葡萄酵素天然發酵過程中抗氧化性能研究

郭艷萍，趙金安（太原工業學院環境與安全工程系，山西太原030008）

葡萄酵素天然發酵過程中抗氧化性能研究

郭艷萍，趙金安
（太原工業學院環境與安全工程系，山西太原030008）

采用分光光度法通過測定黑雞心葡萄酵素天然發酵過程中不同階段的總酚含量、還原能力及其對DPPH·、·OH、O2-·、ABTS自由基的清除率來評價天然酵素的抗氧化性能。結果顯示：黑雞心葡萄天然酵素在發酵過程中總酚含量上升，對DPPH自由基、O2-·、·OH和ABTS自由基清除能力均呈逐漸增加趨勢，發酵前后分別提高了6.84%，19.82%、7.32%和14.81%增幅較大，同時顯示出與酵素總酚含量的變化有明顯的正相關性。

黑雞心葡萄酵素；天然發酵；抗氧化性

葡萄酵素是以葡萄為原料，經過多種有益菌發酵制得的含有多種微生物次生代謝產物、維生素和礦物質的液態微生物發酵產品［1］。酵素參與人類生命活動的各種生理生化反應，是人體不可或缺的物質。研究表明，天然酵素具有抗氧化性能，可清除人體內多余的自由基，減輕它們對機體的損傷［2］。目前，國外研究人員已用生物技術提取天然酵素，將其加入到美容產品和保健食品中，就國內而言，天然酵素產品的應用范圍還不是很廣泛，隨著人們保健意識的增強，消費觀念的轉變，酵素作為一種純天然的、多功能的、安全性較高的食品、保健品和化妝品原料，具有很廣闊的應用前景［3］。

黑雞心葡萄是山西特有的葡萄品種之一［4］，色澤黑紫，形似雞心，果粒密實，柔軟多汁，但其含酸量較高果實生食口感較差，種植率下降，品種急需保護。本研究采用分光光度法對黑雞心葡萄酵素天然發酵過程中的總酚含量、DPPH·、·OH、O2-·、ABTS自由基清除率和還原力進行了測定，為天然黑雞心葡萄酵素的生產研發提供一定的數據支持，旨在為黑雞心葡萄的多功能開發利用以及品種保護提供理論參考。

1　材料與方法

1.1材料與試劑

山西清徐黑雞心葡萄：取自山西清徐縣徐溝鎮果園；三氯乙酸、硫酸亞鐵、水楊酸鈉、硝基四氮唑藍（NBT）、煙酰胺腺嘌呤二核苷酸（NADH）、沒食子酸、酚試劑、α，α-二苯基-β-苦苯肼（DPPH）、吩嗪硫酸甲酯（PMS）、磷酸氫二鈉、磷酸二氫鈉、鐵氰化鉀：均為分析純。

1.2儀器與設備

SW-C1-IPD-Z型潔凈工作臺：上海安因科技有限公司；數顯pH儀：美國Thermo賽默飛世爾科技；TGL-16G-C高速冷凍離心機：上海安亭科學儀器廠；752N型紫外可見分光光度計：上海精密科學儀器有限公司。

1.3試驗方法

1.3.1葡萄酵素的制備［5］

黑雞心葡萄洗凈、晾干，再與冰糖（紫外滅菌）按質量比1∶1加入到無菌玻璃瓶中，密封常溫下發酵，以上步驟均在無菌操作臺中進行。發酵開始后，每6天為一階段取樣，樣品10 000 r/min冷凍高速離心15 min后進行各項測定。

1.3.2葡萄酵素pH的測定

發酵過程中每隔6天用pH計測定葡萄酵素的pH。

1.3.3總酚含量測定［6］

配置一系列濃度的沒食子酸，加入顯色劑后在765 nm下測定吸光度值，繪制標準曲線，y=0.092 0x+ 0.020 8，R2=0.999 9。取各階段葡萄酵素樣品100 μL加入45.9 mL去離子水，1 mL酚試劑，3 mL Na2CO3溶液（20 g/100 mL），25℃恒溫水浴2 h后765 nm下測吸光度。

1.3.4DPPH·清除能力［6］

取不同階段葡萄酵素樣品40 μL加入到4 mL DPPH乙醇溶液中，再加入450 μL Tris-鹽酸緩沖液（50 mmol/L，pH7.4），混勻避光，25℃恒溫水浴1 h后517 nm下測吸光度A517。

式中：Ac為DPPH溶液與等體積無水乙醇混合時的吸光度值；Ai為樣品本底管的吸光度值。

1.3.5超氧自由基（O2-·）清除能力

采用鄰苯三酚法［7］：取不同階段葡萄酵素樣品50 μL加入到950 μL磷酸緩沖液（0.1 mol/L pH7.4），再加入1 mL 936 μmol/L NADH，1 mL 300 μmol/L NBT 和1 mL 120 μmol/L PMS。25℃反應5 min后560 nm下測吸光度A560。

