配制成1.0 mg/mL標準儲備液，-18 ℃避光保存，有效期6 個月。地克珠利標準使用液：準確移取適量1 mg/mL地克珠利標準儲備液，用甲醇稀釋，配制成1 μg/mL標準使用液，-18 ℃避光保存。

內標標準使用液的配制：準確移取適量1 mg/mL Diclazuril-methyl內標標準儲備液，用甲醇逐級稀釋，配制成100 ng/mL內標標準使用液，現配現用。

準確移取適量地克珠利標準使用液，用流動相稀釋成質量濃度分別為1、2、5、10、20、50、100 μg/L、內標質量濃度為10 μg/L的標準工作液，供高效液相色譜-串聯質譜儀測定。

1.3.3 色譜及質譜條件

1.3.3.1 色譜條件

色譜柱：Waters XTerra C18柱（2.1 mm×150 mm，5 μm）；柱溫：室溫；流速：0.2 mL/min；進樣量：10 μL；流動相：A為5 mmol/L醋酸銨溶液，B為甲醇；梯度洗脫程序見表1。

表1 流動相梯度洗脫程序Table 1 Gradient eluti on program of mobilep hase

1.3.3.2 質譜條件

離子化模式：電噴霧離子源（e l e c t r o s p r a y ionization，ESI），負離子模式；噴霧電壓：3 500 V；霧化氣壓力：12 L/min；輔助氣流量：2 L/min；離子傳輸管溫度：300 ℃；源內碰撞誘導解離電壓：10 V；掃描模式：選擇反應監測，選擇反應監測母離子、子離子和碰撞能量見表2；Q1半峰寬：0.7 D；Q3半峰寬：0.7 D；碰撞氣（氬氣）壓力：0.2 Pa。

表2 選擇反應監測母離子、子離子和碰撞能量Table 2 Precursor i on s，p roducti on s and c ollisi on energy of diclazuril and its in ter nalst and a rd u nd er S RM m od e

2 結果與分析

2.1 線性范圍和檢出限

用地克珠利標準工作液配制質量濃度分別為1、2、5、10、20、50、100 μg/L的標準溶液，內標添加質量濃度均為10 μg/L，進樣后繪制標準工作曲線。結果表明，地克珠利在1～100 μg/L范圍內線性關系良好，線性方程Y=0.015 554 8+0.015 072 8X，相關系數R2大于0.999。方法的檢出限理論上為地克珠利豐度較弱子離子的信噪比不小于3。將加標質量濃度逐級稀釋添加于空白樣品中測定信噪比，最終確定該方法的檢出限為0.50 μg/kg。

2.2 回收率和精密度

準確稱取2.00 g陰性鯉魚、草魚、鳊魚樣品，添加水平分別為1.00、5.00、50.0 μg/kg，每個添加水平平行測定6 次，共測定3 個批次，計算回收率和精密度，見表3。結果表明，本方法在1.00～50.0 μg/kg添加水平的平均回收率在95.4%～108%之間，批內變異系數在5.68%～12.8%之間，批間變異系數在7.26%～10.2%之間，符合殘留檢測要求。地克珠利標準、空白樣品及加標樣品特征質量離子色譜圖見圖1～3。

表3 地克珠利的平均回收率和變異系數（n=6）Table 3 Averager ecoveries and coefficients of v ariati on of diclazuril（n= 6）

圖1 地克珠利標準特征離子質量色譜圖（1μ g / L ）Fig.1 Characteristic ion mass chromatogram of diclazuril standard

圖2 鯉魚空白樣品特征離子質量色譜圖Fig.2 Characteristic ion mass chromatogram of blank sample of common carp meat

圖3 鯉魚加標樣品特征離子質量色譜圖 （0.50 μ g / k g ）Fig.3 Characteristic ion mass chromatogram of spiked sample of common carp meat

