酶解咖啡鮮果對烘焙咖啡飲用品質和化學成分的影響研究

佟世生，王麗，靳靜言，崔忠義，劉萍，*（.北京城市學院生物醫藥學部，北京00083；.中國農業大學食品科學與營養工程學院，北京00083）

酶解咖啡鮮果對烘焙咖啡飲用品質和化學成分的影響研究

佟世生1，王麗1，靳靜言2，崔忠義2，劉萍1，*
（1.北京城市學院生物醫藥學部，北京100083；2.中國農業大學食品科學與營養工程學院，北京100083）

選用不同種類的酶對云南小粒咖啡去皮鮮果進行酶解，確定胃蛋白酶最適于制備麝香貓咖啡，隨后進行了胃蛋白酶酶解咖啡鮮果的條件優化，確定最佳酶解條件為胃蛋白酶添加量1%，酶解2h，酶解溫度55℃，此時感官評分為13.5分，高出未處理咖啡鮮果的感官評價結果1倍。同時研究酶解對咖啡鮮果中主要化學成分的影響，及其對咖啡鮮果烘焙后飲用品質的作用。

咖啡鮮果；酶解；相關性分析；云南小粒咖啡

麝香貓咖啡（Civet coffee），是咖啡鮮果被麝香貓（Civet）吃下，經過消化道消化后排泄出的咖啡生豆，具有特殊風味，但產量極低。Massimo［1］對天然麝香貓咖啡進行壓縮試驗發現，它們與未經麝香貓吞食的咖啡豆相比質地更堅硬且易碎，這表明麝香貓胃液滲透到了咖啡豆內部，胃蛋白酶或胰蛋白酶類蛋白酶可能通過內果皮對內部易感蛋白進行水解以改變咖啡烘焙后感官品質。Vandenberghe［2］等利用阿拉比卡咖啡模擬麝香貓咖啡時，使用鹽酸將消化環境調為1.5～2之間，并使用豬胃黏膜的胃蛋白酶（每克蛋白粉包含1 000個胃蛋白酶單位）進行酶解處理。天然麝香貓咖啡的生產過程大致如下：麝香貓將咖啡鮮果完整吞食，鮮果經由腸胃消化，最終由糞便排出。消化系統中大致包括兩個過程：一是腸胃中酶的水解處理，二是腸胃中微生物的發酵處理。麝香貓咖啡作為目前世界上生產成本最昂貴的咖啡品種，其生產過程受到麝香貓自身活動周期的限制。而近年來不斷出現將麝香貓消化系統作為機械咖啡發酵機的行為，也受到了一些動物保護者的抨擊。酶解咖啡的文獻資料中所使用過的酶包括淀粉酶、葡糖苷酶、甘露糖苷酶、葡聚糖酶、體外蛋白酶、體內蛋白酶、磷酸酯酶、植酸酶、磷脂酶、酯酶、核酸酶等。Mun［3］等使用胃蛋白酶對未經烘焙的咖啡生豆進行酶解以優化其風味品質，將未烘焙的咖啡生豆浸泡在pH為1.5～2的酸性液體中，該酸性溶液中包含胃蛋白酶，浸泡90 min至24 h。處理后的咖啡豆苦果味有所減少，整體口感與香氣有所提升。

研究中使用不同消化酶對云南小粒咖啡鮮果進行酶解，并對處理后的咖啡進行烘焙，通過感官評價和理化指標的檢測，篩選出能夠有效提高咖啡豆烘焙品質的消化酶類，分析消化酶對咖啡豆中主要化學成分的影響，同時對烘焙咖啡豆中主要化學成分與感官評價之間的相關性進行分析。