式中：Ac為空白對照的吸光度值；Ai為樣品本底管的吸光度值。

1.3.6羥基自由基（·OH）清除能力

采用水楊酸法［7］：取不同階段葡萄酵素樣品135 μL加入到1.4 mL 6 mmol/L H2O2，充分混勻后加入0.6 mL 20 mmol/L水楊酸鈉和2 mL1.5 mmol/L FeSO4，25℃下恒溫水浴1 h后562 nm下測定吸光度A562。

式中：Ac為空白對照的吸光度值；Ai為樣品本底管的吸光度值。

1.3.7ABTS自由基清除能力［8］

ABTS母液：用pH7.4的5mmol/LPBS配制7mmol/L ABTS，加入過硫酸鉀至濃度為2.45mmol/L，25℃下避光放置12 h。用PBS稀釋母液在734 nm下吸光度為0.7。

取不同階段葡萄酵素樣品10 μL加入到5 mL ABTS母液中，30℃恒溫水浴反應5 min后734 nm下測定吸光度A734。

式中：Ac為空白對照的吸光度值；Ai為樣品本底管的吸光度值。

1.3.8還原力測定

采用普魯士藍法［7］。取不同階段葡萄酵素樣品30μL加入到2.5 mL磷酸緩沖液（0.2 mol/L，pH6.6）中，再加入1%K3［Fe（CN）6］2.5 mL，50℃恒溫水浴半小時，然后加入10%三氯乙酸2.5 mL，6 000 r/min離心10 min，取2.5 mL的上清液，加入等體積去離子水和0.1%三氯化鐵0.5 mL。700 nm下測定吸光度A700，吸光度值越高，還原力越強。

2　結果與分析

2.1葡萄酵素pH的變化

天然發酵過程中不同階段黑雞心葡萄酵素pH隨時間的變化（圖1）。

圖1發酵過程中pH變化Fig.1　pH changes during fermentation

葡萄酵素在發酵初期pH從5.99降到4.55，之后在12 d稍有回升，到18 d再次降到3.08，之后趨于平穩。pH變化過程顯示出葡萄酵素由于葡萄本身所含有的蘋果酸、酒石酸、檸檬酸等酸性物質使初始pH為酸性。酵素在12 d至18 d內快速發酵，發酵過程中產生的二氧化碳溶解在酵液中，也使得pH降低。隨著發酵進行進入緩慢發酵階段，酵液中微生物對葡萄蛋白的降解利用，使得pH稍有回升呈波形起伏。

2.2葡萄酵素總酚含量的測定

按照1.3.3總酚含量的測定方法，測得黑雞心葡萄酵素總酚含量在發酵過程中各階段的變化見圖2。

圖2 發酵過程中總酚含量變化Fig.2　Total phenolic changes during fermentation

圖2顯示，葡萄酵素總酚含量在發酵過程中逐步上升，至30 d達到最大值2.852 mg/mL后下降并趨于穩定，但總酚含量仍高于發酵初始時含量。發酵在最初的30 d內逐步增加，之后趨于穩定。酵素發酵初期酵母等微生物快速繁殖，此時酚類物質伴隨著碳源氮源的消耗而釋放出來，使得總酚含量增加。隨著發酵進行，酚類物質已基本溶出，溶出速率趨于平穩。

2.3葡萄酵素對DPPH·清除能力

有研究表明多酚類物質及其代謝產物的抗氧化活性與其結構中的核心功能組有關，并且這類特殊的核心功能組結構可清除自由基、螯合金屬離子及氧化活性物質。DPPH·是人工合成的脂溶性自由基，廣泛用于測定物質的抗氧化性，更廣泛的應用于測定葡萄及葡萄酒的抗氧化性［9］。葡萄酵素發酵各階段DPPH·的清除作用如圖3所示。

圖3 發酵過程中DPPH·清除能力變化Fig.3　DPPH·scavenging ability changes during fermentation

由圖3可看出，葡萄酵素對DPPH·有較高的清除能力，發酵前后清除率增加6.84%，第30天出現最大值94.87%，發酵后期略有下降。結合圖2來看，葡萄酵素對自由基的清除能力變化與總酚含量變化曲線相似，均在發酵初期第6天有小幅升高，在18天小幅回落，在30天出現峰值后下降。有研究表明，酚類物質具有較強的抗氧化活性。葡萄酵素發酵過程中逐步釋放出酚類物質，酚類物質的積累使得酵素的抗氧化活性增強。

