枸杞多糖的超聲波輔助提取法及其抗氧化研究

楊新生，姜忠麗（沈陽師范大學，遼寧沈陽110034）

枸杞多糖的超聲波輔助提取法及其抗氧化研究

楊新生，姜忠麗*
（沈陽師范大學，遼寧沈陽110034）

以枸杞為原料，考察超聲波輔助提取中的料液比、時間、溫度對枸杞多糖得率的影響，并采用響應面優化。枸杞多糖超聲波輔助提取的最佳工藝條件：料液比為1∶20（g/mL），溫度為70℃，提取時間20 min，理論枸杞多糖得率為3.37%，實際枸杞多糖得率為3.35%，近似率達到99.4%。枸杞多糖總抗氧化性達到10.44 U/mL，結果表明：枸杞多糖具有抗氧化作用。

枸杞多糖；超聲波輔助提取；響應面優化；總抗氧化作用

枸杞一種茄科植物，已有研究證實枸杞多糖具有一定的抗衰老、抗腫瘤、降血脂、保肝和增強免疫力等生理功能［1］。枸杞總多糖是一些單糖或蛋白質、肽構成的復合多糖為主，還含有聚合糖同肽復合的多糖。復合多糖糖鏈是分枝結構，肽鏈上氨基酸含量占總的5%～30%。枸杞多糖的分子量較大，曾有人分離某4種枸杞多糖，其分子量大致在0.8×104Da～6.6×104Da間［2］。枸杞多糖的提取方法也有多種，最常用的是水提法［3-6］，黃文書、郝金玉等用微波法提取［7-8］，梁敏等［9］利用木瓜蛋白酶提取枸杞多糖，酶在一定條件下分解植物組織，加速糖提取，超聲波輔助提取具有空化作用和次級效應，改變枸杞細胞壁和膜，提高枸杞多糖得率［10］。本試驗采用超聲波輔助提取枸杞多糖，并用響應面優化方法，采用苯酚-濃硫酸檢測多糖，以期為枸杞多糖的利用提供理論參考。

1　材料與設備

1.1材料與試劑

枸杞：市售，產于寧夏中寧，均購自北京華聯超市，樣品顆粒飽滿，色澤正常，原料采集后將其裝入自封袋置于冰箱冷藏。

試驗所用試劑均為分析純；總抗氧化值測定試劑盒：購于南京建成生物研究所。

1.2儀器與設備

J014-2型電子分析天平：瑞士梅特勒托利多公司；72光柵分光光度計：上海第三分析儀器廠；RE-52AA型旋轉蒸發器：上海亞榮生儀器廠；SB 25-12 DTDN型超聲清洗儀：寧波新芝生物科技有限公司；SC-3610型離心機：安徽中科中佳科學儀器有限公司；DGG-914OBD型電熱恒溫鼓風干燥器：上海森信實驗儀器有限公司。

1.3方法

1.3.1枸杞預處理

枸杞置于60℃真空干燥箱中，真空烘干后放入干燥器中24 h，取適量研碎后置圓底燒瓶中，加氯仿：甲醇（體積比為2∶1）20 mL/次，60℃下回流脫脂2次，每次2 h，濾出溶劑，殘渣風干，殘渣即為經過處理的枸杞。

1.3.2枸杞多糖的提取［11-12］

1.3.2.1枸杞多糖提取工藝流程

枸杞破碎烘干→提取→抽濾→濃縮→無水乙醇沉淀→二次沉淀→95%乙醇、丙酮、乙醚反復洗滌→干燥→粗多糖

1.3.2.2枸杞多糖超聲波輔助提取單因素試驗

料液比、提取時間、提取溫度作為考察因素，枸杞多糖得率為進行單因素試驗的指標。

1）料液比對枸杞多糖得率的影響

稱取等量已破碎烘干的枸杞，分別放入已編好號的錐形瓶中，料液比分別為1∶10、1∶15、1∶20、1∶25（g/mL），60℃溫度下提取20 min，脫脂棉過濾，重復提取2次，測定吸光值，由枸杞多糖得率來確定超聲提取的料液比。