1　材料與方法

1.1材料與設備

1.1.1材料與試劑

咖啡鮮果：2013年11月產自云南保山地區的云南小粒咖啡鮮果；糖化酶（40U/mg）、果膠酶（150U/mg）、α-淀粉酶（500 U/mg）、纖維素酶（700 U/g）、胃蛋白酶（250 U/mg）、胰蛋白酶（10 000 BAEE U/mg）：Sigma公司；3，5-二硝基水楊酸、氫氧化鈉、磷酸氫二鈉（均為分析純）：北京化工廠；偏重亞硫酸鈉、苯酚、酒石酸鉀鈉、氧化鎂（均為分析純）：西隴化工股份有限公司；葡萄糖標品（色譜純）：上海市易欣生物科技有限公司；咖啡因標品、綠原酸標品、葫蘆巴堿標品（色譜純）：貴州迪大生物科技有限公司。

1.1.2主要儀器設備

KQ3200DE型數控超聲波清洗器：昆山市超聲儀器有限公司；DZKW-C型恒溫水浴鍋：北京中科星宇商貿有限公司；GENECAFé CBR-101咖啡烘焙機：Genesis Co.，Ltd；TSK-1171型滴漏式咖啡機：燦坤實業有限公司；TDL-40C型臺式離心機：上海安亭科學儀器廠；TFG-G型通風櫥：廣州佳鎂鏵實驗設備有限公司；LX-C50L型立式自動電熱壓力蒸汽滅菌鍋：上海申安醫療器械廠；DNP-9272型電熱恒溫培養箱：上海一恒科學儀器有限公司；PB-10型pH計：德國Sartorius公司。

1.2方法

1.2.1烘焙咖啡飲用品質評定

本試驗參考International Coffee Organization（Ico）國際標準、Cup of Excellence（Coe）感官評定細則及巴西式咖啡評分制度，結合實驗室人員多年咖啡品評經驗，制定出一套烘焙咖啡杯測評分方法（表1）。將每個指標設置為4個等級，邀請經過訓練的5名評價員組成評價小組對樣品進行客觀評價。感官評分的計算公式為：

感官評分總分=苦味+酸味+香味+余味+甜味+糊味+果味+順滑+醇厚（1）

表1　烘焙咖啡杯測評分標準Table 1　Evaluation standard of roasted coffee cupping

1.2.2烘焙咖啡蛋白質含量的測定

云南小粒咖啡鮮果烘焙樣品中蛋白質含量的測定方法采用GB 5009.5-2010《食品安全國家標準食品中蛋白質的測定》。

1.2.3烘焙咖啡還原糖含量的測定

取7支25 mL具塞試管，分別加入0.0、0.1、0.2、0.4、0.6、0.8、1.0 mL的1 mg/mL已配制好的葡萄糖標品，用蒸餾水補足至2.0 mL，加入1.5 mL DNS試劑，塞好試管，沸水浴加熱7 min，以空白樣品為參比，測定540 nm波長下的吸光值，繪制還原糖標準曲線（圖1），計算出一元線性回歸方程。還原糖標準曲線為y=4.7235x-0.030 5，其中x為葡萄糖濃度，y為吸光度，相關系數R2=0.993 0。

圖1　還原糖標準曲線Fig.1　The standard curve of reducing-sugar

精確稱取烘焙咖啡樣品0.2 g置于20 mL容量瓶中，用蒸餾水定容至刻度，置于50℃水浴鍋中加熱40 min，不定時搖勻，水浴結束后趁熱過濾得到浸提液。取待測液及空白對照各2 mL于25 mL具塞試管中，加入1.5 mL DNS顯色劑，塞好試管，沸水浴7 min之后冷卻。測定540 nm波長下的吸光值，根據標準曲線的線性方程計算出烘焙咖啡樣品中還原糖的含量，整個試驗的操作時間控制在2 h之內。

1.2.4烘焙咖啡綠原酸含量的測定

精確稱量20 mg色譜純的綠原酸標準品，用蒸餾水定容至50 mL，取上述溶液1 mL定容至25 mL，配制成綠原酸標準溶液。依次精確稱取標準溶液0.1、0.2、0.3、0.4、0.6、0.8、1.0 mL，用蒸餾水補足至1.0 mL。測定330 nm波長下的吸光值。繪制出綠原酸標準曲線，計算出一元線性回歸方程。得到綠原酸標準曲線為y= 0.703 4x-0.005 0（圖2），其中x為綠原酸標品含量，y為吸光度，相關系數R2=0.999 7。