2.4葡萄酵素對超氧自由基（O2-·）清除能力

O2-·是人體內活性氧的一種，可作為自由基鏈式反應的引發劑，產生活性更強的自由基引起蛋白質、核酸和脂類的氧化損傷。葡萄酵素發酵各階段對O2-·的清除作用見圖4。

圖4　發酵過程中O2-·清除能力變化Fig.4　O2-·scavenging ability changes during fermentation

圖4顯示，葡萄酵素發酵過程中對O2-·清除能力的增幅最大，發酵前6 d清除率急劇增大，6 d～12 d略有降低，12 d～24 d持續增高，到30天達到最大值，發酵前后清除率增加了19.82%。

2.5葡萄酵素對羥基自由基（·OH）清除能力

·OH是生物體產生的一種反應活性極高的自由基，具有極強的得電子能力也就是氧化能力，可損傷細胞膜，導致疾病發生。葡萄酵素發酵各階段對·OH的清除作用見圖5。

圖5發酵過程中·OH清除能力變化Fig.5·OH scavenging ability changes during fermentation

圖5顯示，葡萄酵素對·OH的清除能力相對于其它自由基的清除能力較低，但高于其它天然酵素［2］對·OH的清除能力。葡萄酵素對·OH的清除能力在第6天出現小幅增強后迅速降低，18 d降至最低值后急速上升，在30 d時達到54.84%，比未發酵時增加了7.32%。

2.6葡萄酵素對ABTS自由基清除能力

葡萄酵素發酵各階段對ABTS自由基的清除作用如圖6所示。

圖6　發酵過程中ABTS自由基清除能力變化Fig.6　ABTS radical scavenging ability changes during fermentation

由圖6可知，發酵過程中葡萄酵素對ABTS自由基的清除作用較強，除12天有小幅降低外清除能力持續增高，30天時出現最大值88.89%，發酵前后清除率增加14%左右。ABTS自由基的清除能力常被用來衡量葡萄及葡萄制品的抗氧化性，黑雞心葡萄酵素對其清除能力較高說明抗氧化性較好，有一定的開發及應用價值。

2.7葡萄酵素發酵過程中還原力的變化

葡萄酵素發酵各階段還原力的變化如圖7所示。

圖7　發酵過程中還原力變化Fig.7　Reducing power changes during fermentation

由圖7可知，葡萄酵素發酵過程各階段還原力呈波浪形不規則變化，大幅上升后大幅回落，發酵后期又大幅上升無規律可尋。

3　結論

研究結果表明在天然條件下，以山西特有葡萄品種黑雞心為原料，經過多種有益菌發酵制得的黑雞心葡萄酵素有較好的抗氧化的能力，并且經發酵30 d產生的酵素抗氧化能力最強。抗氧化性能從自由基清除率和還原力兩方面考查，得出以下結論：發酵過程中葡萄酵素對DPPH自由基、O2-·、·OH和ABTS自由基清除能力均呈逐漸增加趨勢，發酵前后分別提高了6.84%，19.82%、7.32%和14.81%，增幅較大。還原力呈波浪形不規則變化，呈上升趨勢，抗氧化能力間歇性增強。對葡萄酵素發酵各階段總酚含量的測定結果表明，葡萄酵素在發酵過程中總酚含量上升，酵素對自由基的清除能力與總酚含量的變化呈相同趨勢，具有一定相關性。本研究結果可為天然黑雞心葡萄酵素的生產研發提供一定的數據支持，為黑雞心葡萄的多功能開發利用以及品種保護提供理論依據。

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［3］王定昌，賴榮婷.糙米酵素的功能與開發［J］.糧油食品科技，2001，9 （1）：2-3

［4］郭艷萍，劉美林，賀東亮，等.抑制劑對黑雞心葡萄多酚氧化酶活性的影響［J］.山西農業大學學報（自然科學版），2014（5）：477-480

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Changes in Antioxidant Activity of Black Heart Grapes-ferment during Natural Fermentation Process

GUO Yan-ping，ZHAO Jin-an
（Department of Environmental and Safety Engineering，Taiyuan Institute of Technology，Taiyuan 030008，Shanxi，China）

To investigate the antioxidant ability of black heart grapes-ferment，the content of total phenol，DPPH·，·OH，O2-·，ABTS radical scavenging ability during fermentation process were determined by spectrophotometer.The results indicated that the amount of total phenolics were increased during fermentation process.Before and after fermentation the DPPH·、·OH、O2-·、ABTS radical scavenging ability were increased by 6.84%，19.82%，7.32%and 14.81%，showed a high antioxidant capacity.The change of antioxidant activity was relevant to the change of total phenolics.

black heart grapes-ferment；natural fermentation；antioxidant ability

10.3969/j.issn.1005-6521.2016.10.009

太原工業學院青年科學基金資助項目（2013LQ01）；山西省高等學校大學生創新創業訓練項目（2013375）

郭艷萍（1984—），女（漢），講師，碩士，研究方向：植物蛋白質工程。

2015-04-28