2.3 實驗條件優化

2.3.1 提取溶劑的選擇

實驗分別選擇乙腈、乙酸乙酯、N，N-二甲基甲酰胺、乙腈-氯仿（10∶1，V/V）、氯仿-乙腈（9∶1，V/V）作為提取溶劑。結果表明，不論采用哪種提取溶劑，地克珠利的回收率均較低。比較這幾種提取溶劑，乙腈和N，N-二甲基甲酰胺的回收率最高，樣品平行性最好，乙酸乙酯不及乙腈的回收率高，乙腈與氯仿混合液的提取回收率最低，且樣品之間的平行性差。綜合考慮，乙腈與魚肉組織的兼容性較好，兼有去除部分脂肪的功能，是藥物殘留檢測的常規試劑，因此本實驗選用乙腈作為提取溶劑。地克珠利在不同提取溶劑中的回收率見表4。Szilard等［18］研究了乙腈、甲醇、乙酸乙酯等提取劑對地克珠利的提取回收率，與本實驗結果相近。

表4 地克珠利在不同提取溶劑中的提取回收率Table 4 Extracti on recoveries of diclazuril in differentsolvents

乙腈不僅將目標化合物提取出來，同時也將樣品基質中的水分一起提取出來，因此在樣品提取液中加入無水硫酸鈉脫除水分，有利于下一步的濃縮操作。本實驗對加入無水硫酸鈉前后的提取液進行比較，發現無水硫酸鈉對地克珠利沒有吸附作用。

2.3.2 凈化方式的選擇

由于地克珠利的回收率較低，因此凈化過程盡可能選擇簡單又能保證靈敏度和專一性的方式。本實驗首先選擇液液萃取凈化，再采用基質分散固相萃取方式進行凈化。水產樣品種類繁多，樣品基質復雜，有些樣品含脂量較高，嚴重影響地克珠利的靈敏度，因此實驗首先采用正己烷去除脂肪。常規的固相萃取凈化方式既費時又費力，而基質分散固相萃取方法是一種簡便、快捷的前處理方式，在獸藥殘留檢測方面的應用也越來越多。本實驗分別對C18、PSA、HLB、LC-Alumina-A、LC-Alumina-B、LC-Alumina-N、LC-SAX、LC-SCX、Florisil、ENVI-Carb、Cleanert Silica 這11 種吸附劑在不同添加量時對地克珠利回收率的影響進行研究，其結果見圖4。

圖4 不同吸附劑對地克珠利回收率的影響Fig.4 Influence of different sorbents on the recovery of diclazuril

通過比較不同吸附劑的加標回收率數據發現，C18、LC-SAX、LC-SCX、Florisil和Cleanert Silica這幾種吸附劑隨著用量的增加，地克珠利的回收率并沒有顯著下降，表明這幾種吸附劑對地克珠利的吸附作用較差。相反，PSA、HLB、LC-Alumina-A、LC-Alumina-B、LCAlumina-N和ENVI-Carb這6 種吸附劑則隨著用量的增加，地克珠利的回收率與之呈負相關，表明這6 種吸附劑對地克珠利有較強的吸附作用。C18填料既具有較高且較穩定的回收率，又具有很好的除雜效果，通過添加不同用量的C18發現，雖然地克珠利的回收率隨添加量的增加有所下降，但即使添加量達到200 mg時，回收率仍然大于80%，當添加量為50 mg時，即可達到理想的除雜效果。因此本實驗選擇在基質中添加50 mg的C18填料作為吸附劑。

2.3.3 內標的選擇

通過查閱文獻［18］及實驗驗證，地克珠利的絕對回收率較低。由于沒有商品化的內標物質，因此需選擇與地克珠利結構和化學性質比較相似的化合物作為內標標準物質。分別實驗了地克珠利內標1和地克珠利內標2兩種物質作內標。地克珠利、地克珠利內標1和地克珠利內標2結構式如圖5所示。

圖5 地克珠利及其內標結構Fig.5 Structures of diclazuril and its internal standard

地克珠利內標1（m/z 422.7＞351.8）結構如圖5b所示，雖然內標1和地克珠利的化學結構比較相似，但其化學性質仍然存在差異。內標1的極性比地克珠利大，在色譜柱上的保留時間與地克珠利相差較大，以水產品為基質進行添加回收率實驗，效果并不理想。實驗選擇Diclazuril methyl作為內標（圖5c）進行實驗驗證。結果表明，Diclazuril methyl化學結構及性質與地克珠利相似，色譜保留時間及提取回收率均比較接近，通過反復實驗驗證，選擇該物質作為內標進行添加回收率實驗，可以取得較好的實驗效果。