圖2 綠原酸標準曲線Fig.2　The standard curve of chlorogenic acid

精確稱取2.0 g烘焙咖啡樣品和0.4 g β-環糊精于具塞三角瓶中，加入30 mL蒸餾水混合均勻，置于70℃恒溫水浴鍋中水浴30 min之后取出，過濾后將濾液在4 000 r/min轉速下離心5 min，取上清液備用。取1mL上清液置于50 mL容量瓶中，用蒸餾水定容至刻度。測定330 nm波長下的吸光值，測定前將樣品稀釋10倍，根據標準曲線的線性方程計算出烘焙咖啡樣品中綠原酸的含量。

1.2.5烘焙咖啡咖啡因和葫蘆巴堿含量的測定

反相HPLC測定烘焙咖啡樣品中咖啡因和葫蘆巴堿的含量，分離柱為Agilent Eclipse XDB-C18，5 μm，4.6 mm×250 mm。流動相為磷酸緩沖液（20 mmol/L，pH 4.3）∶乙腈=9∶1，流動相速度為1 mL/min，柱溫設置為25℃，進樣量20 μL，檢測波長254 nm。

咖啡因和葫蘆巴堿標準曲線的測定：準確稱取20 mg色譜純的咖啡因和葫蘆巴堿標準品，用蒸餾水溶解于25 mL容量瓶中。取上述溶液0.05、0.1、0.2、0.4、0.6、0.8、1 mL置于1.5 mL離心管中，用蒸餾水補足至 1 mL，所得濃度依次為0.04、0.08、0.16、0.32、0.48、0.64、0.80 mg/mL，用0.45 μm無機相濾頭過濾。使用反相HPLC方法測定烘焙咖啡樣品中咖啡因和葫蘆巴堿含量。得到葫蘆巴堿標準曲線為y=13 468x+ 1.355 7（圖3），其中x為葫蘆巴堿標品含量，y為峰面積，相關系數R2=0.999 9。咖啡因標準曲線為y= 74 974x+74.575（圖4），其中x為咖啡因標品含量，y為峰面積，相關系數R2=0.999 8。

圖3　葫蘆巴堿標準曲線Fig.3　The standard curve of trigonelline

圖4 咖啡因標準曲線Fig.4　The standard curve of caffeine

烘焙咖啡樣品中咖啡因和葫蘆巴堿含量的測定方法：精確稱取研磨好的烘焙咖啡樣品1.0 g，同時稱取4.5 g氧化鎂，將兩者混勻于100 mL水中，90℃水浴加熱20 min，水浴過程中不停攪拌。冷卻后將體積補足，過濾后稀釋5倍，用0.45 μm的無機濾頭過濾。根據標準曲線的線性方程計算出烘焙咖啡樣品中咖啡因和葫蘆巴堿的含量。

1.2.6咖啡豆的烘焙工藝

準確稱取100 g咖啡豆，置于咖啡烘焙機中進行烘焙。初始溫度150℃，之后以5℃/min的速度進行梯度升溫，當溫度達到250℃時恒溫烘焙5 min。烘焙結束后粉碎，置于低溫避光環境下保存以備用。

1.2.7酶種類對酶解咖啡鮮果飲用品質和化學成分的影響

稱取50 g剝去外果皮的云南小粒咖啡鮮果置于4號自封袋中，按0.5%酶添加量分別將糖化酶（pH 5.0，酶解溫度55℃）、果膠酶（pH 4.0，酶解溫度55℃）、α-淀粉酶（pH 6.0，酶解溫度50℃）、纖維素酶（pH 4.5，酶解溫度50℃）、胃蛋白酶（pH 1.6，酶解溫度55℃）和胰蛋白酶（pH 7.5，酶解溫度55℃）充分溶解于無菌水后倒入自封袋中，按袋中液體總量占鮮果20%的比例補足無菌水，混勻密封后將自封袋置于對應酶解溫度的水浴鍋中酶解2 h。酶解結束后將鮮果取出用無菌水迅速沖洗干凈，置于70℃烘箱中進行干燥，待其恒重后脫去外殼進行烘焙，研磨以備杯測評分及化學成分的測定。