2）提取時間對枸杞多糖得率的影響

稱取等量已破碎烘干的枸杞，分別放入已編好號的錐形瓶中，料液比定為1∶20（g/mL），60℃溫度下超聲提取5、10、20、30 min，提取2次，測定吸光值，由枸杞多糖得率來確定提取時間。

3）提取溫度對枸杞多糖得率的影響

稱取等量已破碎烘干的枸杞，分別放入已編好號的錐形瓶中，料液比定為1∶20（g/mL），分別在40、50、60、70℃溫度下，提取2次，每次20 min，測定吸光值，由枸杞多糖得率來確定提取溫度。

1.3.3多糖純化［13］

先用10%三氯乙酸去除蛋白質沉淀，濃縮，在用95%乙醇、無水乙醇、丙酮、乙醚進行多次洗滌，直至溶液顏色由黃色近無色。再于60℃干燥，得粗多糖，再將粗多糖熱水溶解，脫脂棉過濾［14］，棄去沉淀，進一步重復上述洗滌過程直至顏色近為無色，干燥，得到枸杞多糖。

1.3.4多糖的檢測：苯酚-濃硫酸［15］

標準曲線溶液的配制。準確稱量50 mg干燥至恒重葡萄糖，加適量水溶解，轉移至50 mL容量瓶中，加水至刻度，搖勻，配成濃度1 mg/mL的葡萄糖溶液。然后按著表1依次添加標準葡萄糖液、蒸餾水、5%苯酚溶液、濃硫酸，充分搖勻，沸水浴中30 min，冷卻后于490 nm處測定吸光度，繪制標準曲線。

表1　苯酚-硫酸法各溶劑添加量及濃度Table 1　The amount and concentration of each solvent of phenol sulfuric acid method

1.3.5枸杞多糖得率的計算公式

1.3.6總抗氧化性

按南京建成試劑盒說明書進行測定。配制好各試劑，按說明書加入各試劑，混勻，放置10 min，用蒸餾水調零，于1 cm光徑下，測各管520 nm下吸光度。混勻，放置10 min，雙蒸水調零1 cm半徑，520 nm測各管吸光度總抗氧化性的定義，在37℃時，每分鐘每毫升樣品使反應體系吸光度（OD）值，每增加0.01時，為一個總抗氧化能力單位。

其中：N為反應體系稀釋倍數；n為樣品測試前稀釋倍數。

2　超聲波輔助提取枸杞多糖的方法分析

2.1超聲波輔助提取枸杞多糖單因素試驗

2.1.1料液比對枸杞多糖得率的影響

料液比分別為1∶10、1∶15、1∶20、1∶25（g/mL），60℃溫度下提取20 min，重復提取2次，料液比對枸杞多糖得率的影響如圖1所示。

圖1　料液比對枸杞多糖得率的影響Fig.1　Effect of solid-liquid ratio on the yield of lycium barbarum polysaccharide

由圖1可以看出，一定料液比范圍下，枸杞多糖得率隨料液比增大而呈上升趨勢，料液比為1∶20（g/mL），最高，再減小料液比，得率有所下降。因此，最優料液比條件應為1∶20（g/mL）。

2.1.2時間對枸杞多糖得率的影響

料液比定為1∶20（g/mL），60℃溫度下超聲波輔助提取5、10、20、30 min，提取2次，時間對枸杞多糖得率的影響如圖2所示。

圖2 時間對枸杞多糖得率的影響Fig.2　Effect of time on the yield of lycium barbarum polysaccharide

由圖2可以看出，枸杞多糖的得率隨著時間的延長而上升，并在20 min時達到最大。此后，隨時間延長得率反而下降，20 min為較好的時間，得率最高。

2.1.3提取溫度對枸杞多糖得率的影響

料液比定為1∶20（g/mL），分別在40、50、60、70℃溫度下，提取2次，每次20 min，提取溫度對枸杞多糖得率的影響如圖3所示。

圖3　提取溫度對枸杞多糖得率的影響Fig.3　Effect of extraction temperature on the yield of lycium barbarum polysaccharide