2.3.4 標準溶液的配制

地克珠利的化學性質幾乎不溶于水，微溶于乙醇、乙醚，溶于N，N-二甲基甲酰胺、二甲基亞砜和四氫呋喃。實驗發現，地克珠利在甲醇和乙腈中的溶解性較差，因此在配制標準儲備液時，需先用N，N-二甲基甲酰胺將其溶解，再用甲醇稀釋效果較理想。在配制地克珠利標準儲備液時，大多數使用N，N-二甲基甲酰胺的量較大，本實驗發現，先用1 mL N，N-二甲基甲酰胺溶解地克珠利，再加入甲醇定容，既能將地克珠利溶解，又能避免大量使用N，N-二甲基甲酰胺對質譜系統造成的損害。

2.3.5 定容溶液的選擇

地克珠利幾乎不溶于水，因此定容溶劑中水相所占比例對其靈敏度和回收率有至關重要的影響。分別實驗了5%、50%、80%、100%甲醇溶液作為定容溶劑對測定結果的影響，結果表明，隨著有機相比例的加大，靈敏度也隨之提高，二者呈正相關。但定容溶劑采用100%甲醇，會導致峰形變差。經過前處理的樣品如果用水相比例較高的溶液定容，因溶解性的原因也會導致其回收率大幅降低。綜合考慮靈敏度和峰形的影響，最終決定采用80%甲醇溶液作為定容溶劑。

2.3.6 質譜條件的優化

圖6 地克珠利的同位素峰質譜圖Fig.6 Isotope peak spectrum of diclazuril

地克珠利及其內標在負離子模式下解離生成（M-H-）。分別對噴霧電壓、鞘氣、輔助氣、碰撞能量等質譜參數進行優化。按照歐盟委員會2002/657/EC［25］對殘留鑒定的技術文件規定，采用高效液相色譜-串聯質譜法判定動物源性食品中的禁用化合物必須獲得4 個鑒定分，即1 個母離子為1.0分，1 個子離子為1.5 分。對于高效液相色譜-串聯質譜而言，1 個母離子和2 個碎片離子即可滿足定性要求。但對于地克珠利而言，只生成1 個碎片離子。由于地克珠利分子結構中包含3 個氯分子，氯在自然界中有兩個同位素35Cl和37Cl。地克珠利在負離子模式下可監測到分子離子峰m/z 411、409、407、405（圖6），分別代表氯同位素37Cl3、35Cl37Cl2、35Cl237Cl和35Cl3形態的地克珠利。m/z 411、409、407、405在串聯質譜模式下的碎片離子分別為m/z 340、338、336、334。根據天然同位素所占比例，地克珠利包含1.4%37Cl3、13.3%35Cl37Cl2、41.7%35Cl237Cl、43.5%35Cl3。

歐盟委員會2002/657/EC決議一方面它允許使用同位素峰，另一方面它要求不能所有的同位素碎片源于同一分子。地克珠利只產生1個碎片離子，只能選擇同位素峰來滿足判定要求。因此實驗選擇豐度最高的m/z 405 和m/z 407兩個離子為母離子，以各自的子離子m/z 334和m/z 336作為子離子，共獲得5 個確證分，符合歐盟對殘留物的確證檢測要求。m/z 407、405具有相同的豐度，本實驗以m/z 407＞336和m/z 405＞334作為定性離子對，以m/z 407＞336作為定量離子對。

2.3.7 色譜條件的優化

地克珠利采用負離子模式掃描，因此流動相的選擇對其峰形及靈敏度有較大的影響。實驗分別比較了乙酸銨-甲醇、乙酸銨-乙腈、甲酸-甲醇作為流動相，并實驗了不同的梯度條件。結果表明，采用乙酸銨-甲醇作為流動相，在負離子掃描模式下，既有較高的靈敏度，又能獲得良好的峰形。而有機相采用乙腈，其峰形會變差，且靈敏度也不及甲醇。水相采用0.1%甲酸，峰形也會變差，且在負離子掃描模式下，其靈敏度會降低約31%～49%。色譜柱分別實驗了Waters XTerra C18（2.1 mm×150 mm，3.5 μm）和Agilent XDB C18（2.1 mm×150 mm，5 μm）及Venusil ASB C18（2.1 mm×150 mm，5 μm）3 種色譜柱，結果表明，Waters XTerra C18（2.1 mm×150 mm，3.5 μm）峰形尖銳、對稱，分離效果最好。