1.2.8胃蛋白酶酶解咖啡鮮果的條件優化

稱取50 g剝去外果皮的云南小粒咖啡鮮果置于4號自封袋中，分別按0.0%、0.5%、1.0%和5.0%添加量將胃蛋白酶充分溶解于無菌水后倒入自封袋中，按袋中液體總量占鮮果20%的比例補足無菌水，在pH 1.6，酶解溫度55℃的條件下進行酶解，分別在酶解2、4、6、8 h時取出部分自封袋，酶解結束后將咖啡鮮果用無菌水迅速沖洗干凈，置于70℃烘箱中進行干燥，待其恒重后取出脫去外殼進行烘焙，研磨以備杯測評分及化學成分的測定。

1.3數據分析

試驗數據使用Excel進行整理，使用Spss 21.0對試驗數據進行單因素方差分析和Pearson相關性統計分析。

2　結果與討論

2.1酶種類對酶解咖啡鮮果烘焙后飲用品質和化學成分的影響

不同酶種類對酶解咖啡鮮果烘焙后飲用品質的影響見圖5。

圖5　不同酶種類對酶解咖啡鮮果烘焙后飲用品質的影響Fig.5　Cupping score of fresh fruit by different enzyme hydrolysis

從圖5中可以看出，胰蛋白酶和胃蛋白酶對于酶解咖啡鮮果杯測品質的提高效果較其他酶更明顯，其中胃蛋白酶的提升作用最大，酶解后的烘焙咖啡感官評分為12.2分。較未經酶解的空白樣品提高1.03倍。胰蛋白酶酶解咖啡鮮果的烘焙后感官評分為10.1分。較未經酶解的空白樣品提高0.68倍。α-淀粉酶對于酶解咖啡鮮果的烘焙后感官評分沒有顯著提高。果膠酶酶解咖啡鮮果的烘焙后感官評分為7.2分，較胃蛋白酶和胰蛋白酶的提高效果差，說明果膠酶對于咖啡鮮果內部果膠層的水解作用并沒有使得咖啡飲用品質得到較大提升。糖化酶酶解咖啡鮮果的烘焙后感官評分為8.3分，較未經酶解處理的云南小粒咖啡鮮果提高38.3%。纖維素酶酶解咖啡鮮果的烘焙后感官評分為8.1分，較未經酶解處理的云南小粒咖啡鮮果提高35.0%。說明利用蛋白酶類對咖啡鮮果進行水解使得內部蛋白質的成分得到調整，從而獲得較其他酶種類水解咖啡鮮果效果更好的飲用品質。

不同酶種類酶解咖啡鮮果的烘焙后感官評分細則見圖6。

圖6　不同酶種類酶解咖啡鮮果的烘焙后感官評分細則表Fig.6　Detailed scores of fresh fruits by different enzymes hydrolysis

結果表明，感官評分最高的胃蛋白酶細則評分中，苦味、酸味、香味、余味、順滑感和醇厚感評分也為最高值。感官評分為8.3分的糖化酶處理樣品的果味和糊味評分均為最高值1.4分和1.5分。感官評分為7.2分的果膠酶處理樣品的甜味評分為最高值1.4分。糖化酶、果膠酶、α-淀粉酶和纖維素酶酶解咖啡鮮果較空白樣品的苦味評分降低，而這四種酶酶解后的咖啡鮮果感官評分總分也相對較低，說明苦味評分直接影響烘焙咖啡的感官評分總分。酶解處理后咖啡鮮果的酸味、香味、順滑感和醇厚感評分較空白樣品均有所提高，說明酶水解有助于咖啡果酸物質的生成與芳香物質的釋放，最終提高烘焙咖啡的整體風味。

不同酶種類酶解咖啡鮮果的烘焙后化學成分表見表2。

表2　不同酶種類酶解咖啡鮮果的烘焙后咖啡化學成分表Table 2　Chemical compositions of fermentated fresh fruits after hydrolysis with different enzymes g/100 g