由圖3所示，隨溫度的升高，得率緩慢上升，60℃達到最高，此后，隨溫度的升高，略有下降，因此，60℃條件最適宜，得率最高。

2.2響應面法對枸杞多糖超聲波提取工藝的優化

根據二次正交旋轉組合試驗的中心組合設計原理，綜合上述試驗結果，選取提取時間、料液比、提取溫度的3個主要因素為自變量，采用三因素的響應面分析方法優化工藝。設計中心組合試驗因素水平編碼，如表2所示。根據表2，設計枸杞多糖得率響應面試驗，并測定料液比、提取時間、提取溫度等指標，試驗結果見表3。

表2　中心組合試驗因素水平編碼表Table 2　Central composite test factors level encoding table

表3 枸杞多糖的得率響應面數據Table 3　Response surface data of the yield of lycium barbarum polysaccharide

續表3　枸杞多糖的得率響應面數據Continue table 3　Response surface data of the yield of lycium barbarum polysaccharide

計算得率指標回歸方程的方差分析和提取各因素對得率顯著性分析，見表4。

表4 得率回歸方程方差分析Table 4　Variance analysis of regression equation

利用Design-Expert 8.0.6軟件分析數據，建立關于得率的二階響應模型，從而找到最優響應因子水平。得到響應值Y1（得率）和各因子（A、B、C）之間的回歸擬合方程：Y1=3.29+0.325A-0.038B+0.080C-0.012AB+2.50×10-3AC-2.500×10-3BC-0.16A2-0.28B2-1.75×10-3C2。回歸方程的相關系數R2=0.920 5，離回歸標準差=0.818 2。從表4可以看出，回歸模型中F=9，“Pr＞F”=0.004 2＜0.05，表明得到的回歸方程擬合程度較好，回歸效果顯著，而失擬項P=0.776 1＞0.05，說明回歸方程差異性不顯著。因此，應用此方程來模擬指標值與因素的關系是可行的。

圖4　料液比和時間對枸杞多糖得率影響的響應面立體分析圖及其相應等高線圖Fig.4　Effect of solid-liquid ratio and time on the yield of lycium barbarum polysaccharide from three dimensional analysis diagram of response surface and its corresponding contour lines

圖5　溫度和時間對枸杞多糖得率影響的響應面立體分析圖及其相應的等高線Fig.5　Effect of temperature and time on the yield of the lycium barbarum polysaccharide from three dimensional analysis diagram of response surface and its corresponding contour lines

將提取提時間、料液比、提取溫度3個參數分別固定，得率隨剩余兩個參數的變化趨勢如圖4～圖6所示。

從圖4中可看出，料液比和時間對容重的影響程度相近。從圖5中可看出，溫度的影響程度大于料液比，隨著溫度的增加，得率增加，隨著時間的增加，得率先緩慢上升再下降。從圖6中可以看出，隨著溫度增加，得率增加；隨著料液比的升高，得率先緩慢升高再下降。

根據Design-Expert 8.0.6軟件分析得到超聲波輔助提取的最優條件如下：時間20.59 min，料液比為1∶20（g/mL），溫度為70℃，得率3.37%。通過這最優條件，做驗證試驗，得到枸杞多糖得率為3.35%，與3.37%極為近似，因此，最終確定試驗的最佳工藝條件為溫度70℃，時間為20 min，料液比1∶20（g/mL）。

2.3枸杞多糖的總抗氧化性研究

枸杞多糖的總抗氧化能力見圖7。

圖6　溫度和料液比對枸杞多糖得率影響的響應面立體分析圖及其相應的等高線Fig.6　Effect of temperature and solid-liquid ratio on the yield of lycium barbarum polysaccharide from three dimensional analysis diagram of response surface and its corresponding contour lines

圖7 枸杞多糖的總抗氧化能力Fig.7　Total antioxidant capacity of lycium barbarum polysaccharide

根據圖7可以看出枸杞多糖總抗氧化能力是隨枸杞多糖濃度的增大而增強，當枸杞多糖濃度為2 mg/mL時，總抗氧化能力為10.44U/mL。從而，說明枸杞多糖抗氧化能力較強。