3 結 論

通過乙腈提取樣品中的地克珠利殘留量，無水硫酸鈉脫除水分，正己烷去脂，基質分散固相萃取凈化，以及優化高效液相色譜及質譜條件，建立了一種測定魚體中地克珠利殘留量的方法。該方法前處理簡單，無需固相萃取柱凈化，降低了成本，準確度高、重復性好，是一種簡便、快速、高效的測定方法，適用于魚體中地克珠利殘留量的測定，同時也為制定魚體中地克珠利的MRLs提供了技術支持。

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［25］ Commission Decision No 2002/657/EC［S/OL］.http://eur-lex.europa.eu/legal-content/EN/TXT/PDF/？uri=CELEX:32002D0657&rid=1.

Determination of Diclazuril in Fish by High Performance Liquid Chromatography-Tandem Mass Spectrometry with Dispersive Solid Phase Extraction

XING Lihong， SUN Weihong*， SUN Xiaojie， LI Zhaoxin， GUO Jiangtao
（Yellow Sea Fisheries Research Institute， Key Laboratory of Testing and Evaluation for Aquatic Product Safety and Quality，Ministry of Agriculture， Laboratory of Quality and Safety Risk Assessment for Aquatic Products （Qingdao）， Ministry of Agriculture，Chinese Academy of Fishery Sciences， Qingdao 266071， China）

A method has been developed for the determination of diclazuril in fish by high performance liquid chromatography-tandem mass spectrometry （HPLC-MS/MS） with dispersive solid phase extraction.Samples were dehydrated with anhydrous sodium sulfate， and extracted with acetonitrile.Then the extracts were concentrated under vacuum condition.The samples were degreased with hexane and cleaned up by dispersive solid phase extraction， analyzed by HPLC-MS/MS and quantified with internal standard method.Electrospray ionization was applied and operated in the negative ion mode.The calibration curve showed good linearity between peak area and the concentration of diclazuril in the range of 1-100 μg/L with a correlation coefficient over 0.999.The average recoveries from spiked sample at the three concentrations of 1.00， 5.00 and 50.0 μg/kg ranged from 95.4% to 108% with intra- and inter-batch relative standard deviations below 15%.The limit of detection （LOD） for diclazuril was 0.50 μg/kg.This efficient and simple method could be used to identify and quantify diclazuril in fish with satisfactory sensitivity and repeatability.

dispersive solid phase extraction； high performance liquid chromatography-tandem mass spectrometry （HPLC-MS/MS）； fish； diclazuril

10.7506/spkx1002-6630-201614031

O657.63

A

1002-6630（2016）14-0174-06

邢麗紅， 孫偉紅， 孫曉杰， 等.分散固相萃取凈化-高效液相色譜-串聯質譜法測定魚體中地克珠利殘留量［J］.食品科學，2016， 37（14）: 174-179.DOI:10.7506/spkx1002-6630-201614031. http://www.spkx.net.cn

XING Lihong， SUN Weihong， SUN Xiaojie， et al.Determination of diclazuril in fish by high performance liquid chromatography-tandem mass spectrometry with dispersive solid phase extraction［J］.Food Science， 2016， 37（14）: 174-179.（in Chinese with English abstract） DOI:10.7506/spkx1002-6630-201614031. http://www.spkx.net.cn

2015-11-15

2015年國家水產品質量安全風險評估項目（GJFP201501001）；國家自然科學基金青年科學基金項目（21207162）

邢麗紅（1981—），女，助理研究員，碩士，主要從事水產品質量安全檢測研究。E-mail：xinglh@ysfri.ac.cn

*通信作者：孫偉紅（1977—），女，高級工程師，博士，主要從事水產品質量安全及風險評估研究。E-mail：sunwh@ysfri.ac.cn