從表2中可以看出，感官評分最高的胃蛋白酶處理后蛋白質含量為最低值13.403 g/100 g，胰蛋白酶處理后蛋白質含量為15.786 g/100 g，未經酶解處理的空白樣品蛋白質含量為23.023 g/100 g。胃蛋白酶處理能夠將云南小粒咖啡鮮果蛋白質含量降低41.8%，胰蛋白酶處理能夠降低31.4%。說明蛋白質含量的降低提升了烘焙咖啡飲用品質。此外，酶解處理降低了云南小粒咖啡鮮果的還原糖含量，其中胃蛋白酶與胰蛋白酶處理樣品的還原糖降低率分別為8.3%和11.9%。酶解處理使得咖啡鮮果葫蘆巴堿含量下降，胃蛋白酶酶解樣品的葫蘆巴堿含量降低率為44.7%。

2.2酶解時間和酶添加量對胃蛋白酶酶解咖啡鮮果烘焙后飲用品質和化學成分影響

胃蛋白酶不同酶解時間和酶添加量酶解對云南小粒咖啡鮮果飲用品質的影響見圖7。

結果表明，酶添加量為0.5%和1.0%的感官評分隨著酶解時間的增加呈現先上升后下降的趨勢，當酶解時間為2 h時，1.0%添加量的酶解效果最佳，感官評分為13.5分，較未經酶解的空白樣品提高1.25倍。當酶解時間為4 h時，0.1%添加量的酶解效果達到峰值12.5分，較未經酶解的空白樣品提高1.08倍。當酶解時間為6 h時，5.0%添加量的酶解后感官評分隨著酶解時間的增加由6.0分提高到9.1分。但5.0%添加量的酶解效果整體低于前三個濃度，說明酶添加量過高可能導致咖啡鮮果中蛋白質發生過度水解，致使烘焙過程中生成芳香風味物質的底物減少，最終導致烘焙后感官評分較低。

胃蛋白酶不同酶解時間和酶添加量酶解云南小粒咖啡鮮果的感官評分細則見表3。

圖7　胃蛋白酶不同酶解時間和酶添加量對酶解云南小粒咖啡鮮果飲用品質的影響Fig.7　Cupping score of fresh fruit by pepsin hydrolysis in time and add amount

表3　胃蛋白酶不同酶解時間和酶添加量酶解咖啡鮮果的評分細則表Table 3　Detailed scores of fresh fruits by pepsin hydrolysis in time and add amount

由表3可知，感官評分最高的胃蛋白酶細則評分中，苦味、酸味、香味、余味、順滑感和醇厚感評分也為最高值。感官評分為8.3分的1.0%酶添加量和4 h酶解時間處理樣品的果味評分為最高值1.1分。感官評分為12.5分的0.1%酶添加量和4 h酶解時間處理樣品的糊味和甜味評分均為最高值1.7分。隨著酶添加量的增加，咖啡鮮果烘焙后苦味評分整體呈現下降的趨勢。可能是由于較高酶添加量導致苦味肽的產生被抑制，或高濃度水解物在烘焙過程中與其他化學物質發生反應，減弱了杯測過程中的苦味感知。

胃蛋白酶不同酶解時間和酶添加量對酶解云南小粒咖啡鮮果烘焙后化學成分的影響見表4。

表4　胃蛋白酶不同酶解時間和酶添加量對酶解云南小粒咖啡鮮果烘焙后化學成分的影響Table 4　Chemical compositions of fermented fresh fruits by pepsin hydrolysis in time and add amount

結果表明，感官評分最高的1%酶添加量酶解2 h處理樣品蛋白質含量為最低值12.425 g/100 g，較未經酶解處理的空白樣品降低46.0%。1.0%酶添加量酶解8 h處理樣品蛋白質含量為最高值21.932 g/100 g，較未經酶解處理的空白樣品降低47.4%。隨著酶添加量的增加，酶解咖啡鮮果的還原糖含量整體呈現下降的趨勢。說明酶添加量的增加可能導致烘焙過程中還原糖的消耗增大，而當還原糖消耗到一定程度，感官評分出現下降的趨勢。