3　結論

1）超聲提取枸杞多糖的最佳工藝條件：料液比1∶20（g/mL），提取溫度為70℃，提取時間為20 min，枸杞多糖得率為3.35%。

2）枸杞多糖的總抗氧化能力測定，得到濃度為2 mg/mL時，枸杞多糖總抗氧化能力為10.44 U/mL。

［1］鄭寶東，鄭寶貴，曾紹校.果蔬多糖的研究現狀及應用前景［J］.食品科學，2003，24（1）：152-155

［2］馮婷，何聰芬，趙華，等.植物多糖研究概況［J］.北京工商大學學報（自然科學版），2004（9）：1-4

［3］丁剛強.食品多糖含量不同測定方法的研究［J］.實用預防醫學，2000，7（5）：325-327

［4］黃森.Box-Behnken法優化提取霍山石斛活性多糖的研究［J］.中藥材，2007，30（5）：591-594

［5］何照范.保健食品化學及其檢測技術［M］.北京：中國輕工業出版社，1998

［6］中華人民共和國農業部.NY/T 1676-2008食用菌中粗多糖含量的測定［S］.北京：中國農業出版社，2008：1-3

［7］黃文書，馮作山，李煥榮.微波法提取枸杞多糖工藝研究［J］.中國食物與營養，2007（8）：44-46

［8］郝金玉，黃若華，王平艷.微波萃取技術進展［J］.云南化工，1999（3）：26-29

［9］梁敏，鄒東恢，郭建華.酶法提取枸杞多糖工藝研究［J］.糧油加工，2010（3）：104-106

［10］李軍生，何仁，伍時華，等.超聲波處理對提取南瓜多糖提取率的影響［J］.農業科技通訊，2003（9）：33-34.

［11］黃德娟，徐曉輝.生物化學實驗教程［M］.上海：華東理工大學出版社，2007：86-89

［12］洪楠，侯軍.MINI TAB統計分析教程［M］.北京：電子工業出版社，2007：237-244

［13］李知敏，王伯初，周菁，等.植物多糖提取液的幾種脫蛋白方法的比較分析［J］.重慶大學學報（自然科學版），2004，27（8）：57-59

［14］李艷，孫萍，魯建疆，等.疆黑枸杞多糖的提取及含量測定［J］.數理醫藥學雜志，2001，14（2）：164-165

［15］高春燕，田呈瑞，李蘊成，等.枸杞多糖酶法提取及其對油脂的抗氧化性能研究［J］.食品研究與開發，2007，28（4）：80-82

［16］Kaur G，Jabbar Z，Alam M S，et al.Punica granatum（pomegranate）flower extract possesses potent antioxidant activity and abrogates Fe-NTA induced hepatotoxicity in mice［J］.Food and Chemical Toxicology，2006，44（7）：984-993

［17］孟良玉，邱松山，蘭桃芳，等.枸杞多糖的超聲提取工藝優化及其抗氧化能力研究［J］.安徽農業科學，2009，37（25）：12168-12170

［18］GAN L，ZHANG S H，YANG X L，et al.Immunomodulation and antitumor activity by a polysaccharide protein complex from Lycium barbarum［J］.Int Immunophammacol，2004（4）：563-569

LBP Ultrasonic-assisted Extraction Method and Its Antioxidant Activity

YANG Xin-sheng，JIANG Zhong-li*
（Shenyang Normal University，Shenyang 110034，Liaoning，China）

With lycium chinense as raw materials，studied the ultrasonic-assisted extraction of solid to liquid ratio，time，temperature effect on the yield of lycium barbarum polysaccharides，and the response surface optimization.The optimum technological conditions for ultrasonic-assisted extraction of lycium barbarum polysaccharides were that solid-quid ratio was 1∶20（g/mL），the temperature was 70℃，extraction time was 20 min. The theory of lycium barbarum polysaccharide was 3.37%，the actual yield of lycium barbarum polysaccharide was 3.35%，the approximate rate reached 99.4%.The total antioxidant activity of lycium barbarum polysaccharide reaches 10.44 U/mL，the results showed that，lycium barbarum polysaccharides had anti-oxidative effect.

lycium barbarum polysaccharides；ultrasonic-assisted extraction；response surface optimization；total oxidative effect

10.3969/j.issn.1005-6521.2016.10.019

楊新生（1992—），女（漢），碩士研究生，研究方向：糧油深加工。
*

姜忠麗（1968—），女（漢），副教授，研究方向：食品質量控制及食品營養。

2015-04-20