2.3酶解咖啡鮮果烘焙后感官評分與化學成分的關系

使用SPSS 21.0對不同酶種類酶解云南小粒咖啡鮮果的烘焙后感官評分與化學成分進行Pearson相關性分析，結果見表5。

表5　酶解咖啡鮮果的Pearson相關性分析Table 5　Pearson correlation analysis of fresh fruits by hydrolysis

從表5中可以看出，酶解處理后咖啡鮮果烘焙后感官評分與蛋白質含量呈顯著負相關，相關系數為0.858。與咖啡因、綠原酸、還原糖和葫蘆巴堿含量無顯著相關性。說明烘焙后飲用品質會隨著烘焙過程中蛋白質含量的減少而提高。評分細則中苦味、酸味、香味、余味、糊味、順滑感和醇厚感評分與蛋白質含量呈負相關。說明烘焙過程中蛋白質含量的減少量越大，烘焙咖啡整體風味的比例越趨向平衡。香味、順滑感、醇厚感評分與葫蘆巴堿含量均呈負相關，較高的咖啡因含量會產生豐富的余味、濃重的糊味和愉悅的順滑感。

3　結論

研究中選用了不同種類的酶對云南小粒咖啡鮮果進行酶解處理，確定胃蛋白酶對咖啡鮮果的品質作用較大，然后對胃蛋白酶的酶解條件進行了優化，確定了最佳酶解條件為胃蛋白酶添加量1%，酶解2 h，此時感官評價結果為13.5分，高出未處理咖啡鮮果的感官評價結果1倍。

通過相關性分析研究酶解處理咖啡豆烘焙后感官評分與化學成分的相關性，得到酶解處理云南小粒咖啡鮮果烘焙后感官評分與蛋白質含量呈顯著負相關，相關系數為0.858。烘焙過程中蛋白質含量的減少量越大，烘焙咖啡整體風味的比例越趨向平衡。香味、順滑感、醇厚感評分與葫蘆巴堿含量均呈負相關，較高的咖啡因含量會產生豐富的余味、濃重的糊味和愉悅的順滑感。

［1］Massimo S R，M A Sanromán.Application of solid-state fermentation to food industry-a review［J］.Journal of Food Engineering，2006，76（3）：291-302

［2］Vandenberghe L P S，Soccol C R，Pandey A，et al.Citric acid production by Aspergillus niger in solid state fermentation［J］.Microbial Technology for Sustainable Development and Productivity，Jabalpur，India，November 1998，2002：227-231

［3］Mun H A，Lum N A，Cruz A S D.Bacteria responsible for mucilagelayer decomposition in Kona coffee cherries［J］.Applied microbiology，1965，13（2）：201-207

Conditions Optimization of Enzymolysis on Coffee Fruit and the Impact Study on Coffee Drinking Quality and Chemical Composition

TONG Shi-sheng1，WANG Li1，JIN Jing-yan2，CUI Zhong-yi2，LIU Ping1，*
（1.Department of Biological Medicine，Beijing City University，Beijing 100083，China；2.College of Food Science and Nutritional Engineering，China Agricultural University，Beijing 100083，China）

This paper determined that the best enzyme to processing civet coffee is pepsin，then optimized the coffee fruit pepsin enzymatic hydrolysis conditions，determined the optimum of adding 1%topepsin，enzymatic hydrolysis 2 h，enzymolysis temperature of 55℃，at these conditions the sensory score was 13.5 points，higher than the untreated coffee fruit sensory evaluation results of 1 times.At the same time，study on the effect of enzymatic hydrolysis on the main chemical components in fresh fruit and coffee，drinking coffee fruit quality of baking after effect was investigation.

coffee fruit；enzymolysis；correlation analysis；coffee arabica in Yunnan province

10.3969/j.issn.1005-6521.2016.10.013

佟世生（1970—），男（漢），副教授，博士，研究方向：食品科學、農產品貯藏加工。
*

劉萍（1970—），女（滿），副教授，博士，研究方向：發酵工程、生物制藥。

2015-04-14